Tài liệu Nghiên cứu tạo một số chế phẩm sinh học từ chitosan tách chiết từ vỏ tôm bằng phương pháp thuỷ phân enzyme

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ CHITOSAN TÁCH CHIẾT TỪ VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN ENZYME Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Văn Thiết HÀ NỘI, 2011 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi tới thầy PGS.TS. Nguyễn Văn Thiết đã giao đề tài và trực tiếp hướng dẫn để em hoàn thành khóa luận này. Đồng kính gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Trần Thị Hoa Lý, người đã cùng tôi làm đề tài và các thầy cô làm việc tại Phòng Hóa Sinh Thực VậtViện Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện khóa luận này. Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến các thầy, các cô trong Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy, các cô trường Cao đẳng Thủy sản nơi mà em đang công tác, các bạn lớp K13 cao học sinh học thực nghiệm, gia đình và người thân đã luôn bên em trong suốt thời gian qua! Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Hạnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Hạnh DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ CTSL Chitosan kích thước phân tử nhỏ C% Nồng độ phần trăm DD Độ deacetyl hóa ĐC Đối chứng E, [E] Enzyme, nồng độ enzyme E1 Cellulase E2 Chitinase E3 Chitosanase FPLC Flow Performance Liquid chromatography GlcN Glucosamine GlcNAc N-Acetyl-glucosamine GLS Glucosamin sulfate HH Mẫu chitosan được tách chiết từ chitin bằng phương pháp hóa học HQ Hàn Quốc Km Hằng số Michaelis - Menten Mr Phân tử lượng của polymer MNSC monosaccharide NAG N-acetylglucosamine η Độ nhớt OLCS Oligochitosaccharide P Sản phẩm S, [S] Cơ chất, nồng độ cơ chất T Thời gian U Đơn vị enzyme MỤC LỤC MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1 CHƯƠNG 1...........................................................................................................5 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................................5 1.1. Giới thiệu về chitin/chitosan ...........................................................................5 1.1.1. Phân bố.....................................................................................................5 1.1.2. Cấu tạo và tính chất của chitin .................................................................5 1.1.3. Cấu tạo và tính chất của chitosan.............................................................7 1.1.4. Công dụng của chitosan ...........................................................................8 1.2. Các enzyme có khả năng thủy phân chitosan ...............................................13 1.2.1. Quá trình phân giải chitin và chitosan trong tự nhiên............................13 1.2.2. Các enzyme thuỷ phân chitosan.............................................................15 1.3. Vai trò sinh học của Glucosamine ................................................................16 1.4. Vai trò sinh học của nanochitosan và các oligochitosaccharide...................20 CHƯƠNG 2.........................................................................................................22 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................22 2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu..........................................22 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................22 2.1.2. Hóa chất .................................................................................................22 2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................22 2.2. Các phương pháp nghiên cứu........................................................................22 2.2.1. Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm ...............................................22 2.2.2. Phương pháp đo độ nhớt xác định khối lượng phân tử trung bình của chitin.................................................................................................................24 2.2.3. Phương pháp chuyển chitin thành chitosan ...........................................26 2.2.4. Các phương pháp xác định đường khử với antron.................................27 2.2.5. Các phương pháp nghiên cứu động học quá trình thủy phân chitosan..28 2.2.6. Phương pháp tủa với ethanol thu các sản phẩm khác nhau từ dịch thủy phân chitosan....................................................................................................29 2.2.7. Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử trên thiết bị FPLC.......................30 CHƯƠNG 3.........................................................................................................31 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................................31 3.1. Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm và chuyển hóa chitin thành chitosan ....31 3.1.1. Kết quả tách chiết chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học ...........31 3.1.2. Chuyển hóa chitin thành chitosan ..........................................................32 3.1.3. Đánh giá chất lượng các mẫu chitin và chitosan thu được ....................33 3.1.3.1. Kết quả đo độ nhớt..........................................................................34 3.1.3.2. Xác định khối lượng phân tử của chitin và chitosan ......................36 3.2. Kết quả thuỷ phân chitosan bằng phương pháp enzyme ..............................37 3.2.1. Kết quả nghiên cứu động học thuỷ phân chitosan bằng chitosanase.....37 3.2.1.1. Nghiên cứu động học quá trình thuỷ phân chitosan bởi chitosanase bằng phương pháp đo độ nhớt......................................................................37 3.2.1.2. Nghiên cứu động học quá trình thuỷ phân chitosan do chitosanase xúc tác bằng phương pháp xác định đường khử ..........................................40 3.2.2. Kết quả nghiên cứu thuỷ phân chitosan bằng chitinase.........................47 3.2.2.1. Đánh giá khả năng thuỷ phân chitosan bởi chitinase bằng phương pháp đo độ nhớt............................................................................................48 3.2.2.2. Nghiên cứu động học quá trình thuỷ phân chitosan bằng chitinase bằng phương pháp đo đường khử ................................................................49 3.2.3. Kết quả nghiên cứu thuỷ phân chitosan bằng cellulase .........................56 3.2.3.1. Đánh giá quá trình thuỷ phân chitosan bởi enzyme cellulase bằng phương pháp đo độ nhớt ..............................................................................56 3.2.3.2. Nghiên cứu động học quá trình thuỷ phân chitosan bởi cellulase bằng phương pháp đo đường khử ................................................................58 3.3. Đánh giá khả năng thu nhận các chế phẩm sinh học từ chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme ..........................................................................64 3.3.1. Đánh giá khả năng thu nhận chế phẩm glucosamine từ chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme ......................................................................65 3.3.2. Đánh giá khả năng thu nhận các chế phẩm sinh học khác từ chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme .............................................................71 3.4. Phân tích sản phẩm bằng phương pháp sắc kí FPLC....................................74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................76 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................78 PHẦN PHỤ LỤC................................................................................................85 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam là quốc gia ven biển, nằm trong khu vực Đông Nam Á có khí hậu ấm áp quanh năm, có đường bờ biển dài hơn 3.260 km với 112 cửa sông, lạch, có diện tích vùng nội thủy và lãnh hải rộng 226.000 km2 [6] cùng với nhiều nguồn sinh vật đa dạng và phong phú. Chính vì thế mà hiện nay, ngành đánh bắt và nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam rất phát triển, một trong những ngành mũi nhọn ở nước ta là nuôi tôm và chế biến tôm đông lạnh xuất khẩu. Hàng năm, các nhà máy chế biến tôm đã thải ra một lượng lớn phế liệu (phụ phẩm) đầu và vỏ, khoảng 70000 tấn [16], chiếm tới 40% lượng nguyên liệu ban đầu. Nguồn phụ phẩm này chủ yếu được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hay đôi khi bị thải ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng. Vì vậy việc tìm ra các giải pháp tận dụng tối đa nguồn phụ phẩm này trong chế biến thủy sản đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Thành phần chính của nguồn phế thải này là chitin, một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose. Trở ngại lớn nhất trong ứng dụng chitin là tính chất khó hòa tan của chúng trong nhiều dung môi, kể cả các dung môi hữu cơ. Từ chitin có thể tạo ra chitosan – một polysaccharide mà trong thành phần chứa chủ yếu là các gốc glucosamine (GlcN) để ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế: nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm và đặc biệt là trong ngành dược phẩm, chitosan là nguyên liệu để bào chế ra nhiều loại sản phẩm thuốc chữa bệnh khác nhau. Một trong các loại thuốc đó là glucosamine, chất này tham gia vào quá trình tổng hợp nhiều thành phần của sụn khớp, đóng vai trò quan trọng trong duy trì sức mạnh và tính đàn hồi của khớp. Nó có tác dụng kích thích tế bào của sụn khớp tổng hợp ra các proteoglucan, ức chế một số enzyme gây 2 phá hủy sụn khớp, giảm các gốc tự do gây hại cho tế bào sinh sụn, tăng sản sinh chất nhầy ở dịch khớp, làm trơn dịch khớp và giảm hiện tượng thoái hóa khớp. Nước ta có nhiều nguồn nguyên liệu chứa chitin phong phú. Trong động vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiếm tỉ lệ khá cao, từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [7]. Với đặc tính sẵn có như kháng nấm, kháng khuẩn, tăng cường khả năng miễn dịch, tác động tích cực đến quá trình chuyển hóa lipid trong cơ thể, chống lại tế bào u mà chitin/chitosan và dẫn xuất của chúng đã được nghiên cứu sử dụng vào nhiều lĩnh vực khác của cuộc sống: công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử lý nước thải… và đặc biệt là trong lĩnh vực y học. Từ chitosan người ta đã bào chế ra nhiều loại thuốc điều trị các bệnh như nhiễm xạ, chữa bỏng, giảm đau, đặc biệt đối với bệnh nhân đái tháo đường chitosan có khả năng kích thích cơ thể tiết ra insulin [17]. Mặc dù chitin/chitosan có rất nhiều, được coi là hợp chất không độc, rất ít gây dị ứng nhưng quá trình nghiên cứu chitin – chitosan chỉ thực sự có hệ thống vào giữa thế kỷ 20 [54]. Các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh trong vỏ tôm có chứa 27% chất chitin, từ chitin họ có thể nhận được chitosan – một polysaccharide mà trong thành phần chứa chủ yếu là các gốc glucosamine. Trên thế giới và cả nước ta ngày càng có xu hướng sử dụng chế phẩm chiết xuất từ nguồn gốc thiên nhiên. Vì vậy việc tạo ra các chế phẩm sinh học từ chitosan và các sản phẩm chế biến từ các polysaccharide này là cần thiết. Xuất phát từ những nhu cầu trên, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tạo một số chế phẩm sinh học từ chitosan bằng phương pháp thủy phân enzyme”. 2. Mục đích nghiên cứu Tạo một số chế phẩm sinh học từ vỏ tôm bằng phương pháp thủy phân enzyme. 