Tài liệu Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên cyfra21-1 nhằm phát triển kit chẩn đoán ung thư phổi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN 2. GS.TSKH. NGUYỄN TÀI LƯƠNG THÁI NGUYÊN - 2013 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới PGS.TS. Lê Quang Huấn – Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; GS.TSKH. Nguyễn Tài Lương, là những người thầy đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Phòng Quản lý Sau đại học và Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. Tôi cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ quý báu của tất cả các anh, chị em và các bạn phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Cuối cùng, tôi muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả người thân trong gia đình đã luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận án này! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 NCS. Lê Đình Chắc ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả là đồng tác giả với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần cũng đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào khác. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 Tác giả Lê Đình Chắc iii MỤC LỤC Mục Tên chương, phần, mục và tiểu mục Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục hình ix Danh mục bảng xii Mở đầu Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Trang Nguồn gốc và đặc điểm ung thư 1 4 4 1.1.1. Nguồn gốc tế bào ung thư 4 1.1.2. Đặc điểm của tế bào ung thư 6 1.1.3 Ung thư phổi 7 1.2. Kháng nguyên CYFRA21-1 12 1.2.1. Cytokeratin 12 1.2.2. Cấu trúc của Cytokeratin 15 1.2.3. Biểu hiện của Cytokeratin 15 1.2.4. Kháng nguyên CYFRA21-1 17 1.3. 1.3.1. Kháng thể Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu và 21 21 thực tiễn hiện nay 1.3.2. 1.4. Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 Công nghệ phage display 29 30 1.4.1. Giới thiệu công nghệ phage display 30 1.4.2. Ứng dụng của kháng thể phage-scFv trong chẩn đoán và 31 điều trị iv Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. 33 Vật liệu 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm 33 2.1.2. Sinh phẩm và hóa chất 33 2.1.3. Trang thiết bị 35 2.1.4. Phần mềm máy tính 36 2.2. Phương pháp 37 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 37 2.2.2. Các phương pháp thao tác với DNA 38 2.2.3. Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp 45 2.2.4. Các kỹ thuật phage display 48 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng 55 55 nguyên CYFRA21-1 3.1.1. Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi 55 3.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-1 57 3.1.3. Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 58 3.1.4. Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 62 3.2. Biểu hiện và thu kháng nguyên CYFRA21-1 64 3.2.1. Nhân bản vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 64 3.2.2. Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên 66 CYFRA21-1 3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện pET-21a(+)/Cyfra21-1 67 3.2.4. Biểu hiện protein CYFRA21-1 tái tổ hợp 72 3.2.5. Tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1 74 3.2.6. Kết quả phân tích khối phổ protein tái tổ hợp 75 v 3.3. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-1 77 3.4. Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 81 3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương và lách của gà đã 81 được gây miễn dịch 3.4.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa vùng biến đổi của kháng thể gà 81 đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 3.4.3. Quy trình tạo dòng phage biểu hiện kháng thể scFv 85 (kháng thể phage) 3.4.4. Kết quả chọn dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng 86 nguyên CYFRA21-1 3.4.5. Xác định trình tự gen mã hóa kháng thể đặc hiệu epitope 89 kháng nguyên CYFRA21-1 3.5. Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu 91 được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 3.6. