Tài liệu Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo của cây địa lan (cymbidium sp.)

MỞ ĐẦU Việt nam là đất nước thích hợp cho việc sinh trưởng của các loài lan nhiệt đới, cho hoa đa dạng. Phần lớn các loại lan đều có trong danh sách của Hiệp hội Thương mại Quốc tế về Các loài Quý hiếm (Convention on International Trade of Endangered Species - CITEs), trong đó có Cymbidium, loại địa lan cho hoa bền và đẹp, có giá trị thương mại cao. Tuy nhiên, nhiều loài lan đang có xu hướng tuyệt chủng do tốc độ khai thác cũng như nhu cầu tiêu thụ quá cao. Trong nhân giống các loài địa lan lại có một vấn đề gặp phải là hạt lan rất bé, phôi chưa phân hoá và không có phôi nhũ cũng như các enzyme để cung cấp, chuyển hoá chất dinh dưỡng cho hạt phát triển nên rất khó nảy mầm trong tự nhiên. Ngoài ra, nhu cầu tiêu thụ nội địa và xuất khẩu địa lan hiện nay rất cao và nhu cầu trồng địa lan ngày càng gia tăng. Vì vậy, vấn đề nhân giống và bảo tồn địa lan là cấp thiết. Nhân giống địa lan thường được thực hiện bằng con đường nuôi cấy mô thực vật với quá trình nhân giống cần liên tục và định kỳ vô mẫu lại ban đầu đã làm tăng chi phí cũng như hiệu quả đầu tư. Sản xuất hạt nhân tạo với mầm hạt là phôi sinh dưỡng đã khắc phục được vấn đề này trong việc chủ động sản xuất hạt giống từ phôi sinh dưỡng và góp phần mở ra triển vọng mới trong công nghệ sinh học, nghiên cứu tế bào học thực vật với nhiều công trình trên các đối tượng thực vật như: nho, mía, lan hồ điệp... Nghiên cứu hình thành và phát triển cây con từ hạt nhân tạo, bảo quản hạt nhân tạo địa lan là mục đích chính trong công tác nhân giống và bảo tồn chất lượng giống địa lan. Đề tài “Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo của cây địa lan (Cymbidium sp.)” được thực hiện với mục tiêu: 1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây địa lan để tạo giống sạch bệnh và làm nguyên liệu cho các thí nghiệm hình thành phôi sinh dưỡng. 2. Nghiên cứu phương pháp hình thành phôi sinh dưỡng của cây địa lan. 3. Nghiên cứu phương pháp nhân phôi sinh dưỡng của cây địa lan. 4. Nghiên cứu nguyên liệu phôi và loại vỏ bọc thích hợp để tạo hạt nhân tạo địa lan. 1 5. Nghiên cứu khả năng sống sót và nảy mầm của hạt nhân tạo địa lan trong điều kiện in vitro và ex vitro. 6. Nghiên cứu các biện pháp bảo quản thích hợp đối với hạt nhân tạo địa lan. 7. Nghiên cứu khả năng sống sót và nảy mầm của hạt nhân tạo địa lan trong điều kiện in vitro và ex vitro sau khi hạt được bảo quản. Về mặt khoa học, luận án trình bày một số vấn đề liên quan đến phôi sinh dưỡng và hạt nhân tạo như: sự phát sinh phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng, sự phát sinh mô sẹo, sự hình thành phôi sinh dưỡng và PLB ở địa lan, các yếu tố trong hình thành và nhân phôi cũng như việc tạo và bảo quản hạt nhân tạo từ phôi địa lan mà lần đầu tiên được nghiên cứu một cách hệ thống. Về mặt thực tiễn, việc tạo và bảo quản hạt nhân tạo đưa ra hướng sản xuất mới: sản xuất chủ động hạt giống từ phôi sinh dưỡng với tiềm năng hạt giống mang tính đồng nhất và có thể tạo tiền đề ứng dụng trong sản xuất giống đồng loạt, góp phần trong công tác sản xuất giống và bảo tồn nguồn gene. Những điểm mới của luận án: 1. Nghiên cứu sự hình thành phôi sinh dưỡng địa lan từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng và từ mô sẹo có khả năng phát sinh phôi. 2. Nghiên cứu sự hình thành PLB từ phôi sinh dưỡng với các biến đổi hình thái học và sử dụng phôi sinh dưỡng làm vật liệu trong việc tạo hạt nhân tạo địa lan. 3. Nghiên cứu một cách hệ thống sự hình thành và nuôi trồng hạt nhân tạo địa lan. Sự hình thành phôi sinh dưỡng, đặc biệt là sự hình thành phôi sinh dưỡng họ Lan (Orchidaceae) với các giai đoạn phát triển của phôi lan, rất được các nhà sinh học thực vật trên thế giới hết sức quan tâm và trong luận án này, việc nghiên cứu và chứng minh sự hình thành phôi sinh dưỡng và PLB phát triển từ phôi sinh dưỡng địa lan đã được thực hiện dưới các khía cạnh phát sinh hình thái nhằm ứng dụng có hiệu quả trong sự vi nhân giống thực vật. Điều này lại càng có giá trị đối với địa lan, giống cây quý nhưng có lối thụ phấn nhờ sâu bọ và khó nhân giống. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ĐỊA LAN (CYMBIDIUM) 1.1.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae, Ngành: Angiospermatophyta, lớp: Monocotyledoneae, bộ: Orchidales, họ: Orchidaceae, chi: Cymbidium, loài: Cymbidium spp. Lan (Orchidaceae) là họ lớn nhất trong các cây một lá mầm với 800 chi và 35.000 loài trong đó chi Cymbidium có khoảng 60 loài. Đây cũng được xem là họ phát triển nhất trong khả năng sống sót. Hiện nay, có khoảng 150.000 loài lan lai có thể sản xuất và đăng ký. Các loài lan trong hệ thống này phân bố rất rộng, vì vậy, hình thái và cấu tạo cũng hết sức phức tạp và đa dạng [46], [99], [122], [216]. 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố Với những điểm nổi bật cả về giá trị khoa học lẫn giá trị nghệ thuật, địa lan (Cymbidium) được mệnh danh là nữ hoàng của các loại lan. Đây là một trong những loài lan được nuôi trồng sớm nhất (cách đây khoảng 2500 - 3000 năm ở Trung Quốc) với dáng vẻ giản dị nhưng thanh nhã của cây và mùi hương dịu dàng của hoa [36]. Đặc biệt, năm 1994, De Clercq đã đưa ra một khám phá thú vị rằng hoạt tính mannos–lectins đặc hiệu có trong địa lan và một số loài lan khác có khả năng ngăn chặn một cách có chọn lọc đối với virus HIV [54]. Chi Cymbidium có nguồn gốc Đông Nam Á và Nam Á, phân bố từ dãy Hymalaya đến Nam Trung Quốc, các nước Đông Dương, Thái Lan, Ấn Độ, Nhật, Úc… Ở Việt Nam, địa lan được trồng nhiều ở vùng Tây nguyên và Sa Pa. Đà Lạt là nơi lý tưởng để trồng loại lan này, cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước một lượng lớn lan cắt cành và lan chậu. Tuy nhiên, ở nước ta, nghề trồng lan trong đó có địa lan vẫn chưa được xem là một ngành kinh tế quan trọng như một số nước Âu, Mỹ, Thái Lan, Úc [3]. 