3 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Đề tài có các nội dung nghiên cứu sau đây: 1) Thu nhận chế phẩm chitin từ vỏ tôm. 2) Chuyển hóa chitin thành chitosan và xác định kích thước phân tử của chitin thông qua đo độ nhớt của chế phẩm chitosan nhận được. 3) Nghiên cứu động học của quá trình thủy phân chitosan bằng các enzyme khác nhau để tìm điều kiện tối ưu cho việc tạo ra một số chế phẩm sinh học từ chitosan: Nhóm sản phẩm chính thứ nhất là chitosan kích thước phân tử nhỏ (bao gồm chitosan khối lượng phân tử thấp, nanochitosan); nhóm sản phẩm chính thứ hai (bao gồm các oligochitosaccharide mạch dài, các oligochitosaccharide mạch ngắn) gọi là oligochitosaccharide, còn nhóm sản phẩm chính thứ ba – monosaccharide (glucosamine). 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: Chitin, chitosan khối lượng phân tử thấp, nanochitosan, oligochitosaccharide mạch dài, các oligochitosaccharide mạch ngắn và monosaccharide (glucosamine). * Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu quá trình thủy phân chitosan bằng các enzyme khác nhau: chitinase, chitosanase, cellulase ở các nồng độ, nhiệt độ và thời gian khác nhau. 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm; - Phương pháp đo độ nhớt xác định khối lượng phân tử trung bình của chitin; - Phương pháp chuyển chitin thành chitosan; - Các phương pháp xác định đường khử với antron; 4 - Các phương pháp nghiên cứu động học quá trình thủy phân chitosan; - Phương pháp tủa với ethanol thu các sản phẩm khác nhau từ dịch thủy phân chitosan; - Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử trên thiết bị FPLC. 6. Dự kiến đóng góp mới Chỉ ra bằng phương pháp thủy phân enzyme sẽ tạo ra được một số chế phẩm sinh học có giá trị giá tăng cao từ chitosan. 5 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về chitin/chitosan 1.1.1. Phân bố Mặc dù chitin được phát hiện ra từ khá sớm nhưng con người đã phải mất hơn một thế kỷ mới có thể hiểu được rõ về cấu tạo hóa học, tính chất và chức năng sinh học của nó. Chitin được Braconnot phát hiện lần đầu vào năm 1811 trong cặn dịch chiết từ một loại nấm [18] và chất này được gọi là “fungine”. Đến năm 1823, Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin nhưng không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Sau đấy Children, Lassaigne và Payen đã xác định được sự có mặt của nitơ trong chitin. Cho đến năm 1876, Ledderhose đã thủy phân chitin của động vật chân đốt thu được glucosamine và acid acetic; như vậy cấu trúc của chitin đã dần được xác định. Chitin là một polysaccharide mạch thẳng đứng thứ hai trong tự nhiên về số lượng chỉ sau cellulose [21, 31, 35, 50, 57], là thành phần sinh hóa không thể thiếu trong vỏ của các loài giáp xác. Chitin có mặt ở gần như tất cả các lớp động vật [14]. Chitin tồn tại tự nhiên trong cơ thể động vật dưới chức năng bảo vệ [20, 31, 35, 50], nó có ở lớp vỏ của các loài giáp xác (vỏ cua, vỏ tôm, mai mực, bọ cánh cứng… ), vỏ của các loại côn trùng, thành tế bào vi khuẩn, thành tế bào nấm, nấm men, vỏ của một số loài động vật ở sâu đáy biển 2600m (Rifitia pachyprila). Người ta xác định 50% đến 80% các hợp chất hữu cơ trong vỏ của động vật giáp xác và các biểu bì của côn trùng có chứa chitin [28]. 1.1.2. Cấu tạo và tính chất của chitin - Cấu tạo của chitin: Chitin có cấu trúc polymer tuyến tính từ các đơn vị N-acetyl-β-D-glucosamine nối với nhau nhờ cầu nối β–1, 4-glucoside. 