Tài liệu Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein người

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO Y TEÁ ÑAÏI HOÏC Y DÖÔÏC THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH BOÄ PHAN NGOÏC TIEÁN NGHIEÂN CÖÙU TAÏO KHAÙNG THEÅ ÑÔN DOØNG KHAÙNG ALPHA-FETOPROTEIN NGÖÔØI LUAÄN AÙN TIEÁN SÓ Y HOÏC TP. Hoà Chí Minh – Naêm 2009 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO Y TEÁ ÑAÏI HOÏC Y DÖÔÏC THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH BOÄ PHAN NGOÏC TIEÁN NGHIEÂN CÖÙU TAÏO KHAÙNG THEÅ ÑÔN DOØNG KHAÙNG ALPHA-FETOPROTEIN NGÖÔØI Chuyeân ngaønh: Sinh lyù hoïc Maõ soá: 62 72 04 05 LUAÄN AÙN TIEÁN SÓ Y HOÏC Ngöôøi höôùng daãn khoa hoïc: GS.TS. PHAÏM ÑÌNH LÖÏU TP. Hoà Chí Minh – Naêm 2009 LÔØI CAM ÑOAN Toâi xin cam ñoan ñaây laø coâng trình nghieân cöùu cuûa rieâng toâi. Caùc soá lieäu, keát quaû neâu trong luaän aùn laø trung thöïc vaø chöa töøng ñöôïc ai coâng boá trong baát kì coâng trình naøo khaùc. PHAN NGOÏC TIEÁN MUÏC LUÏC Trang phuï bìa Lôøi camđñoan Trang Muïc luïc Danh muïc caùc kí hieäu, caùc chöõ vieát taét Danh muïc caùc baûng Danh muïc caùc hình veõ, bieåu ñoà, sô ñoà ÑAËT VAÁN ÑEÀ ....................................................................................................1 Chöông 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU.................................................................3 1.1 Khaùng theå ..............................................................................................3 1.2 Khaùng theå ñôn doøng ...........................................................................15 1.3 Ñaïi cöông veà Alpha-fetoprotein ...........................................................28 Chöông 2: ÑOÁI TÖÔÏNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU..............40 2.1 Taïo khaùng theå ñôn doøng khaùng Alpha-fetoprotein ngöôøi ...................40 2.2 Ñaùnh giaù khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP ngöôøi saûn xuaát töø chuoät Lou......................................................................................................53 2.3 ÖÙng duïng böôùc ñaàu khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP ngöôøi ñaõ ñöôïc taïo ra trong ñònh löôïng noàng ñoä AFP huyeát thanh.......................57 Chöông 3: KEÁT QUAÛ..........................................................................................65 3.1 Keát quaû taïo teá baøo lai saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng khaùng Alphafetoprotein ...................................................................................................65 3.2 Ñaùnh giaù khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP ngöôøi saûn xuaát töø chuoät Lou...................................................................................................79 3.3 Keát quaû öùng duïng böôùc ñaàu khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP ngöôøi ñaõ ñöôïc taïo ra trong ñònh löôïng noàng ñoä AFP huyeát thanh................85 Chöông 4: BAØN LUAÄN.....................................................................................101 KEÁT LUAÄN- KIEÁN NGHÒ ...........................................................................119 DANH MUÏC CAÙC COÂNG TRÌNH CUÛA TAÙC GIAÛ ..............................121 