1.1.3. Đặc điểm hình thái – đặc trưng của lan Cymbidium (C.) thuộc nhóm lan đa thân, là loài cây đa niên, đẻ nhánh hàng năm tạo bụi nhỏ, có thể sinh trưởng bì sinh, trên đá hay trong đất. C. macrorhizon, một loại lan hoại sinh, sinh sống hoàn toàn dưới bề mặt đất, trừ khi nhú phát hoa. C. 3 ensifolium, C. goeringii, C. sinense... thường được trồng rộng rãi. Các loài lan lai thường hình thành từ các loài này với những giống cho hoa đẹp, màu sắc phong phú [3]. Thân ngầm của lan (căn hành) thường ngắn, nối những củ lan lại với nhau. Các củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành gọi là giả hành. Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thỏng. Chiều dài của phát hoa từ 10 cm đến hơn 100 cm. Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luân phiên theo đường xoắn ốc. Búp hoa khi đã đủ lớn bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa, xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống dưới rồi bắt đầu nở hoa. Thoạt nhìn, hoa Cymbidium có năm cánh gần giống nhau nhưng thực ra chỉ có hai cánh hoa ở bên trong, còn lại là ba lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc và màu sắc giống cánh hoa. Cánh hoa thứ ba chuyên hóa thành cánh môi, có màu sắc rực rỡ hơn [2], [15]. Hoa Cymbidium lưỡng tính, nhị và nhụy cùng gắn chung trên một trụ nhịnhụy hình bán trụ hơi cong về phía trước. Nhị ở trên cùng mang hai khối phấn màu vàng, có gót dính như keo. Khối phấn được đậy bởi một nắp màu trắng ngà dễ mở rời. Hộc chứa phấn khối của trục hợp nhụy cách với núm nhụy bởi một cái gờ nổi lên. Cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên hoa Cymbidium chỉ thụ phấn được nhờ côn trùng [3]. Ngoài 12 loài tự nhiên (như lan Đoản kiếm - Cymbidium aloifolium Swartz), Thanh lan - Cymbidium cyperifolium), một số giống địa lan trồng phổ biến tại Việt Nam hầu hết là lan lai với khả năng cho hoa to, cánh dày, bền và đẹp (Cam lửa, Vầng trăng, Xanh Chiểu, Xanh Thơm...). Về tế bào học, số nhiễm sắc thể lưỡng bội của các loài Cymbidium khoảng 40. Ngoại trừ một vài loài tam bội hay tứ bội như C. insigne 'Bieri' (2n = 60), C. floribundum 'Geshohen' (2n = 80) hay C. floribundum 'Yoshina' (2n = 60) [254]. Là một loại lan thích hợp với khí hậu vùng núi cao, vì vậy, các yếu tố sinh thái thường phù hợp với Cymbidium là: nhiệt độ từ 7 - 27οC, tối thích ở 13 - 24οC. Ở những vùng có địa hình thấp, nhiệt độ cao hơn, một vài giống cho hoa không đều đặn hay chỉ phát triển thân, lá. Lượng ánh sáng khoảng 50 - 70% lượng ánh sáng trực tiếp 4 với độ chiếu sáng khoảng 20000 lux. Độ ẩm khoảng 50 - 70 % độ ẩm tương đối của không khí và 70 - 80% độ ẩm của giá thể [3], [94], [138]. Cymbidium sinh trưởng thích hợp trên các giá thể có tính acid, thông thoáng và giữ được độ ẩm cao như dớn, xơ dừa... [240]. Hình 1.1. Địa lan Cymbidium sinense [270]. A. Cây trưởng thành mang giả hành, lá và hoa. B. Cây con từ một giả hành. A B 1.1.4. Phôi hữu tính ở địa lan Không giống với phần lớn những thực vật khác, noãn của nhiều loại lan thường không phát triển cho tới khi sự thụ phấn thành công xảy ra. Điều này gây nên sự phát triển của mô giá noãn và hình thành noãn [259]. Kết quả là sự thụ tinh bị trì hoãn trong vài tháng cho đến khi noãn được phát triển đầy đủ. Vì vậy, lan là một hệ thống lý tưởng cho việc nghiên cứu noãn và phát triển phôi. Cymbidium