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh 97 phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 101 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ 102 LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AML Acute Myelogenous Leukemia Amp Ampicillin APS Amoniumpersulphate cDNA complement DNA CDR Complement Determining Region CEA Carcinoembryonic Antigen CLL Chronic lymphocytic leukemia ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate DEPC Diethyl Procarbonate EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EtBr Ethidium Bromide FcR Frament cristallisable Recetor FDA Food and Drug Administration HCDM Human Cell Differentiation Molecules HCL Hairy cell leukemia HL Hodgkin Lymphoma HLDA Human Leukocyte Differentiation Antigens HRP horseradish peroxidase vii HT Huyết thanh IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside KN Kháng nguyên Jak Janus tyrosine kinase LAK Lymphokine activated killer LB Luria Betani mAb Monoclonal Antibody MPBS skimmed milk in PBS NHL Non-Hodgkin lymphoma NK Natural Killer NES Neuron specific enolase NRE Negative Regulatory Element NSCLC Non small cell lung carcinoma OD Optical Density PASI Psoriasis Area and Severity Index PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction PD-IPCR Phage display-IPCR PEG Polyetylene Glycol PRR Positive Regulation Region RT-PCR Revert Transcriptase - Polymerase Chain Reaction viii scFv Single chain variable fragment SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SCLC Small cell lung carcinoma TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA TEMED N, N, N’, N’ tetramethylethane-1,2-diamine TMB 3, 3’, 5, 5’ tetramethyl benzidine TPA Tissue polypeptide antigen TPBS Tween 20 in PBS TPS Tissue polypeptide specific antigen VH immunoglobulin heavy chain variable region VL immunoglobulin light chain variable region X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- β - D-galactopyranoside UTP Ung thư phổi ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1. Mô hình bộ khung xương tế bào 14 Hình 1.2. Mô tả cấu trúc của Cytokeratin 15 Hình 1.3. Cấu trúc gen mã hóa Cytokeratin 19 17 Hình 1.4. Vị trí CYFRA21-1 trên Cytokeratin 19 18 Hình 1.5. Cấu trúc cơ bản của một phân tử Ig và các mảnh 24 kháng thể Hình 1.6. Cấu trúc của phage mang gen mã hóa scFv 27 Hình 1.7. Kháng thể phage-scFv tham gia phản ứng định lượng kháng nguyên Sơ đồ thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng 31 Hình 2.1. 53 real time -PCR Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 58 Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách chiết plasmid tái 60 tổ hợp mang đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 Hình 3.3. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách dòng đoạn gen mã 61 hóa CYFRA21-1 Hình 3.4. Trình tự nucleotide của cDNA và amino acid suy diễn 62 của đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của đoạn 63 gen mã hóa CYFRA21-1 thu được với trình tự amino acid của kháng nguyên CYFRA21-1 đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu quốc tế mang mã số K1C19HUMAN P08727 Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 65 Hình 3.7. Trình tự nucleotide của cDNA và amino acid suy diễn 66 x mã hóa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 Hình 3.8. Hình ảnh điện di vector tái tổ hợp cắt với hai enzym 68 Nde I và Xho I Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector pET-21a(+) với 69 enzym Nde I và Xho I Hình 3.10. Sơ đồ quá trình gắn kết và chọn dòng vector pET- 70 21a(+)/Cyfra21-1 Hình 3.11. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của 71 gen Cyfra 21-1 sau khi gắn vào vector biểu hiện pET-21a(+) Hình 3.12. Hình ảnh điện di protein tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli 73 Hình 3.13. Hình ảnh điện di kết quả tinh sạch protein tái tổ hợp trên 74 cột Ni-NTA Hình 3.14. Kết quả phân tích khối phổ của sản phẩm gen biểu hiện 75 trong E.coli sau khi cảm ứng với IPTG Hình 3.15. Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA 78 sau khi gây miễn dịch lần thứ 3 Hình 3.16. Biểu đồ xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA 80 trước khi lấy tuỷ xương và lách Hình 3.17. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR 82 Hình 3.18. Sơ đồ vector pHEN2 83 Hình 3.19. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nối ghép VH-VL 84 tạo scFv Hình 3.20. Kết quả chọn các dòng mang kháng thể đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 bằng kỹ thuật ELISA 88 xi Hình 3.21. Trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của 89 kháng thể scFv đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 Hình 3.22. Biểu đồ đánh giá liên kết của dòng phage 10 với huyết 90 thanh UTP và huyết thanh bình thường Hình 3.23. Sơ đồ mồi, mẫu dò và đoạn DNA được khuếch đại trong 93 phản ứng định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 Hình 3.24. Sơ đồ mô tả chu trình nhiệt trong phản ứng 93 real time PCR Hình 3.25. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết 94 thanh, kháng nguyên Hình 3.26. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết 96 thanh do Bệnh Viện Quân Y 108 cung cấp Hình 3.27. Kết quả định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp 97 xii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1. Thành phần phản ứng RT-PCR 39 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm RT-PCR vào vector 40 pCR2.1 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR 44 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng real time-PCR 54 Bảng 3.1. Kết quả thực tế nhận được sau khi phân tích khối phổ 76 Bảng 3.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA sau khi 78 gây miễn dịch lần thứ 3 Bảng 3.3. Kết quả xác định đáp ứng miễn dịch của gà bằng ELISA 79 trước khi lấy tuỷ xương và lách Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc, lựa chọn các dòng biểu lộ kháng thể đặc 88 hiệu quyết định kháng nguyên CYFRA21-1 Bảng 3.5. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu huyết 95 thanh, kháng nguyên Bảng 3.6. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp 98 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Ung thư phổi (UTP) là một trong những căn bệnh hiểm nghèo do sự tăng sinh không bình thường của tế bào, thường gặp ở nam giới, chủ yếu là lứa tuổi 50-70, đặc biệt liên quan đến những người đã hoặc đang hút thuốc lá. Đồng thời, UTP cũng là căn bệnh có tỉ lệ tử vong lớn thường gặp ở người. Vì vậy, việc phát hiện sớm UTP có ý nghĩa sống còn với bệnh nhân. Thực tế, trong y học đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng để chẩn đoán UTP (sinh thiết phổi, nội soi phổi, thử đờm, chọc nước màng phổi, chụp quang tuyến cắt lớp …) và một số phương pháp điều trị UTP (hoá trị liệu, phẫu thuật, xạ trị …) [2]. Tuy nhiên, khi phát hiện UTP thì thường đã muộn hoặc quá muộn, vì một số căn bệnh khác (viêm phế quản, viêm phổi, lao, …) cũng có những triệu chứng tương tự UTP. Do vậy, việc tìm kiếm các phương pháp hữu hiệu có độ chính xác cao để chẩn đoán sớm UTP đang là vấn đề cần thiết và cấp bách của các nhà khoa học, y học trong và ngoài nước. Nghiên cứu tế bào ung thư cũng như nguồn gốc và sự phát triển của tế bào ung thư, người ta nhận thấy ung thư có liên quan chặt chẽ với sự xuất hiện hàm lượng các kháng nguyên đặc trưng ung thư trong máu, nước mô, huyết thanh [12], [21], [22], [85], [86], [95]. Điều này đã mở ra hướng nghiên cứu mới trong chẩn đoán và điều trị ung thư trên thế giới và trong nước. Một trong những hướng nghiên cứu đó là phương pháp sử dụng các chỉ thị kháng nguyên để xác định, chẩn đoán bệnh và tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên đích để định hướng điều trị ung thư nói chung, UTP nói riêng [51], [58], [88], [102]. Phương pháp này bắt đầu được nghiên cứu sâu hơn vào những năm cuối của thế kỷ trước. Đến nay, vấn đề này đang được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trên thế giới và trong nước. Phương pháp sử dụng chỉ thị kháng nguyên, tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng 2 nguyên không chỉ áp dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thư mà còn được ứng dụng mạnh mẽ trong chẩn đoán và điều trị nhiều bệnh nan y khác như AIDS, viêm gan B … Hiện nay, nhiều chỉ thị kháng