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO ..............................................................................122 PHUÏ LUÏC 1 ..........................................................................................................135 PHUÏ LUÏC 2 ..........................................................................................................138 DANH MUÏC CAÙC KYÙ HIEÄU, CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT Ab: Antibody Ag: Antigen AFP: Alpha-fetoprotein AFP-L: heä thoáng ñònh löôïng AFP söû duïng khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP cuûa chuoät LOU FTi3-1-A8: laàn thöïc hieän kyõ thuaät hoaø hôïp teá baøo laàn thöù 3, ñóa nuoâi caáy thöù 3, vò trí gieáng A8 FTi3-3-B4-H6: laàn thöïc hieän kyõ thuaät hoaø hôïp teá baøo laàn thöù 3, ñóa nuoâi caáy thöù 3, vò trí gieáng A8, vò trí gieáng H6 coù teá baøo sau khi pha loaõng giôùi haïn Ig: Immunoglobulin KN: Khaùng nguyeân KT: Khaùng theå MARG1: khaùng theå chuoät nhaét khaùng chuoãi naëng gamma1 cuûa chuoät coáng MARG2a: khaùng theå chuoät nhaét khaùng chuoãi naëng gamma 2a cuûa chuoät coáng MARG2b: khaùng theå chuoät nhaét khaùng chuoãi naëng gamma 2b cuûa chuoät coáng MARG2c: khaùng theå chuoät nhaét khaùng chuoãi naëng gamma 2c cuûa chuoät coáng MARL: khaùng theå chuoät nhaét khaùng chuoãi nheï lamda cuûa chuoät coáng MARK: khaùng theå chuoät nhaét khaùng chuoãi nheï kappa cuûa chuoät coáng DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Trang Baûng 1.1: Caùc ñaëc tính cuûa caùc lôùp khaùng theå ...........................................13 Baûng 1.2: Caùc ñaëc tính cuûa caùc lôùp khaùng theå cuûa chuoät coáng LOU ...16 Baûng 1.3: Caùc doøng teá baøo ung thö ñeå taïo teá baøo lai ................................21 Baûng 1.4: Caùc giaù trò noàng ñoä AFP huyeát thanh xaùc ñònh baèng kyõ thuaät MEIA ôû caùc ñoái töôïng beänh lyù vaø ôû ngöôøi bình thöôøng .................37 Baûng 1.5: Töông quan giöõa möùc taêng AFP maùu meï vôùi nguy cô thai bò dò taät .............................................................................................................................38 Baûng 2.6: Sô ñoà noàng ñoä AFP chuaån töø 0-500ng/ml .....................................55 Baûng 2.7: Sô ñoà noàng ñoä thaáp töø 0-5ng/ml cuûa AFP chuaån .......................56 Baûng 2.8: Sô ñoà thöù töï maãu huyeát thanh ñònh löôïng AFP baèng AFP-L ....60 Baûng 2.9: Sô ñoà thöù töï maãu huyeát thanh ñònh löôïng AFP baèng heä thoáng ñònh löôïng AFP cuûa haõng MaximBiotech .................................................62 Baûng 3.10: Keát quaû maät ñoä quang cuûa ñóa nuoâi caáy 1 ..............................67 Baûng 3.11: Keát quaû maät ñoä quang cuûa ñóa nuoâi caáy 2 ...............................68 Baûng 3.12: Keát quaû maät ñoä quang cuûa ñóa nuoâi caáy 3 ...............................69 Baûng 3.13: Keát quaû maät ñoä quang cuûa ñóa nuoâi caáy 4 ..............................70 Baûng 3.14: Keát quaû ñònh isotype cuûa caùc khaùng theå trong caùc gieáng coù caùc teá baøo lai saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP, söû duïng khaùng nguyeân AFP cuûa Vieän Pasteur Tp.HCM ..............................72 Baûng 3.15: Keát quaû caùc ñôn doøng teá baøo lai saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP ....................................................................................73 Baûng 3.16: Keát quaû phaûn öùng cuûa caùc khaùng theå ñôn doøng vôùi AFP cuûa haõng Calbiochem ...........................................................................79 Baûng 3.17: Keát quaû maät ñoä quang (DO) töông öùng vôùi noàng ñoä AFP cuûa AFP-L.......................................................................................................80 Baûng 3.18: Keát quaû maät ñoä quang (DO) töông öùng vôùi nhöõng giaù trò thaáp cuûa noàng ñoä AFP, cuûa AFP-L..........................................................83 Baûng 3.19: Keát quaû noàng ñoä AFP trong caùc maãu huyeát thanh ñònh löôïng baèng heä thoáng ñònh löôïng AFP-L...................................................85 Baûng 3.20: Giaù trò trung bình noàng ñoä AFP trong caùc maãu huyeát thanh baèng heä thoáng ñònh löôïng AFP döïa treân khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP cuûa chuoät Lou...........................................................................86 Baûng 3.21: Keát quaû DO töông öùng vôùi noàng ñoä AFP chuaån cuûa haõng Maxim Biotech .................................................................................................87 Baûng 3.22: Keát quaû noàng ñoä AFP trong caùc maãu huyeát thanh ñònh löôïng baèng heä thoáng ñònh löôïng AFP cuaû haõng Maxim Biotech....................88 Baûng 3.23: Giaù trò trung bình noàng ñoä noàng ñoä AFP trong caùc maãu huyeát thanh ñònh löôïng baèng heä thoáng ñònh löôïng AFP cuaû haõng Maxim Biotech .................................................................................................89 Baûng 3.24: Keát quaû noàng ñoä AFP trong caùc maãu huyeát thanh ñònh löôïng baèng heä thoáng ñònh löôïng AFP cuûa haõng Abbott ..................................90 Baûng 3.25: Giaù trò trung bình noàng ñoä AFP trong caùc maãu huyeát thanh ñònh löôïng baèng heä thoáng ñònh löôïng AFP cuûa haõng Abbott........................91 Baûng 3.26 a: Baûng keát quaû noàng ñoä AFP (ng/ml) trong maãu huyeát thanh cuûa hai heä thoáng ñònh löôïng AFP-L vaø Maxim Biotech ..................................92 Baûng 3.26 b: Baûng so saùnh keát quaû noàng ñoä AFP (ng/ml) trong maãu huyeát thanh cuûa hai heä thoáng ñònh löôïng AFP-L vaø Maxim Biotech................93 Baûng 3.27: Baûng so saùnh noàng ñoä AFP (ng/ml) trong maãu huyeát thanh u gan cuûa hai heä thoáng ñònh löôïng AFP-L vaø Maxim Biotech ..........................94 Baûng 3.28: Baûng so saùnh noàng ñoä AFP (ng/ml) trong maãu huyeát thanh cuûa hai heä thoáng ñònh löôïng AFP-L vaø Abbott ...............................................95 Baûng 3.29 a: Baûng keát quaû noàng ñoä AFP (ng/ml) trong maãu huyeát thanh u gan cuûa hai heä thoáng ñònh löôïng AFP-L vaø Abbott.................................97 Baûng 3.29 b: Baûng so saùnh keát quaû noàng ñoä AFP (ng/ml) trong maãu huyeát thanh u gan cuûa hai heä thoáng ñònh löôïng AFP-L vaø Abbott ....................97 Baûng 4.30: Caùc doøng teá baøo ung thö ñeå taïo teá baøo lai ............................101 Baûng 4.31: Chuoät LOU/C vaø allotype cuûa chuoãi nheï kappa ........................106 Baûng 4.32: So saùnh vôùi caùc heä thoáng ñònh löôïng AFP ..............................111 DANH MUÏC CAÙC HÌNH VEÕ, BIEÅU ÑOÀ, SÔ ÑOÀ Trang Hình 1.1: Söï di chuyeån cuûa caùc lôùp khaùng theå treân ñieän di protein ............3 Hình 1.2: Caáu truùc lónh vöïc cuûa chuoãi naëng vaø chuoãi nheï ..........................5 Hình 1.3: Caáu truùc caùc phaân töû khaùng theå......................................................7 Hình 1.4: Caáu truùc phaân töû AFP ngöôøi ...........................................................29 Hình 1.5: Caáu truùc phaân töû AFP vaø Albumin ngöôøi .....................................29 Hình 3.6: Taïo khoái u teá baøo lai ôû oå buïng chuoät ...........................................74 Hình 3.7: Taïo dòch baùng oå buïng chuoät .............................................................74 Hình 3.8: Ñieän di protein dòch baùng oå buïng chuoät laàn 1................................75 Hình 3.9: Ñieän di protein dòch baùng oå buïng chuoät laàn 2................................75 Hình 3.10: Ñieän di protein dòch baùng oå buïng chuoät laàn 3..............................76 Hình 3.11: Maùy saéc kyù ........................................................................................77 Hình 3.12: Khaùng theå ñôn doøng khaùng AFP ñöôïc baûo quaûn........................78 Bieåu ñoà 3.1: Ñöôøng bieåu dieãn keát quaû saéc kyù ...........................................77 Bieåu ñoà 3.2: Giaù trò trung bình noàng ñoä AFP cuûa hai heä thoáng ñònh löôïng AFP-L vaø Maxim Biotech ôû nhoùm ngöôøi bình thöôøng ...........................98 Bieåu ñoà 3.3: Giaù trò trung bình noàng ñoä AFP cuûa hai heä thoáng ñònh löôïng AFP-L vaø Maxim Biotech ôû nhoùm ngöôøi coù HBsAg (+) ........................99 Bieåu ñoà 3.4: Giaù trò trung bình noàng ñoä AFP cuûa ba heä thoáng ñònh löôïng AFP-L, Maxim Biotech vaø Abbott ôûû nhoùm ngöôøi vieâm gan sieâu vi B caáp ...................................................................................................................100 Bieåu ñoà 4.5: Keát quaû saéc kyù aùi löïc duøng khaùng theå ñôn doøng khaùng khaùng theå ñôn doøng chuoät coáng........................................................................108 Sô ñoà1.1: Saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng.........................................................15 Ñoà thò 3.1: Ñoà thò noàng ñoä AFP chuaån vaø DO töông öùng cuûa AFP-L......81 Ñoà thò 3.2: Ñöôøng cong chuaån cuûa heä thoáng ñònh löôïng AFP-L.................82 Ñoà thò 3.3: Ñöôøng bieåu dieãn DO töông öùng vôùi nhöõng giaù trò thaáp cuûa noàng ñoä AFP cuûa AFP-L ........................................................................................84 Ñoà thò 3.4: Ñöôøng cong chuaån cuûa heä thoáng ñònh löôïng AFP cuûa haõng Maxim Biotech..................................................................................................87 Ñoà thò 4.5: Ñöôøng cong chuaån cuûa heä thoáng ñònh löôïng AFP-L...............110 1 ÑAËT VAÁN ÑEÀ Kyõ thuaät saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng ñaõ ñöôïc hai nhaø khoa hoïc Georges Kohler vaø Ceùsar Milstein trình baøy naêm 1975 [1],[23],[25],[30],[57],[98] kyõ thuaät naøy nhaèm taïo ra teá baøo lai töø hai teá baøo, teá baøo lymphoâ B saûn xuaát khaùng theå khaùng vôùi khaùng nguyeân ñaõ ñöôïc choïn tröôùc, vaø teá baøo