là đối tượng đại diện cho việc nghiên cứu về phôi họ Lan [91], [259]. Phát sinh phôi là quá trình tương đối ngắn so với thời gian hình thành quả, bắt đầu ở khoảng giữa thời kỳ thụ phấn và thời kỳ nứt ra của noãn và kéo dài trung bình trong hai tuần. Phôi lan và quá trình phát sinh phôi ở các loài lan là giống nhau. Hạt lan chứa vỏ bao quanh một phôi rất nhỏ (tiền phôi) gồm 80 – vài trăm tế bào hầu như đồng bộ trong giai đoạn hình cầu với tổ chức tế bào không xác định của mô phôi, không có nội nhũ và phôi chỉ được bao bọc bởi một lớp màng. Phôi có kích thước khoảng 0,25 - 1,20 x 0,09 - 0,27 mm và chưa phân hoá, phần lớn không có lá mầm, chồi mầm, rễ mầm (ngoại trừ Sobralia macrantha và Bletilla hyaqmthina có lá mầm sơ đẳng), chưa có sự thay đổi về kích thước tế bào và sự sắp xếp các tế bào này, không có các enzyme để xúc tác các phản ứng trao đổi chất nhằm cung cấp năng lượng cho phôi (mặc dù bản thân phôi cũng tích lũy tinh bột, lipid và protein) [13], [16], [38], [63], [144], [149], [259]. Ở thời điểm phân tán hạt, 5 phôi chưa có mô phân sinh cũng như lá mầm. Mặc dù không có sự biệt hóa hiển nhiên nào trong túi phôi nhưng lớp cutin bao bọc phôi có thể có ích cho sự biệt hóa tiền bì (protoderm). Tiền bì là mô đầu tiên được biệt hóa trong phôi hợp tử và sẽ hình thành biểu bì khi hạt nảy mầm. Cutin là chất được tổng hợp trong tế bào để hình thành biểu bì sau này. Ở C. sinense, lớp tiền bì trở nên xác định sau khi các sự phân chia song song dừng lại trên bề mặt tế bào của túi phôi. Sự hiện diện của cutin trong thành tế bào của tiền bì phản ánh tính chất vốn có của lớp biểu bì đang phát triển tuy cutin không có vai trò trực tiếp trong sự phát triển phôi. Phôi lan có lớp vỏ mỏng và không có nội nhũ ở hạt. Vì vậy, sự hiện diện của lớp cutin trong thành của túi phôi để bảo vệ tránh sự khô sớm khi phôi chưa trưởng thành [38], [149], [259]. Quá trình hình thành phôi từ hợp tử có thể tóm tắt như sau: lần phân chia xiên đầu tiên từ hợp tử của Cymbidium hình thành tạo 2 tế bào rồi hàng loạt các lần phân chia tiếp theo tạo phôi cầu [91], [259]. Sự khác biệt về hình thái giữa phôi của các loài họ Lan với họ thực vật có hoa khác được nhận thấy rất rõ từ giai đoạn phôi cầu. Ở các thực vật có hoa khác, tất cả các tế bào của phôi cầu đều thuộc dạng mô phân sinh. Riêng phôi lan, chỉ tế bào đỉnh và tế bào mô phân sinh ngọn mới phân chia, còn các tế bào khác sẽ không phân chia hoặc tăng kích thước. Vì vậy, phôi lan có hai vùng phân chia rõ ràng: cực chồi với tế bào nhỏ và cực đáy với tế bào lớn [130]. Kích thước tế bào ở vùng tế bào nhỏ phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của phôi lan. Vùng tế bào này có thể chiếm hơn 1/3 thể tích phôi ở hạt trưởng thành, còn lại là nhu mô với kích thước lớn, chứa tế bào chất đậm đặc [3], [30], [63]. Phôi lan hiển thị 3 loại mô: mô biểu bì, mô phân sinh và nhu mô, sự biệt hóa của các yếu tố mô mạch thì vắng mặt [20]. Có rất ít tinh bột được tích lũy ở phôi trưởng thành. Các tế bào dây treo thì không có các sản phẩm dự trữ và không được cutin bao phủ [38], [259]. Như vậy, phôi lan trong hạt hợp tử chỉ ở dạng hình cầu. Phôi được bảo vệ bởi tầng đơn của lớp vỏ hạt và lớp vỏ hạt cũng không có các chất dự trữ. Phần lớn các loài lan đều có phôi đơn giản, không biệt hóa với hạt nhỏ, nghèo chất dự trữ. Mặc dù vậy, phôi lan vẫn có thể nảy mầm in vitro qua giai đoạn trung gian là hình 6 thành protocorm, một cấu trúc với những tế bào chưa biệt hóa hình thành từ phôi đang nảy mầm [14], [38], [63], [130], [175], [245], [258]. 