Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp (panax bipinnatifidius seem) thu hái ở sa pa, lào cai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỖ VĂN HÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDIUS SEEM) THU HÁI Ở SA PA, LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC ĐỖ VĂN HÀO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY SÂM VŨ DIỆP (PANAX BIPINNATIFIDIUS SEEM) THU HÁI Ở SA PA, LÀO CAI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2012 NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo tâm huyết, nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến TS. Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, người đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Y Dược nói chung và Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc nói riêng đã truyền đạt cho em nền tảng kiến thức chuyên môn và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân đã luôn quan tâm, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này.Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu em khó tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 8 tháng 6 năm 2017 Sinh viên Đỗ Văn Hào DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 1 C-NMR H-NMR : Carbon (13) Nuclear magnetic resonance : Proton nuclear magnetic resonance C : Chuẩn DĐVN IV : Dược điển Việt Nam IV ĐT : Định tính HPLC : High Performance Liquid Chromatography IR : Infrared MS : Mass spectrum NMR : Nuclear magetic resonance PĐ : phân đoạn SKLM : sắc ký lớp mỏng SVD : Sâm vũ diệp T : Thử TT : thứ tự UV : Ultra violete VIS : visible DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1. Hợp chất saponin khung oleanane từ rễ của cây sâm vũ diệp 8 Hình 2. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 16 Hình 3. Mẫu sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sapa, Lào 21 dvv Cai Hình 4. Sắc ký đồ pha đảo của cao tổng (T), phân đoạn butanol (Bu) với hệ d D MeOH-H2O (1:1) và MeOH-H2O (2:1) Hình 5. Sắc ký đồ pha thường của cao tổng (T), phân đoạn butanol (Bu) với f 25 26 hệ CHCl3-MeOH-H2O (70:30:0,4) và CHCl3-MeOH-H2O (60:30:0,5) Hình 6. Sơ đồ chiết xuất Sâm vũ diệp 27 Hình 7. Sơ đồ phân lập sắc ký 3 hợp chất từ phân đoạn EtOAc 28 Hình 8. Cấu trúc hóa học của 3 hợp chất phân lập được từ Sâm Vũ Diệp 29 Hình 9. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Oleanolic acid 31 Hình 10. Sắc ký đồ dung dịch mẫu cao tổng ethanol SVD 32 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1. Phân bố của các loài thuộc chi Panax L 3 Bảng 2. Một số Saponin dẫn chất acid oleanolic thuộc chi Panax L 6 Bảng 3. Saponin khung dammaran 7 Bảng 4. kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong rễ ffff 24 H thân Sâm vũ diệp bằng phản ứng hóa học MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ ..........................................................................................................................................1 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN ..................................................................................................................3 1.1. Tổng quan về chi Panax L................................................................................... 3 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố của chi Panax L .....................................................................3 1.1.2. Đặc điểm họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae) ............................................................4 1.1.3. Đặc điểm thực vật của chi Panax L ..................................................................................4 1.1.4. Đối tượng nghiên cứu-Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem) ...................................5 1.2. Tổng quan các phương pháp nghiên cứu .......................................................... 9 1.2.1. Phương pháp định tính thành phần hóa học ......................................................................9 1.2.2. Các phương pháp sắc kí ................................................................................................. 