6 Công thức phân tử: [C8H13O5] n Công thức cấu tạo: CH 2 OH CH 2OH CH 2OH O OH O O O O OH NHAc NHAc NHAc Chitin O OH n - Tính chất của chitin: Chitin có màu trắng, không tan trong nước, môi trường kiềm, acid loãng và các chất dung môi hữu cơ như este, rượu… nhưng nó lại hòa tan trong dung dịch đặc nóng của muối LiSCN (thiocyanate lithium) và Ca(SCN)2 (thiocyanate calcium) tạo thành dung dịch keo. Chitin tương đối ổn định với các chất oxi hóa khử, như thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước javen (NaClO) hay Ca(ClO)2… Lợi dụng tính chất này, người ta sử dụng các chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin. Khi đun nóng trong HCl đậm đặc thì chitin sẽ bị thủy phân hoàn toàn tạo thành D- glucosamine và acid acetic, quá trình thủy phân bắt đầu xảy ra ở mối nối glucoside, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (–CO – CH3). (C32H54N4O21) x + 2H2O → (C28H50N4O19) x + 2 (CH3 – COOH) x Khi đun nóng chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thì chitin sẽ bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan. Chitin + NaOH (đđ) Đun nóng Chitosan + nCH3COOH Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng: λ= 884 ÷ 890 µm. Nhìn chung các phản ứng hóa học của chitin là không đa dạng, điều này dễ dàng giải thích được do cấu tạo chitin có các nhóm tương đối trơ, hơn nữa cấu trúc bề mặt của chitin phẳng lì và rất chặt chẽ đã gây khó khăn cho sự 7 tiếp xúc của nó với các tác nhân phản ứng. Tính không tan trong nước và các dung môi hữu cơ thông thường nên chitin khó tham gia các phản ứng hóa học thông thường, vì điều này mà khả năng ứng dụng của chitin đã bị hạn chế rất nhiều. Các nhà khoa học đã cố gắng nghiên cứu biến đổi hóa học tạo ra các dẫn xuất khác nhau của chitin để có thể hòa tan trong các dung môi thông thường tiện lợi hơn trong quá trình sử dụng. Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan, một dẫn xuất thu được bằng phản ứng đeacetyl hóa chitin biến đổi nhóm N – acetyl thành nhóm amine ở vị trí C2 [2], được coi là dẫn xuất quan trọng nhất. Hiện nay người ta đã biết được chitosan có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng đa dạng trong thực tế [19]. 1.1.3. Cấu tạo và tính chất của chitosan Chitosan là một polymer hữu cơ có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β – D-glucosamine liên kết với nhau nhờ liên kết β–1, 4 glucoside. Công thức phân tử: [C6H11O4]n Phân tử lượng: Mchitosan = (161.07)n Công thức cấu tạo: CH 2 OH CH 2OH CH 2OH O OH NH2 O O O O OH O OH NH2 NH2 n Chitosan Chitosan ở dạng bột có màu trắng ngà, còn ở dạng vẩy có màu trắng hơi vàng. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, kiềm nhưng hòa tan trong acid acetic loãng tạo thành dung dịch keo dương, nhớt và trong suốt, nhờ đó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như Pb, Hg… 8 Do chitosan còn cặp electron tự do linh động trên nguyên tử (N) nên có khả năng tạo phức với ion kim loại [28], tạo liên kết với các acid hữu cơ, anhydride hữu cơ. Chitosan kết hợp với aldehyde trong điều kiện thích hợp, hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzyme. Chitosan phản ứng với acid đậm đặc, tạo thành muối khó tan, tác dụng với iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng màu tím, phản ứng này có thể dùng để phân tích định tính chitosan. 1.1.4. Công dụng của chitosan Công dụng trực tiếp của chitin nói chung là không nhiều và thường chuyển qua dẫn xuất chitosan rồi tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng. Nhờ đặc tính sinh học quý giá mà chitosan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: Nông nghiệp [4, 5], y – dược học [34, 56, 57], xử lí nước thải, công nghiệp nhuộm, giấy, mỹ phẩm [57], thực phẩm [31]… Hiện nay các nhà khoa học Việt Nam cũng đã và đang tập trung nghiên cứu nhiều về ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất của chúng trong y – dược học, trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường. Trong nông nghiệp: Oligoglucosamine ảnh hưởng sinh trưởng của rau cải và đậu cove và các loại rau khác, có tác dụng tăng năng suất, tăng khả năng kháng bệnh, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật góp phần bảo vệ môi trường và thực hiện chương trình rau sạch, rau an toàn. Chitosan được sử dụng để bọc nang các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt [4]. Hiện nay chế phẩm oligoglucosamine và oligochitin đã được nghiên cứu bởi PGS.TS. Trần Thị Luyến – Trường đại học Nha Trang. 