nguyên ung thư được biết đến và có thể sử dụng để phát hiện ung thư như: CEA, NES, CA125, CYFRA21-1, HER2/neu … [38], [47], [52], [66], [73] trong đó, kháng nguyên CYFRA21-1 là một chỉ thị điển hình cho bệnh UTP dạng không phải tế bào nhỏ (non small cell lung carcinoma – NSCLC) do sự tăng hàm lượng CYFRA21-1 nhanh chóng trong dịch cơ thể khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh bất thường [14], [16], [24], [25], [39]. Vì vậy, nếu phát hiện sớm được sự tăng hàm lượng CYFRA21-1 trong dịch cơ thể sẽ góp phần chẩn đoán sớm được UTP. Do đó, kháng nguyên CYFRA21-1 có thể được sử dụng như là một chỉ thị đặc hiệu để chẩn đoán sớm, từ đó định hướng điều trị hiệu quả UTP dạng NSCLC. Trên thế giới, hiện nay một số công trình nghiên cứu của Suzuki và cộng sự (2007) [89]; Tomita và cộng sự (2010) [94]; Yang và cộng sự (2012) [107]…. đã cho thấy, hàm lượng CYFRA21-1 trong cơ thể luôn được duy trì vào khoảng 3,3 ng/ml, tuy nhiên hàm lượng này tăng đột biến khi có sự tăng sinh không bình thường của tế bào biểu mô phế quản. Mặt khác, lượng kháng thể kháng CYFRA21-1 được sản xuất ra chưa nhiều và chưa đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán, điều trị bệnh. Do đó, kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 được một số công ty thương mại hóa trên thị trường với giá thành tương đối cao, điều này đã gây ra không ít khó khăn cho người sử dụng. Tại Việt Nam, đây là vấn đề còn chưa được nghiên cứu nhiều, hiện tại các nhà khoa học Việt Nam vẫn đang tích cực trên đường nghiên cứu về kháng thể tái tổ hợp phục vụ cho nhu cầu chẩn đoán và điều trị bệnh. Do vậy, việc nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 trong UTP là một trong những hướng nghiên cứu mới 3 nhằm chẩn đoán, theo dõi và định hướng điều trị kịp thời bệnh UTP dạng NSCLC, góp phần vào những thành tựu đáng kể trong y học và sinh học. Từ những lý do trên, chúng tôi chọn thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 nhằm phát triển KIT chuẩn đoán ung thư phổi”. 2. Mục tiêu của đề tài Tạo được kháng thể scFv kháng kháng nguyên CYFRA21-1 biểu lộ trên phage để phát triển KIT chẩn đoán sớm UTP dạng NSCLC. 3. Nội dung nghiên cứu - Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 từ bệnh phẩm UTP. - Thu nhận, biểu hiện và tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1. - Gây miễn dịch động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên tái tổ hợp thu nhận được. - Tạo dòng phage biểu lộ kháng thể scFv kháng CYFRA21-1. - Sàng lọc kháng thể scFv biểu lộ trên phage kháng CYFRA21-1. - Sử dụng kháng thể tái tổ hợp thu được để bước đầu xây dựng KIT chẩn đoán UTP. 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ung thư Ung thư là một thuật ngữ dùng để chỉ hơn 200 loại bệnh khác nhau gây ra bởi sự tăng sinh quá mức của tế bào một cách không bình thường. Sự tăng sinh này không tuân theo mọi cơ chế kiểm soát của cơ thể. Đây là kết quả của hàng loạt các biến đổi bất thường trong cơ chế sinh sản của tế bào. Căn cứ vào tính chất giải phẫu bệnh hoặc các cơ quan bị tổn thương, hoặc có thể dựa vào sự khởi phát của tế bào và vị trí của tế bào … người ta phân loại ung thư theo nhiều dạng khác nhau. Nếu căn cứ vào loại tế bào phát sinh, ung thư có thể chia thành các dạng như: ung thư biểu mô, có nguồn gốc từ tế bào biểu mô; ung thư mô liên kết, có nguồn gốc từ các tế bào ở mô liên kết … Tuy nhiên, tất cả các tế bào ung thư trong một khối u (cả tế bào di căn) thường có nguồn gốc chung là xuất phát từ một tế bào ban đầu [2], [3], [8]. Từ đó, việc xác định, nhận biết sớm và chính xác về ung thư là vô cùng cần thiết và quan trọng, bởi khi phát hiện ung thư ở giai đoạn sớm là một trong những điều kiện thuận lợi để điều trị kịp thời cho những bệnh nhân không may mắc phải căn bệnh nguy hiểm này. 1.1.1. Nguồn gốc tế bào ung thư Sự phân chia tế bào là một quá trình sinh lý xảy ra trong những điều kiện nhất định tại hầu hết các mô trong cơ thể sinh vật đa bào nói chung, cơ thể người nói riêng, giúp cho cơ thể tồn tại, sinh trưởng và phát triển. Bình thường, sự cân bằng giữa tốc độ của quá trình tăng