ung thö vôùi ñaëc tính phaùt trieån voâ haïn. Töø moät teá baøo lai seõ taïo ra moät doøng teá baøo coù ñaëc tính phaùt trieån voâ haïn vaø saûn xuaát ra doøng khaùng theå coù cuøng ñaëc tính khaùng laïi khaùng nguyeân ñaõ ñöôïc maãn caûm tröôùc. Khaùng theå ñôn doøng coù tính ñoàng nhaát cao vaø raát ñaëc hieäu vôùi khaùng nguyeân [30], [57], [98]. Hieän nay caùc nhaø khoa hoïc treân theá giôùi ñaõ taïo ra nhieàu doøng teá baøo ung thö khaùc nhau ñeå thöïc hieän kyõ thuaät hôïp nhaát teá baøo, vaø doøng chuoät thuaàn chuûng ñeå saûn xuaát khaùng theå ñôn doøng [39],[98]. Caùc nhaø khoa hoïc taïi tröôøng ñaïi hoïc UCL (Universite Catholique de Louvain) ñaõ taïo ra doøng teá baøo ung thö IR983F vaø doøng chuoät coáng LOU ñeå saûn xuaát caùc khaùng theå ñôn doøng [39]. Nhôø vaøo kyõ thuaät saûn xuaát ra khaùng theå ñôn doøng töø ñoù ñeán nay ñaõ taïo ra raát nhieàu khaùng theå ñôn doøng khaùng caùc khaùng nguyeân khaùc nhau, töø ñoù coù nhieàu öùng duïng trong nhaän dieän, ñònh löôïng khaùng nguyeân, vaø ñaëc bieät trong chaån ñoaùn vaø ñieàu trò. Alpha-fetoprotein laø moät glycoprotein, coù troïng löôïng phaân töû khoaûng 68.000 dalton, ñöôïc toång hôïp ôû gan phoâi thai vaø tuùi noaõn hoaøng, noàng ñoä AFP bình thöôøng trong dòch oái vaø huyeát thanh baøo thai ngöôøi raát cao (trong dòch oái laø 10g/ml; trong huyeát thanh baøo thai laø 1-3mg/ml). Alpha-fetoprotein coù trong huyeát thanh ngöôøi sau sinh vaø ngöôøi tröôûng thaønh ôû noàng ñoä raát thaáp, chæ khoaûng 3ng/ml [47],[64]. Trong beänh lyù ung thö teá baøo gan nguyeân phaùt, Alpha-fetoprotein taêng raát cao trong huyeát thanh, vaø vieäc ñònh löôïng AFP huyeát thanh coù yù 2 nghóa laâm saøng quan troïng giuùp chaån ñoaùn sôùm vaø theo doõi tieán trieån cuûa ung thö teá baøo gan nguyeân phaùt[7],[8],[29],[32],[35],[48],[84]. Ngoaøi ra trong saûn khoa vieäc ñònh löôïng Alpha-fetoprotein cuøng vôùi caùc xeùt nghieäm khaùc ñeå giuùp chaån ñoaùn dò taät thai nhi [28],[46],[82], [89],[95],[96]. Thöïc tieån Vieät Nam vieäc taïo ra khaùng theå ñôn doøng khaùng Alphafetoprotein ngöôøi coù yù nghóa quan troïng, vì töø khaùng theå ñôn doøng naøy coù theå ñònh löôïng Alpha-fetoprotein trong huyeát thanh, vaø vôùi kyõ thuaät naøy seõ taïo ra nhieàu khaùng theå ñôn doøng khaùng caùc khaùng nguyeân khaùc nhau öùng duïng trong chaån ñoaùn vaø ñieàu trò, giuùp cho nghieân cöùu y sinh hoïc, mieãn dòch hoïc, thuù y… Töø nhöõng vaán ñeà neâu treân, nghieân cöùu thöïc hieän taïo ra khaùng theå ñôn doøng khaùng Alpha-fetoprotein vôùi kyõ thuaät lai töø doøng teá baøo ung thö IR983F vaø teá baøo lymphoâ B chuoät coáng LOU, ñeå coù theå öùng duïng trong vieäc ñònh löôïng Alpha-fetoprotein. MUÏC TIEÂU NGHIEÂN CÖÙU: 1. Taïo khaùng theå ñôn doøng khaùng Alpha-fetoprotein ngöôøi. 2. Ñaùnh giaù chaát löôïng khaùng theå ñôn doøng khaùng Alpha-fetoprotein ngöôøi ñaõ ñöôïc taïo ra. 3. ÖÙng duïng böôùc ñaàu khaùng theå ñôn doøng khaùng Alpha-fetoprotein ngöôøi ñaõ ñöôïc taïo ra trong ñònh löôïng Alpha-fetoprotein huyeát thanh. 