9 Kích thích tăng trưởng, tăng năng suất: Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của lúa mạ, ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan vi lượng làm tăng hàm lượng diệp lục và hàm lượng Nitơ tổng số, đồng thời hàm lượng các enzyme như amylase, catalase hay peroxidase cũng tăng lên, vì vậy làm tăng năng suất cây trồng. Ngoài ra trong nông nghiệp còn sử dụng chitosan để bảo quản thực phẩm, trái cây, do dịch keo chitosan (keo dương) có tác dụng chống mốc, chống sự phá hủy của một số nấm mem, vi sinh vật gram âm trên các loại hoa quả. Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng. Trong Y học: Tạo da nhân tạo: Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin được gọi là Beschitin W, nó giống như một tấm vải và được bọc lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi. Tấm Beschitin W bị phân hủy sinh học từ từ cho đến lúc hình thành lớp biểu bì mới. Nó có tính chất kháng khuẩn, lành da, tạo biểu bì mới, giảm đau, giúp cho các vết sẹo phục hồi nhanh chóng [2]. Ở lĩnh vực này nước ta cũng trở thành quốc gia thứ hai sau Nhật Bản chế tạo thành công màng da nhân tạo chữa các tổn thương về da từ chitin. Sản phẩm được mang tên Vinachitin do tập thể các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học (Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia) và đại học Y Hà Nội [1]. Tạo chỉ khâu phẫu thuật, tự hủy: Trường Đại học Delaware đã chế tạo thành công chỉ khâu phẫu thuật tự tiêu từ chitin nhờ phát hiện ra một dung môi đặc biệt có khả năng hòa tan chitin ở nhiệt độ thường mà không phá hủy cấu trúc polymer [2]. Sản xuất thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng từ chitosan. Và mới đây Viện Vacxin Nha Trang đã sản xuất thành công hai sản phẩm là Chitovac chữa béo phì và Glusivac điều trị thoái hóa khớp. Hai loại thuốc này đã được 10 Bộ Y tế cấp phép lưu hành toàn quốc vào đầu tháng 6/2005 [42]. Giá thành của hai loại thuốc trên rẻ hơn một nửa so với giá thuốc ngoại nhập. Chitosan có tác dụng chữa béo phì nhờ tính năng ngăn cản lipid vào máu, hút các chất béo không cho chúng hấp thụ vào máu và thải ra ngoài bằng đường tiêu hóa [55]. Một trong những tính năng quan trọng và hữu ích nhất của chitosan là khả năng tạo phức: Chitosan liên kết chọn lọc với cholesterol [39], các acid béo, protein và các tế bào u, kích thích sản sinh bạch cầu. Vào năm 2003, nhóm các bác sĩ Bệnh viện K Hà Nội đã thí nghiệm thực hiện trên 60 bệnh nhân tuổi từ 35 – 76 và đưa ra kết luận chitosan có khả năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư. Hay như Sirica và Woodman [39] khi thử nghiệm khả năng kết tụ tế bào u của chitosan đã chỉ ra rằng, chitosan có khả năng kết tụ một cách có chọn lọc tế bào u trong ống nghiệm, tạo ra khối kết tụ đặc, bao quanh và ức chế sự phát triển của tế bào. Một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng đã phát hiện chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột qụy. Trong công nghệ sinh học: Làm chất mang để cố định enzyme và cố định tế bào: Enzyme cố định đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích. Enzyme cố định được sử dụng lâu dài, nên không cần thay đổi chất xúc tác. Sử dụng chitosan làm chất mang để cố định enzyme và tế bào được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước quả… Trường Đại học Nha Trang đã nghiên cứu phối trộn chitosan và alginate để làm chất mang cố định tế bào Saccaromyces cerevisiae để lên men rượu từ glucose. Kết quả đã làm tăng độ bền của các hạt gel microcapsule, tăng chu kỳ lên men [16] trong quá trình sản xuất rượu đem lại hiệu quả kinh tế cao. 11 Trong công nghệ thực