sinh tế bào được điều hoà một cách chặt chẽ và chính xác, đảm bảo cho tính toàn vẹn của mô và các cơ quan trong cơ thể. Khi cơ chế này bị rối loạn sẽ xảy ra hiện tượng tế bào tránh được sự chết theo chương trình (apoptosis) và phân chia không có sự kiểm soát là nguyên nhân tạo thành các khối u lành tính hoặc ác tính (ung thư). Khối u lành tính sẽ không có hiện tượng lan tràn đến những vị trí khác nhau 5 trong cơ thể hoặc không có sự xâm lấn đến các mô xung quanh, vì vậy u lành tính hiếm khi ảnh hưởng đến tính mạng bệnh nhân trừ khi chúng chèn ép các cấu trúc sống còn trong cơ thể. Ngược lại, các khối u ác tính thì có thể xâm lấn vào các cơ quan khác nhau trong cơ thể, lan đến những nơi xa hơn trong cơ thể (di căn), do đó sẽ đe dọa trực tiếp đến tính mạng của con người [2], [3], [8]. Vì vậy, di căn có thể được hiểu là yếu tố quan trọng nhất về tính chất ác tính của ung thư. Hai yếu tố quan trọng nhất trong hệ gen dẫn đến ung thư là tích luỹ các đột biến soma và tăng cường tính bất ổn di truyền. Các đột biến này rất nhạy với sự tăng sinh tế bào, nhất là khi chúng kết hợp với nhau thì tế bào có khả năng tăng sinh một cách không thể kiểm soát được [2]. Tính bất ổn di truyền phản ánh số lượng gen trong tế bào ung thư, đó có thể là kết quả của sự nhân lên hay mất đi hoặc sự di chuyển vị trí của DNA trên nhiễm sắc thể. Khi tính bất ổn ở mức độ nhiễm sắc thể có thể tác động đến hệ thống điều khiển sự phân chia tế bào. Như vậy, sinh ung thư là quá trình rối loạn tốc độ phân chia tế bào do tổn thương của DNA, do đó ung thư là một bệnh lý về gen. Thông thường một tế bào bình thường để chuyển sang tế bào ung thư phải qua ít nhất một vài đột biến tại một số gen nhất định. Quá trình này liên quan đến cả hệ thống gen tiền ung thư và gen át chế ung thư [2], [3], [8]. Gen tiền ung thư mã hoá cho nhóm protein tham gia vào quá trình hình thành những chất truyền tin (messenger) trong quá trình dẫn truyền tín hiệu tế bào. Các chất truyền tin này sẽ truyền tín hiệu "tiến hành phân bào" tới chính tế bào đó hay những thế bào khác. Do vậy, khi bị đột biến, các gen tiền ung thư sẽ biểu hiện quá mức (overexpression) làm các tế bào tăng sinh thừa thãi, lúc này trở thành những gen ung thư (cancer genes). Tuy nhiên, các gen ung thư thực chất là dạng đột biến về trình tự hoặc mức độ biểu hiện của các gen cần thiết đối với quá trình phát triển, sửa chữa và ổn định nội môi của cơ thể, 6 do đó không thể loại bỏ các gen này khỏi hệ gen nhằm làm giảm khả năng ung thư [2], [3]. Ngược lại với gen ung thư, các gen át chế ung thư (epistasis cencer g ens) mã hóa cho các chất truyền tin hóa học nhằm giảm hoặc ngừng quá trình phân chia của tế bào khi phát hiện thấy có sai hỏng về DNA. Đó là các enzym đặc biệt có thể phát hiện các đột biến hay tổn thương DNA và đồng thời kích hoạt quá trình phiên mã của hệ thống enzym sửa chữa DNA. Điều này nhằm hạn chế tối đa khả năng các sai hỏng về DNA được truyền cho thế hệ tế bào kế tiếp. Thông thường, các gen áp chế ung thư sẽ được kích hoạt khi có tổn thương DNA xảy ra, nhưng một số đột biến có thể bất hoạt protein áp chế ung thư hoặc làm mất khả năng truyền thông tin của nó. Điều này làm gián đoạn hoặc dừng cơ chế sửa chữa DNA, khi đó những tổn thương DNA được tích luỹ lại dần dần hình thành ung thư [2], [3]. 1.1.2. Đặc điểm tế bào ung thư Tất cả các tế bào ung thư ác tính đều không có tính biệt hoá, điều này được thể hiện qua sự khác nhau giữa chúng với tế bào nguồn gốc ban đầu sinh ra chúng, thậm chí giữa các tế bào ác tính cũng có hình ảnh khác biệt nhau [2], [3], [8]; lúc này, các tế bào ác tính biểu hiện một số đặc điểm sau: Nhân của tế bào ác tính thường khác nhau về hình dạng và kích thước Hạch nhân ở tế bào u ác tính thường nổi rõ và có nhiều hạch nhân Tế bào u ác tính có nhiều dạng phân chia bất thường, lượng tế bào chất rất biến đổi Nhiễm sắc thể thường bị đột biến cả về số lượng và cấu trúc [2], [3]. Từ đó cho thấy các tính chất đặc trưng của tế bào ác tính là: Tránh được sự chết theo chương trình (apoptosis) Khả năng phát triển vô hạn (bất tử) Tự cung cấp các yếu tố phát triển