3 CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1.1. KHAÙNG THEÅ 1.1.1 Caáu truùc: Töø globulin mieãn dòch (Immunoglobulin = Ig) chính xaùc hôn gammaglobulin, vì phaàn lôùn caùc khaùng theå coù khaû naêng di chuyeån trong ñieän tröôøng tôùi vuøng γ, moät soá khaùng theå ñi ñeán vuøng β hay ôû vuøng α 2 globulin [1],[23]. Hình 1.1: Söï di chuyeån cuûa caùc lôùp khaùng theå treân ñieän di protein [23] 1.1.1.1 Caáu truùc khaùng theå[1],[23],[25],[30],[48],[58]: Nhôø caùc coâng trình cuûa Porter vaø Edelman ñaõ xaùc ñònh ñöôïc caáu truùc cuûa moät phaân töû khaùng theå, ví duï IgG1. Khaùng theå (KT) goàm coù 2 chuoãi naëng gioáng nhau vaø 2 chuoãi nheï gioáng nhau noái laïi vôùi nhau baèng nhöõng caàu noái 2S giöõa caùc chuoãi. Sô ñoà caáu truùc cuûa moät phaân töû KT coù ñöôïc laø nhôø vaøo caùc thí nghieäm sau: 4 Taùc duïng cuûa dimercaptoethanol laø phaù caùc caàu 2S, töø moät IgG coù troïng löôïng phaân töû 150000D thu ñöôïc 2 ñoâi ña peptit: moät ñöôïc goïi laø chuoãi naëng (H = heavy chain) coù khoaûng 450 axit amin (TLPT = 50000D) vaø moät chuoãi nheï (L = light chain) vôùi 212 axit amin (TLPT = 25000D). Taùc duïng cuûa papain, men naøy caét chuoãi naëng ôû choã axit amin thöù 224 treân 2 caàu 2S noái caùc chuoãi naëng vôùi nhau vaø cho 2 maûnh gioáng nhau goïi laø Fab (Fragment antibody binding) vaø 1 maûnh Fc (Fragment crystallisable). Taùc duïng cuûa pepsin, men naøy caét chuoãi naëng ôû gaàn axit amin 234 beân döôùi caàu noái 2S vaø ôû nhöõng choã khaùc giöõa caùc axit amin 294 vaø 333. Keát quaû laø thu ñöôïc moät maûnh lôùn goïi laø F(ab’)2 vaø nhieàu polypeptit khaùc cuõng nhö maûnh pFc’ töông öùng vôùi khu vöïc taän cuøng cuûa chuoãi. Teân goïi cho caùc maûnh khaùc nhau cuûa Ig thu ñöôïc ôû caùc thí nghieäm treân nhö sau: - Fab: laø moät nöûa chuoãi naëng noái vôùi caû chuoãi nheï baèng moät caàu 2S, do Ig bò papain caét ôû ngay treân vuøng baûn leà, neân chæ mang moät vò trí KT. - F(ab’)2: coù ñöôïc döôùi taùc duïng cuûa pepsin, goàm 2 Fab vôùi phaàn baûn leà neân thaønh moät maûnh lôùn hôn 2 laàn Fab vaø coù chöùa 2 vò trí KT. - Fc: laø nöûa sau cuûa 2 chuoãi naëng coøn noái vôùi nhau baèng caàu noái 2S giöõa chuoãi. - pFc’: maûnh naøy goàm nhöõng peptit coù ñöôïc do taùc duïng cuûa pepsin, vôùi toaøn khu vöïc CH3 ñaèng sau axit amin thöù 333 treân chuoãi naëng. - Fd: töông öùng vôùi phaàn ñaàu cuûa chuoãi naëng, coù ñöôïc baèng caùch khöû vaø alkyl hoùa maûnh Fab ñeå loaïi boû chuoãi nheï. 5 - Fv: maûnh naøy töông öùng vôùi caùc phaàn thay ñoåi cuûa chuoãi naëng vaø chuoãi nheï(VH + VL). Hình 1.2: Caáu truùc lónh vöïc cuûa chuoãi naëng vaø chuoãi nheï[30] 1.1.1.2 Lónh vöïc cuûa caùc khaùng theå Laø caáu truùc ñöôïc thaáy ñi thaáy laïi nhieàu laàn trong caùc Ig cuõng nhö trong moät soá protein khaùc. Treân khoaûng 130 axit amin, moät caàu noái 2S beân trong chuoãi, taïo ra moät caáu truùc voøng töø 60 ñeán 70 axit amin goïi laø lónh vöïc (domain). 6 Ñoái vôùi chuoãi naëng cuûa Ig thì söï hình thaønh lónh vöïc noùi treân ñöôïc thaáy 4 laàn vôùi IgG, IgA, IgD vaø 5 laàn vôùi IgM, IgE vaø 2 laàn vôùi caùc chuoãi nheï. - VH (variable heavy) laø “vuøng thay ñoåi cuûa chuoãi naëng” - CH1, CH2, CH3 vaø caû CH4 (constant heavy) laø “vuøng haèng ñònh cuûa chuoãi naëng” raát khaùc nhau khoâng chæ cho moãi moät lôùp vaø caû cho caùc döôùi lôùp, vôùi IgG1 coù 3 döôùi lôùp laø C γ11, Cγ12, Cγ13, hay vôùi IgM coù 4 döôùi lôùp Cµ1, Cµ2, Cµ3, Cµ4. Ñoái vôùi chuoãi nheï laø: - VL (variable light) laø “vuøng thay ñoåi cuûa chuoãi nheï”, chuoãi Kappa (Vκ) vaø chuoãi Lamda (Vλ). - CL (constant light) laø “vuøng haèng ñònh cuûa chuoãi nheï” vôùi Cκ vaø Cλ. Trong caáu truùc saâu hôn: Trong chuoãi naëng - Vuøng thay ñoåi VH 110 axit amin (töø 107 ñeán 112) coù 3 vuøng cöïc kyø thay ñoåi goïi laø CDR (Complementary Determinating Region), vuøng mang tính chaát boå sung vôùi epitoâp KN. - Vuøng töông ñoái haèng ñònh goïi laø vuøng khung FR (Framework Region), trình töï axit amin cuûa vuøng naøy ít thay ñoåi hôn. - CH1, tieáp noái vôùi VH, laø lónh vöïc haèng ñònh neân trình töï axit amin khoâng thay ñoåi, coù theå coù thay ñoåi vaøi axit amin quyeát ñònh caùc allotype. - Vuøng baûn leà, laø axit amin naèm giöõa CH1 vaø CH2, coù mang caùc caàu noái 2S giöõa chuoãi naëng, vuøng naøy coù tính meàm deûo, cho pheùp chuùng gaäp môû ñöôïc theo moät goùc thay ñoåi ñeå keát hôïp vôùi KN. - CH2 vaø CH3, tieáp vôùi CH1 vaø cuõng nhö CH1 chæ coù moät soá thay ñoåi allotype cho moät soá döôùi lôùp. Trong chuoãi nheï 7 Cuõng nhö ñaõ thaáy ôû chuoãi naëng. Caùc vuøng cöïc kyø thay ñoåi naèm ñoái dieän ngay vôùi vuøng töông öùng cuûa VH taïo neân vò trí keát hôïp KN. Cκ hay Cλ, 2/3 chuoãi nheï laø Kappa vaø 1/3 laø Lamda ôû trong taát caû caùc lôùp khaùng theå. 1.1.2 Caùc lôùp khaùng theå hay isotype: Döïa vaøo caáu truùc vaø baûn chaát cuûa khaùng theå maø ngöôøi ta chia ra laøm 5 lôùp: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD [1],[25],[30]. Hình 1.3: Caáu truùc caùc phaân töû khaùng theå [30] 1.1.2.1 IgG 8 Caû 4 döôùi lôùp cuûa IgG coù moät caáu truùc raát gaàn nhau neân heä soá laéng ñeàu 7S, TLPT chung 146000, TLPT cuûa IgG3 laø 170000, ñeàu coù 3 lónh vöïc haèng ñònh cho moãi chuoãi naëng, vaø tæ leä carbon hydrat thaáp (2 ñeán 3 %). Noàng ñoä chung cuûa IgG trong maùu khoaûng 11 g/l, trong ñoù IgG1 chieám 66%, IgG2: 23%, IgG3: 7% vaø IgG4: 4% . 1.1.2.2 IgM IgM maøng (mIgM, hoaëc sIgM) coù treân caùc teá baøo lymphoâ B, laø monome maø phaàn ñuoâi laø caùc axit amin ñaëc bieät töø 556 ñeán 597 goàm moät phaàn kî nöôùc xuyeân qua maøng. IgM ñöôïc tieát ra ngoaøi thì goàm moät chuoãi naëng vôùi 4 lónh vöïc haèng ñònh vaø raát giaøu carbon hydrat (12%). Phaân töû IgM laø moät pentame (5 ñôn vò) vôùi moät caàu noái 2S thaønh voøng ôû cuoái Cµ3 vaø moät voøng thöù hai ôû cuoái Cµ4 vaø cuoái cuøng moät chuoãi noái J (joining chain). IgM coù TLPT cao (970000 D), heä soá laéng laø 19S, vaø noàng ñoä trong huyeát thanh 1,2g/l. 1.1.2.3 IgA IgA huyeát thanh goàm IgA1 (80%) vaø IgA2 (20%) ôû daïng monome (TLPT 160000 D) hoaëc dime, loaïi dime noái vôùi nhau baèng chuoãi noái J. Noàng ñoä IgA trong maùu 2,4g/l. IgA tieát ra ngoaøi cuõng coù 2 döôùi lôùp IgA1 vaø IgA2, coù TLPT 400000 vôùi heä soá laéng laø 11S. IgA goàm 2 ñôn vò keát hôïp vôùi nhau nhôø moät maûnh noái J, caû toå hôïp ñöôïc bao bôûi moät maûnh tieát (SP = secretory piece), do caùc teá baøo bieåu moâ nieâm maïc toång hôïp rieâng roài gaén vaøo phaân töû IgA dime khi chuùng ñi qua nieâm maïc. 1.1.2.4 IgD Löôïng IgD trong huyeát thanh raát thaáp maø vai troø cuõng chöa roõ. Ngöôøi ta thöôøng thaáy IgD ôû treân beà maët cuûa teá baøo lymphoâ B lieân keát 9 vôùi mIgM, do ñoù IgD coù theå giöõ chöùc naêng thuï theå (receptor) cuûa quaù trình bieät hoùa vaø trí nhôù teá baøo. 1.1.2.5 IgE Noàng ñoä cuûa IgE trong huyeát thanh raát thaáp 0,0001g/l, IgE coá ñònh treân caùc teá baøo öa kieàm vaø teá baøo mast neân coù vai troø quan troïng trong dò öùng vaø quaù maãn töùc thì. IgE coù 4 lónh vöïc haèng ñònh, vôùi TLPT 190000 vaø heä soá laéng laø 8S. 1.1.3 Caùc nhoùm quyeát ñònh khaùng nguyeân cuûa khaùng theå Neáu coi khaùng theå nhö laø khaùng nguyeân thì chuùng coù 3 type khaùc nhau veà quyeát ñònh khaùng nguyeân hay coøn goïi laø daáu aán khaùng nguyeân. 