phẩm: Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng kết dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg… do đó chitin được sử dụng tẩy lọc nguồn nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm. Chitosan được sử dụng như một polymer-catinonite trong sản xuất agarose từ agar – agar có chất lượng kém. Chitin có tính tẩy màu mà không hấp thụ mùi và các thành phần khác nên nó được ứng dụng vào việc khử màu nước uống (đồ uống nước trái cây), dầu cá, nước mắm xuất khẩu. Bùi Văn Miên và Nguyễn Anh Trinh, khoa Công nghệ thực phẩm thuộc Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu tạo ra màng chitosan bằng các sử dụng các chất phụ gia khác nhau nhưng có cùng bản chất hóa học (thường là các chất dẻo hóa học) được sử dụng để tăng tính dẻo dai và đàn hồi của màng. Ví dụ như: EG, PEG… Những vỏ bọc đầu tiên ra đời được chế tạo để nhồi xúc xích, lớp màng này còn có tác dụng đặc biệt là không làm mất màu và mùi đặc trưng của xúc xích. Từ thành công này, các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu sử dụng vỏ bọc chitosan để bảo quản thủy sản tươi và khô. Bên cạnh đó chitosan còn được ứng dụng trong rất nhiều các ngành công nghiệp khác như hóa chất, mỹ phẩm, dệt… Năm 1961, nhà khoa học Nga Boris Beloisov đã khởi xướng việc bào chế thuốc chống nhiễm xạ từ chitosan. Kết quả thử nghiệm tiêm thuốc cho chó và khỉ trước khi chúng bị nhiễm xạ cho thấy khả năng sống sót tới 45%. Các hãng mỹ phẩm trên thế giới cũng đã ứng dụng thành phần chitosan như là các tác nhân tạo gel và giữ ẩm cho hàng loạt các sản phẩm của mình như kem đánh răng, kem chống nắng, nước xúc miệng… Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do chitosan có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm – CH3+. Các nhóm này liên kết với các tế bào sừng hoá của da, nhờ vậy mà các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da 12 chống nắng bằng cách ngăn các tia cực tím bởi các nhóm – CH3+ [15]. Hãng mỹ phẩm Wella đã dùng chitin/chitosan trong ít nhất 15 sản phẩm bảo vệ tóc và hãng Shiseido cũng đã dùng chất này trong 13 sản phẩm. Chitosan được sử dụng là thành phần của keo xịt tóc, do chitosan là polyamine (tích điện dương) có thể kết hợp với các protein của tóc và nhờ độ keo của nó khi khô sẽ làm cho toc cứng giữ được nếp của tóc. Do có cấu trúc tương tự như cellulose nên chitin/chitosan được nghiên cứu bổ sung vào nguyên liệu sản xuất giấy, nó làm tăng độ bền dai của giấy, đồng thời việc in trên giấy cũng tốt hơn [9]. Qua nghiên cứu người ta thấy rằng nếu xử lý bề mặt giấy với dung dịch chitosan 1% thì độ bền của giấy sẽ tăng lên khi bị ướt hay tăng độ nét khi in. Trong công nghệ sản xuất vải người ta cũng sử dụng chitosan để thay thế hồ tinh bột trong quá trình hồ vải, nó có tác dụng làm cho sợi tơ bền, mịn, bóng đẹp và cố định hình in. Chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, sản xuất vải col, vải chitosan được nghiên cứu bởi các nhà khoa học Trường Đại học Nha Trang. Theo Tiến sĩ (TS) Trang Sĩ Trung, Trưởng bộ môn Hóa sinh - Vi sinh thực phẩm, Trường Đại học Nha Trang thì việc kết hợp enzyme Flavourzyme trong quy trình sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu vỏ đầu tôm sẽ giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng, đồng thời thu được 2 sản phẩm chính chứ không phải 1 như những quy trình hiện nay. Từ năm 2006 đến 2008, TS Trang Sĩ Trung và các cộng sự đã tập trung nghiên cứu cải tiến quy trình theo hướng kết hợp xử lý hóa học với sinh học, đồng thời hoàn thiện quy trình theo hướng bổ sung các công đoạn tận thu protein và astaxanthin, nâng cao chất lượng chitin-chitosan. Việc kết hợp sử dụng enzyme chứ không chỉ dùng hóa chất trong quá trình sản xuất chitin-chitosan có ưu thế hơn so với phương pháp hóa học truyền thống là giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng và thải ra môi trường. Mặt khác, quy trình cải tiến với sự vượt trội về chất lượng chitin, chitosan thu 13 được và thu hồi sản phẩm protein-astaxanthin có giá trị dinh dưỡng và sinh học, làm hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nước thải, giảm thiểu chi phí xử lý môi trường. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin-chitosan gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản. Đây là một hướng đi cho phương pháp sản xuất sạch hơn. Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn. 1.2. Các enzyme có khả năng thủy phân chitosan 1.2.1. Quá trình phân giải chitin và chitosan trong tự nhiên Chitin và chitosan là những biopolymer bền, nhưng vẫn có một loại enzyme do một số vi khuẩn và nấm trong đất tạo ra có thể phân huỷ được. Do vậy, loại polymer này sẽ tan rã nhanh chóng trong môi trường sau khi bị vứt bỏ. Hàng năm trên trái đất có khoảng 1010 – 1011 [17, 57] tấn chitin được tổng hợp, so với lượng cellulose là 1011 tấn/năm [18] và cũng một lượng chitin như vậy bị phân huỷ. Quá trình phân huỷ chitin/chitosan xảy ra trong tự nhiên ở cả điều kiện có oxy và không có oxy. Ở nhóm sinh vật có khả năng sử dụng chitin/chitosan làm cơ chất, sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải chitin/chitosan là GlcN - nguồn cacbon cho quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng. Các sinh vật này đều tiết ra các enzyme chitinolytic/chitosanolytic để phân giải chitin/chitosan. Trong số các enzyme này phải kể tới chitinase (exochitinase và endochitinase), chitin deacetylase, chitosanase, N-acetylglucosamineidase, glucosaminidase và acetylase. Trong tự nhiên có 2 đường phân giải chitin: Theo đường thứ nhất chitin bị tác động trực tiếp bởi enzyme (hệ enzyme) chitinase, còn theo đường thứ hai đầu tiên chitin được deacetyl hoá thành chitosan dưới xúc tác của enzyme 14 chitin deacetylase, sau đó chitosan bị thuỷ phân bởi chitosanase. Sản phẩm trung gian trong quá trình phân giải chitin và chitosan là các chitooligosaccharide + N, N1-diacetylchitobiose và oligo-GlcN + chitobiose tương ứng. Ngoài nhóm sinh vật sử dụng chitin làm nguồn carbon thì các nhóm sinh vật tổng hợp chitin và không tổng hợp chitin khác cũng tạo ra chitinase. Tuy nhiên, chức năng của enzyme chitinase ở các nhóm sinh vật này hoàn toàn khác chức năng của chitinase ở nhóm sinh vật thứ nhất. Nếu như ở nhóm sinh vật thứ nhất chức năng sinh lí của chitinase là tiêu hoá, mục đích hoạt động chính của enzyme là tạo ra GlcN phục vụ cho nhu cầu năng lượng và vật liệu của cơ thể thì ở nhóm sinh vật tổng hợp chitin, chức năng sinh lí của chitinase là tự phân (autolytic), làm cho sợi nấm định hướng lại sự sinh trưởng của nó hoặc côn trùng xây dựng lại khung xương ngoài của chúng (sự lột xác) [27]. Ngoài ra, các chitinase còn có chức năng sinh học là tấn công hay tự vệ. Vai trò tấn công của chitinase là rất rõ ràng trong trường hợp các tác nhân gây bệnh ở nhóm cơ thể tổng hợp chitin, nó giúp cho các tác nhân gây bệnh (như nấm, protozoa và vi khuẩn) xâm nhập được vào cơ thể các động vật chân khớp, giun hay côn trùng. Còn vai trò tự vệ của chitinase là chung cho giới thực vật, nơi mà các chitinase được tổng hợp cảm ứng trong trường hợp bị nhiễm trùng hay tổn thương để chống lại các tác nhân gây bệnh là nấm. Ở các loài cây ăn thịt côn trùng, hệ thống tự vệ (nhờ chitinase) được biến đổi thành chức năng tiêu hoá [24]. Vai trò tự vệ của các chitinase cũng có cả ở động vật: hoạt tính chitinolytic cao có trong huyết thanh của các động vật nhai lại và cá bơn [27]. Tuy nhiên để kháng được nấm thực vật phải có cả 1 tổ hợp kháng nấm phòng thủ, trong đó không chỉ có endochitinase, mà còn có cả lysozyme và β-1, 3-glucanase. Chỉ tổ hợp từ 3 enzyme này mới có khả năng làm ngừng quá trình nảy mầm của bào tử nấm và làm giảm sự sinh trưởng của sợi nấm.