12 1.2.3. Các phương pháp xác định cấu trúc ............................................................................... 18 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 21 2.2. Phương tiện nghiên cứu .................................................................................... 21 2.2.1. Thiết bị dụng cụ ............................................................................................................. 21 2.2.2. Dung môi, hóa chất ........................................................................................................ 22 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 22 2.3.1. Phương pháp phân tích định tính ................................................................................... 22 2.3.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu .................................................................................... 23 2.3.3. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất hóa học ............................................... 23 2.3.4. Phương pháp định cấu trúc hóa học các hợp chất .......................................................... 23 2.3.5. Phương pháp phân tích định tính và dấu vân tay sắc ký các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ...................................................................................................................... 23 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN ......................................................... 24 3.1. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong Sâm vũ diệp.................... 24 3.1.1. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất. .................................................................... 24 3.1.2. Phân tích định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng. ...................................................... 25 3.2. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn etyl acetat ............ 26 3.2.1. Chiết xuất và tinh chế các hợp chất............................................................................... 26 3.2.2. Tính chất vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập ............................................ 28 3.2.3. Biện giải cấu trúc 3 chất phân lập ................................................................................. 29 3.3. Phương pháp phân tích định tính và dấu vân tay sắc ký các hợp chất bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ............................................................................. 30 3.4. Bàn luận .............................................................................................................. 33 3.4.1. Về phân tích định tính .................................................................................................... 33 3.4.2. Về xử lý và chiết mẫu và phân lập chất tinh khiết. ........................................................ 33 3.4.3. Về xác định hợp chất phân lập ....................................................................................... 33 3.4.4. Về định tính và dấu vân tay sắc ký Oleanolic acid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ............................................................................................................................................. 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 35 KẾT LUẬN................................................................................................................. 35 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................................... 37 PHỤ LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay xu hướng điều trị bằng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên đặc biết là từ cây cỏ đang ngày càng tăng. Trước xu hướng đó, con người ngày càng chú trọng vào việc nghiên cứu, tìm kiếm, khai thác nguồn tài nguyên này. Việt Nam là vùng đất của nhiều loài thảo dược quý, trong đó có những cây thuốc được dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm nay như các loại nhân sâm, tam thất... Tuy nhiên, các thảo dược này từ bao đời nay vẫn chỉ được sử dụng trực tiếp hoặc chế biến thành nguyên liệu thô, do vậy chưa phát huy được hết công