1.1.3.1 Nhoùm quyeát ñònh isotype Caùc nhoùm quyeát ñònh isotype, xaùc ñònh baèng khaùng theå khaùng isotype, ñöôïc thaáy ôû moïi caù theå trong cuøng moät loaøi. Chuùng hình thaønh trong quaù trình bieät hoùa caùc loaøi neân ñöôïc coi laø ñaëc thuø cuûa moãi loaøi. Coù theå coù ñöôïc caùc khaùng theå khaùng isotype ngöôøi baèng caùch tieâm cho con vaät (thoû) Ig ña hay ñôn doøng cuûa ngöôøi. 1.1.3.2 Nhoùm quyeát ñònh allotype Ngöôøi ta thaáy coù nhöõng ñaëc ñieåm khaùng nguyeân ôû moät soá caù theå trong cuøng moät loaøi, do coù khaùc bieät töø 1 ñeán 3 axit amin ôû chuoãi CH vaø CL. Ôû vaät thí nghieäm coù theå coù ñöôïc khaùng theå khaùng allotype tinh khieát sau khi maãn caûm vôùi huyeát thanh cuøng loaøi roài haáp thuï noù vôùi caùc khaùng theå khaùng isotype. Caùch ñaët teân caùc heä thoáng allotype: laáy chöõ ñaàu cuûa lôùp khaùng theå vaø theâm con soá cuûa döôùi lôùp, tieáp sau ñoù laø chöõ m vieát taét cho töø daáu aán (marker) nhö sau: Heä thoáng Gm laø allotype cuûa IgG. Caùc ñaëc tính naøy naèm ôû phaàn CH cuûa caùc döôùi lôùp IgG1, IgG2 vaø IgG3 cho neân ngöôøi ta goïi laø G1m, G2m vaø G3m. Khoâng coù allotype naøo ôû IgG4. 10 Heä thoáng Km. Chuoãi nheï Kappa coù 3 tính traïng Km1, Km2, Km3. 1.1.3.3 Nhoùm quyeát ñònh idiotype Theo ñònh nghóa ban ñaàu thì tính chaát KN naøy laø ñaëc thuø cuûa quaù trình maãn caûm xaûy ra ôû con vaät ñaõ coù saûn xuaát KT. Oudin ôû vieän Pasteur Paris ñaõ thu ñöôïc khaùng theå khaùng idiotype ñaàu tieân: gaây maãn caûm thoû choáng Salmonella vaø thu ñöôïc khaùng theå ñaàu goïi laø Ab1 (KT soá 1) khaùng Salmonella. Roài ôû con thoû thöù 2, duøng chính khaùng theå soá 1 aáy ñeå maãn caûm vaø thu ñöôïc KT soá 2 (Ab2) hay laø khaùng-khaùng Salmonella. KT soá 2 naøy chæ nhaän bieát: - KT soá 1 cuûa con vaät thöù nhaát sau khi ñaõ maãn caûm. - Khoâng nhaän bieát huyeát thanh cuûa con vaät thöù nhaát khi chöa maãn caûm. - Khoâng nhaän bieát huyeát thanh cuûa nhöõng con vaät khaùc duø cuõng ñaõ ñöôïc maãn caûm vôùi Salmonella. Niels JERNE (1974) ñaõ ñeà xuaát lyù thuyeát maïng löôùi idiotype (idiotype vaø khaùng idiotype). Neáu vieäc ñöa moät KN vaøo trong cô theå maø gaây ra moät ñaùp öùng Ab1 quaù möùc thì seõ ñöôïc caân baèng bôûi söï saûn xuaát Ab2. Maïng löôùi idiotype ñaõ giaûi thích ñaùp öùng mieãn dòch vaø söï ñieàu hoøa cuûa ñaùp öùng mieãn dòch. 1.1.4 Khaùng theå ña doøng vaø ñôn doøng Töø doøng chæ taát caû caùc teá baøo xuaát phaùt töø moät teá baøo . 1.1.4.1 Khaùng theå ña doøng. Bình thöôøng moät ñaùp öùng mieãn dòch laø moät ñaùp öùng ña doøng, trong ñoù ngöôøi ta thaáy laø caùc khaùng theå goàm coù: - Caùc lôùp vaø döôùi lôùp khaùng theå khaùc nhau: IgM, IgG,… - Hai allotype neáu caù theå laø dò hôïp tö.û - Caùc tính ñaëc hieäu khaùc nhau ñoái vôùi cuøng moät KN: do nhaän bieát caùc eâpitoáp khaùc nhau.