1.1.5. Phát sinh hình thái của phôi và sự phát triển protocorm - Sinh học nảy mầm của hạt địa lan Cũng như sự phát triển của hạt lan, hạt địa lan thường trải qua các giai đoạn từ phôi cầu sang dạng protocorm. Protocorm tương ứng với một giai đoạn chuyển tiếp mạnh mẽ của quá trình phát triển phôi [3], [40], [68]. Melchior Treub là người đầu tiên đưa ra thuật ngữ này (1890) để chỉ trạng thái sớm trong sự nảy mầm của cây thạch tùng [20], [35], [40], [106]. Protocorm là giai đoạn phát triển tiếp tục của phôi khi hạt nảy mầm lúc mô phân sinh của phôi hình thành chồi đỉnh [68], [246]. Sau khi hút nước, hạt trương phồng và các tế bào của phôi hình cầu bắt đầu phân chia và làm nứt lớp vỏ hạt. Lúc này, phôi có màu trắng chưa biệt hóa với những tế bào hình tròn, đồng bộ về kích thước, chưa có dấu hiệu của lá mầm, rễ sơ khởi cũng như chồi mầm. Sau đó, phôi chuyển sang giai đoạn chuyển tiếp với sự tăng kích thước tế bào đáy. Trong lớp tế bào bề mặt của phôi, các lông dạng rễ bắt đầu phát triển và chẳng bao lâu mô phân sinh đỉnh chồi xuất hiện. Các tế bào của mô phân sinh đỉnh nhỏ hơn nhiều so với các tế bào nguồn gốc của phôi. Sau đó, mô phân sinh đỉnh lún vào trong thành bộ phận bên trong của protocorm và dần biến mất khỏi bề mặt. Cấu trúc lá hình phễu xuất hiện để tạo lá sơ khởi và từ nơi này sẽ tạo các lá tiếp theo. Song song với những thay đổi hình thái này thì một chồi mới hình thành cùng với khí khổng. Phần đáy của protocorm bắt đầu dần dần kéo dài và được phủ bởi các lông trong mờ với những tế bào bắt màu sẫm, nơi dự trữ và hấp thu chất dinh dưỡng cho cây con sau này. Giai đoạn protocorm là giai đoạn phôi nảy mầm cho đến khi hình thành cây con phát triển đỉnh chồi nhưng chưa có rễ (trừ Cypripedium, protocorm tạo rễ trước) [3], [13], [14], [192]. Protocorm thường màu xanh, tròn và đối xứng tỏa tròn sau đó chuyển sang dạng hình nón. Sự hình thành protocorm được xem là sự phát triển đặc trưng của họ Lan và hình dạng của protocorm thì đa dạng: tròn, bầu dục, đĩa kéo dài, có nhánh, hình cầu hay dạng con quay [20]. Các protocorm tiếp tục phát triển trong nhiều tuần, nhiều tháng hay hàng 7 năm phụ thuộc vào loài cho đến khi đủ lớn để hình thành chồi và rễ. Sau đó là sự xuất hiện các lá, thân. Đối với Cymbidium, sau khi hạt nảy mầm sẽ hình thành protocorm với chlolorophyll để quang hợp. Chỉ khi protocorm dự trữ đủ chất dinh dưỡng thì mới hình thành chồi và rễ. Phần cuối gốc cuống noãn của protocorm tạo nên mô xốp để có thể hỗ trợ chất dinh dưỡng với sự giúp đỡ của nấm cộng sinh. Các loài lan không có rễ sơ cấp; các rễ bất định phát triển đầu tiên sau một vài tuần