dụng. Một trong số đó phải kể đến cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem, họ Nhân sâm-Araliaceae), thuộc chi Panax L. Trong tự nhiên, sâm vũ diệp phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn Tây Bắc nước ta. Gần đây sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai. Theo kinh nghiệm dân gian, sâm vũ diệp là loài sâm quý có nhiều tác dụng sinh học, tuy nhiên đến nay vẫn chưa có nhiều tài liệu cụ thể nghiên cứu thành phần hóa học cũng như cơ chế tác dụng sinh học của sâm vũ diệp. Việc xây dựng bộ dữ liệu thành phần hóa học có vai trò quan trọng làm cơ sở cho các nghiên cứu liên quan như phân loại thực vật học, tiêu chuẩn hóa dược liệu, tác dụng sinh học....Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem) thu hái ở Tây Bắc”. Đề tài này là một phần trong đề tài cấp bộ “Ứng dụng các giải pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M.)” của Khoa Y Dược Đại Học Quốc Gia Hà Nội [6,14]. Mục tiêu của đề tài: Chiết tách và xác định một số thành phần hóa học thân rễ sâm vũ diệp. Để đạt được mục tiêu trên, đề tài được thực hiện với các nội dung sau: 1. Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học, và sắc ký lớp mỏng. 2. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp chất phân lập được. 1 3. Xây dựng dấu vân tay sắc ký Sâm vũ diệp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 2 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 . Tổng quan về chi Panax L 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố của chi Panax L Vị trí của chi Panax L. Trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (1987) [7]: Giới Thực vật (Planta) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae) Chi Panax L. Chi Panax L có khoảng 12 loài cây lâu năm và phát triển rất chậm, như sâm Triều Tiên (Panax ginseng), sâm Mỹ (Panax quinquefolius), sâm Nhật Bản (Panax japonicus),…[33]. Phân bố một số loài được tổng kết trong bảng sau: Bảng 1. Phân bố của các loài thuộc chi Panax L STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Loài Panax bipinnatifidus Seem Panax ginseng C.A.Mey Panax japonicus (T.Nees) C.A.Mey Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen Panax pseudoginseng Wall. Panax quinquefolius L Panax sokpayensis Shiva K.Sharma & Pandit Panax stipuleanatus Tsai & Feng Panax trifolius L Phân bố, vị trí Từ dãy Himalaya đến miền trung Trung Quốc, cũng tìm thấy ở Việt Nam Vùng Viễn đông Nga, Hàn Quốc, Đông bắc Trung Quốc Nhật Bản, Hàn Quốc Miền nam Trung Quốc và một số nơi ở Việt Nam Nê-pan Canada, Mỹ Vùng Sikkim - Ấn Độ Trung Quốc, Việt Nam Bắc Mỹ 3 10 11 12 Panax vietnamensis Ha & Grushv Panax wangianus S.C.Sun Panax zingiberensis C.Y.Wu & Feng Trung Quốc, Việt Nam Miền trung, nam Trung Quốc Vân Nam - Trung Quốc Ở Việt Nam, thuộc chi Panax L có các loài như Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.); Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.); Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng); Tam thất (Panax noto-ginseng Burk.)...[10]. 1.1.2. Đặc điểm họ Ngũ gia bì (Nhân sâm) (Araliaceae) Nhận biết tại thực địa: Lá thường kép, lớn, mọc so le, có bẹ; cụm hoa chùm–tán; bầu dưới; quả mọng [6,10]. Cây gỗ, bụi hay cây cỏ nhiều năm. Lá đơn hay kép, mọc so le, ít khi mọc đối hay mọc vòng. Lá kèm nhỏ. Hoa thường nhỏ, mọc thành cụm hoa tán đơn. Các tán đơn này lại tập hợp trong một cụm hoa kép kiểu chùm tán. Hoa đều, lưỡng tính, đôi khi đơn tính, mẫu 5. Đài 5, phần dưới dính lại, phần trên có 4-5 răng nhỏ. Tràng 5, rời tiền khai hoa vặn hay lợp. Nhị 5, dính với đĩa của bầu. Bộ nhụy có 5 noãn dính liền thành bầu dưới, ít khi là nửa dưới, vòi nhụy rời, số ô bằng số lá noãn, mỗi ô chứa một noãn. Quả mọng. Hạt có phôi nhỏ, nội nhũ nhiều . Đa dạng và sử dụng: Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, có cả ở vùng ôn đớn. Việt Nam có 22 chi, khoảng 120 loài, mọc hoang và được trồng làm cảnh, làm thuốc (Đinh lăng, Chân chim). Là họ có tầm quang trọng trong nền Y học cổ truyền cũng như trong nghành Dược hiện đại. Có 12 loài thường được dùng làm thuốc với các tên là Cuồng, Đinh lăng, Ngũ gia, Sâm, Tam thất, Thông thảo. 1.1.3. Đặc điểm thực vật của chi Panax L Cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ. Lá kép chân vịt, mọc vòng 3-5 lá, mép lá chét có răng cưa hoặc xẻ thùy lông chim. Cụm hoa tán đơn, hoa lưỡng tính có bầu dưới. Hoa có 5 lá đài hàn liền ở dưới, tràng 5, nhị 5. Bầu 2-3 có khi đến 5 ô. Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn [6]. 4 1.1.4. Đối tượng nghiên cứu-Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem) Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) vốn là một trong những dược liệu quý được sử dụng từ lâu đời. Ở Việt Nam, hiện có năm loài cây thuốc thuộc chi Panax, ba trong số đó là những loài bản địa mọc tự nhiên, gồm Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T. Tsai et K.M. Feng). So với hai đối tượng sâm Việt Nam (P. vietnamensis) và tam thất hoang (P. stipuleanatus) đã được nghiên cứu nhiều một cách có hệ thống từ thực vật học, thành phần hóa học, tác dụng sinh học... thì Sâm vũ diệp chưa có nhiều kết quả nghiên cứu về Sâm vũ diệp. a. Phân bố Trên thế giới, Sâm vũ diệp được tìm thấy ở Trung Quốc, bắc Myanma, đông bắc Ấn Độ và Nepal. Ở nước ta, sâm vũ diệp phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng Liên Sơn (thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu). Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên thế giới ( khoảng 23 độ vĩ Bắc) [3]. b. Tác dụng dược lý Khả năng bồi bổ sức khỏe và chữa bệnh độc đáo của loài dược liệu này đã khiến trong một thời gian dài chúng bị khai thác mạnh mẽ và thiếu quy hoạch. Hiện nay, số lượng và vùng phần bố loài dược liệu trên ở Việt Nam đã suy giảm nghiêm trọng. Dược liệu từ sâm vũ diệp là thân rễ. Chưa có các nghiên cứu cụ thể tác dụng của Sâm vũ diệp, nhưng các nghiên cứu về dược lý học của sâm Việt Nam (P. vietnamensis) có tác dụng: ngăn chặn ung thư gây bởi các tác nhân hoá học; tác dụng bảo vệ gan in vitro ở chuột; tác dụng giảm thời gian ngủ do thuốc pentobarbital và giảm tổn thương dạ dày ở chuột nhắt chịu stress tâm lý, cũng như có khả năng chống stress [3],…Vì vậy chúng ta có quyền kì vọng sâm vũ diệp sẽ mang lại nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe tương tự. c. Thành phần hóa học Theo các tài liệu đã nghiên cứu cho thấy Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong các loài thuộc thi Panax L.. Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định gần 300 saponin từ các loài thuộc chi này [31]. Sự phân loại dược trên cấu trúc 5 hóa học và chia làm các nhóm chính bao gồm: các saponin dẫn chất của 20(S)protopanaxadiol và 20(S)-protopanaxatriol, saponin khung dammaran khác, saponin dẫn chất ocotillol, saponin dẫn chất của acid oleanolic. Bảng 2. Một số Saponin dẫn chất acid oleanolic thuộc chi Panax L R1= R2=H=oleanolic acid STT Tên 1 Zingibrosid R1 2 Stipuleanosid R1 3 Stipuleanosid R2 R1 Glc A - Glc 2 Glc A3- Glc \ 4 -Ara(f) Glc A3- Glc \ 4 -Ara(f) 6 R1 H Loài P. zingiberensis [21] H P. stipuleanatus [23] Glc P. stipuleanatus [23] Bảng 3. Saponin khung dammaran STT Tên Loại 1 Majonosid F4 (A) Chikusetsusaponin 2 L (A) 9a Chikusetsusaponin 3 L (B) 9bc (B) 4 Ginsenosid M7cd 5 Chikusetsusaponin LT8 (C) H1 Glc H2 H H3 H H4 Glc H OH H H P. japonicus [29] H OH Glc H P.vietnamensis[20] H OH H Glc P. vietnamensis[20] Glc - - Glc P. japonicus [32] Loài P. vietnamensis[30] Ghi chú: Các loài sâm khác nhau có thành phần saponin khác nhau, ví dụ như Sâm Mỹ (Panax quinquefolium L.) hay sâm Triều Tiên (Panax ginseng C.A. Meyer) có nhiều thành phần khung dammaran. 7 Thành phần hóa học của lá và rễ cây sâm vũ diệp được phát hiện có nhiều saponin khung dammaran và oleanan. Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponins khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [28]. Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam-Hàn Quốc phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.), trong đó có 3 chất mới bifinoside A-C (1-3), là thành phần chính của rễ cây sâm vũ diệp được thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam [27]. Hình 1. Hợp chất saponin khung oleanane từ rễ của cây sâm vũ diệp [27] Như vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần của cây sâm vũ diệp. Liên quan đến tác dụng sinh học, một số hợp chất được xác định là thành phần của sâm vũ diệp có tác dụng sinh học bao gồm kháng viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, chống tiểu đường, bảo vệ tế bào thần kinh,…có thể 8 phần nào giải thích cho lợi ích về mặt dược học trong việc sử dụng sâm vũ diệp trong y học truyền thống [19]. Nhận xét chung: Một số nghiên cứu bước đầu chỉ ra rằng cây sâm vũ diệp chứa nhiều saponin khung olean với hàm lượng tương đối cao. Cho tới nay chưa có kết quả công bố một cách hệ thống thành phần các phân đoạn khác như phần dịch chiết hữu cơ ít phân cực hay phân đoạn polysaccharide tan trong nước. Đặc biệt chưa có công bố nào về hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý của đối tượng này. Do đó việc nghiên cứu một cách có hệ thống hóa thực vật và tác dụng sinh học để thu thập thêm bằng chứng khoa học và nâng cao hiệu quả sử dung sâm vũ diệp hứa hẹn nhiều kết quả có giá trị khoa học và thực tiễn. 1.2. Tổng quan các phương pháp nghiên cứu 1.2.1. Phương pháp định tính thành phần hóa học - Tiến hành: Định tính các nhóm chất thường gặp trong dược liệu theo phương pháp hóa học ghi trong sách Dược liệu và Thực tập dược liệu, nhà xuất bản y học [1,2] . a. Phương pháp định tính flavonoid - Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda hay Willstater) Đây là phản ứng khử hay được sử dụng để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid. Cho vào ống nghiệm 2-3 ml dịch chiết ethanol, thêm một ít bột Magnesi kim loại, nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt). Sau 1 đến 2 phút sẽ có màu đỏ cam, đỏ thẫm hoặc đỏ tươi với các dẫn chất flavon, flavonol, flavanonol, flavanon [8,9]. Phản ứng này dựa trên khả năng chống oxi hóa của flavonoid. Màu sắc đôi có thể bị thay đổi tùy theo loại, vị trí nhóm thế ví dụ các dẫn chất methoxy flavon thì âm tính [2,24]. - Tác dụng với FeCl3 Cho dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5%, lắc sẽ xuất hiện màu [8,9]. Tùy theo nhóm flavonoid và tùy theo số lượng nhóm OH trong phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu. Đa số các phân tử flavonoid đều có nhóm OH phenol, do đó nó có khả năng tạo phức màu với Fe3+ [2,24]. - Tác dụng của kiềm 9 Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết. Thêm vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sẽ thấy xuất hiện kết tủa màu vàng. Thêm 1 ml HCl, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ tăng lên [24]. b. Phương pháp định tính Saponin Dựa trên tính chất tạo bọt đây là tính chất đặc trưng nhất của saponin. Do phân tử saponin có tính chất hoạt động bề mặt, đặc tính này được giải thích bởi tính chất vừa thân dầu vừa thân nước của phân tử saponin. Phần aglycon có tính thân dầu còn phần đường có tính thân nước nên saponin có đặc tính làm giảm sức căng bề mặt và tạo bọt. Khả năng tạo bọt thay đổi theo cấu trúc của saponin: phần genin, số mạch đường, chiều dài mạch đường... nhờ đặc tính này mà saponin tạo bọt nhiều khi lắc với nước [2]. Dược liệu được chiết bằng cồn 70%, dịch chiết được bốc hơi trong dung môi và hòa tan lại trong một ít nước. Lấy dung dịch này cho vào ống nghiệm. Thêm nước cất, dùng ngón tay bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều. Dọc ống nghiệm trong 1 phút (=30 lần lắc). Quan sát lớp bọt trong 15 phút, nếu ống nghiệm còn bọt trên bề mặt chứng tỏ có saponin [24]. c. Phương pháp định tính tanin Phản ứng Braemer’s: đây là phản ứng kết tủa với kim loại, tanin cho tủa với các muối kim loại nặng như chì, thủy ngân, kẽm, sắt, đồng. Với muối sắt, các tanin khác nhau cho màu xanh lá hay xanh đen với độ đậm khác nhau. Có thể dựa vào tủa với muối sắt để xác định tanin trên vi phẫu [2]. Cách tiến hành: Cân 100mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10 ml ethanol, hòa tan. Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% . d. Phương pháp định tính Steroid Phản ứng Libermann-Burchardt hay dùng để phân biệt 2 loại saponin triterpenoid và saponin steroid. Lấy vài miligram sapogenin (phần aglycon của saponin) hòa nóng vào 1ml anhydride acetic, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc, nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơ – xanh lá, còn dẫn chất triterpenoid thì có màu hồng đến tía [1,2]. Cách tiến hành: Lấy 1ml dịch thử, thêm 1ml chloroform, thêm 2-3 ml anhydride acetic và 1-2 giọt acid sunfuric đặc. 10 e. Phương pháp định tính volatile oil Cách tiến hành: Lấy 2 ml dịch thử, thêm 0,1 ml dung dịch NaOH 5% và một lượng nhỏ dung dịch HCl 5%. Xuất hiện kết tủa trắng chứng tỏ trong thành phần dược liệu có chứa tinh dầu [24]. f. Phương pháp định tính Glycosid tim Phản ứng Keller-Kiliani: Đây là phản ứng dùng để định tính nhóm chất Glycosid tim, phản ứng dựa trên tính chất của phần đường. Mặt ngăn cách có màu đỏ hoặc nâu đỏ và dần dần sẽ thấy lớp trên có màu xanh từ dưới khuếch tán lên. Cần chú ý thuốc thử Keller-Kiliani và xanthydrol cũng dương tính với các digitanol glycosid (glycosid có trong Digitalis không phải glycosid tim nhưng có phần đường 2,6-desoxy) [2,24]. Tiến hành: cân 100 mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10ml etanol, hòa tan. Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Sau đó thêm 50 mg methanol trong 2 ml cloroform. Thêm vài giọt H2SO4 đặc, xuất hiện màu xanh đen [9]. g. Phương pháp định tính đường khử Phương pháp này dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm (glucose, fructose, maltose…) có thể dễ dàng khử đồng (II) oxid thành đồng (I) oxid có màu đỏ gạch, qua đó ta định tính được đường khử. Định tính đường khử ta sử dụng thuốc thử Fehling 1 (chứa CuSO4) và 2 ( là hỗn dịch của NaOH với muối tartrate của Na và K có công thức NaOOC-CHOH-CHOHCOOK (trong đó -OOC-CHOH-CHOH-COO- là gốc tartrate). h. Phản ứng Terpenoid - Phản ứng Liebermann-Burchardt Cân 100mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10 ml ethanol, lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm, hòa tan thêm 1ml chloroform, 2-3 ml của acetic anhydride, 1-2 giọt axit sulfuric đậm đặc [24]. - Phản ứng Salkowski Cân 100 mg cao chiết sâm vũ diệp, thêm 10 ml etanol, hòa tan. Lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Thêm 2 ml cloroform và 3 ml sulfuric axit H2SO4 [9]. 11 i. Phương pháp định tính thuốc thử Alkaloid Định tính alkaloid bằng các phản ứng tủa với một số thuốc thử. Các alkaloid có khả năng tạo tủa ít tan trong nước với một số thuốc thử chung của alkaloid. Tủa này sinh ra hầu hết một cation lớn là alkaloid với một anion lớn thường là anion phức hợp của thuốc thử [2,24]. - Thuốc thử Mayer (K2HgI4 - kalitetraodomercurat): cho tủa trắng hay màu vàng nhạt. Thuốc thử Bouchardat (Iodo - Iodid): cho tủa nâu. k. Phương pháp định tính thuốc thử Anthraquinon Các hợp chất anthraquinone khi tác dụng với kiềm (amoniac, natrihydroxyd hoặc kaki hydroxyd) sẽ tạo các dẫn chất phenolat có màu đỏ sim tan trong nước. Dựa vào tính chất này, định tính anthraquinone dựa trên phản ứng Borntrager. Định tính dạng tự do: lấy 1 mL dịch chiết thêm 1 mL dd amoniac 10% và 2 ml chloroform, sau đó lắc nhẹ, lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp chloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu chứa acid chrysophanic. Thêm tiếp từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung môi hữu cơ có màu vàng, còn lớp nước đỏ thẫm hơn lúc ban đầu. Định tính anthraquinone toàn phần (cả dạng glycoside và dạng tự do): lấy 1 ml dịch chiết, thêm 1 ml dung dịch amoniac, lắc nhẹ, lớp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp chloroform có màu vàng thì tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NH3 10%, lắc nhẹ, lớp chloroform sẽ mất màu còn lớp nước thì có màu đỏ đậm hơn. 1.2.2. Các phương pháp sắc kí Sắc kí là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần một hỗn hợp. Sự tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau của các nhóm chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa tan vào nhau: một pha tĩnh và một pha động. Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu. Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc kí với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian. Mỗi thành phần sẽ đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu. Trong kỹ thuất sắc ký, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất hòa tàn khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng 12