khi chồi xuất hiện. Đến lúc này thì giai đoạn protocorm kết thúc và cây bước vào mùa sinh trưởng đầu tiên. Cây con tiếp tục phát triển một đến hai rễ và một vài lá. Các loài ở chi Orchis có thời gian nảy mầm nhanh nhất (28 ngày), lâu nhất là ở chi Cypripedium (250 - 300 ngày). Thông thường là 50 - 90 ngày. Vài chi lan rất khó nảy mầm và phát triển thành cây như Epipactis, Cephalanthera và Neotia [19], [20], [21], [63]. Hạt lan không có nội nhũ nên phần gốc và phần giữa của protocorm mang nhiều lông (xuất phát từ biểu bì) có nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng trong môi trường để phôi phát triển.Vì vậy, phần gốc này có vai trò tương tự như nội nhũ [2], [13], [20]. Hạt thiếu nội nhũ nhưng cũng có vài chất dinh dưỡng dự trữ trong các tế bào phôi chủ yếu là protein và lipid, đường để có thể hỗ trợ ban đầu cho sự nảy mầm cho đến khi sự nhiễm nấm xảy ra [20], [144], [192]. Vài loài lan phụ thuộc vào nguồn sucrose bên ngoài, vì vậy cần có sự cộng sinh bởi nấm hoặc nuôi cấy có đường in vitro. Hạt lan khởi đầu là dị dưỡng và về sau với sự phát triển các mô quang hợp dần trở thành tự dưỡng nhưng đôi khi hạt lan cũng cần các acid amin và các chất dinh dưỡng khác từ bên ngoài thêm vào [192]. Cấu trúc dạng lá phát sinh đầu tiên ở phôi lan có thể được xem là tử diệp và bao quanh cực chồi. Mô mạch không phát triển trong giai đoạn phôi, vì vậy, phôi lan không chứa vùng mô phân sinh rễ. Trong khi đó, phôi ở các loài thực vật có hoa khác luôn phân rõ hai cực: cực chồi và cực rễ. Đây là điểm khác biệt lớn giữa phôi lan và các loài thực vật có hoa khác [3], [21], [191]. Trong tự nhiên, hạt lan nảy mầm với tỷ lệ rất thấp (0,2 - 0,3%) và cần có sự cộng sinh của nấm (Mycorrhizal) nhằm cung cấp nước, muối khoáng, carbohydrate 8 và vitamin cho phôi [248]. Đối với các loài lan đất, mối quan hệ giữa lan và nấm cộng sinh rất quan trọng trong suốt giai đoạn sớm của đời sống của lan khi mà protocorm sống ngầm dưới đất và không thể tự sản xuất bất kỳ chất dinh dưỡng nào. Khi hạt nảy mầm, tầng biểu bì trở nên rõ hơn. Các tế bào ở lỗ noãn và cuối dây treo của phôi thay đổi kích thước tế bào để hình thành protocorm. Trong các giai đoạn sinh trưởng trước khi hình thành đỉnh chồi, sự phân chia tế bào xảy ra ở cuối hợp điểm của phôi trong khi ở cuối lỗ noãn, các tế bào mở rộng nhưng nhỏ hoặc không phân chia [243]. Đầu giai đoạn nảy mầm của phôi, diệp lục tố xuất hiện trong các tế bào của protocorm ở các loài lan bì sinh. Hàm lượng m.RNA cũng đặc biệt gia tăng ở cuối hợp điểm của phôi. Các thay đổi trong việc sao chép gene liên quan đến sự nảy mầm mặc dù những thay đổi trong sao chép gene thì không liên quan đến sự nhiễm nấm cộng sinh [12], [19], [20], [21], [191], [197]. Đối với Cymbidium, protocorm thường trở nên xanh và có thể sản xuất một số chất dinh dưỡng cần thiết để phát triển [20], [144]. Đỉnh sinh trưởng của protocorm có cấu trúc chưa đầy đủ và thiếu các phần khởi đầu của lá trong một khoảng thời gian. Các tế bào bề mặt của protocorm duy trì tiềm năng của các tế bào phôi, từ đây sẽ phát khởi sự tạo thành nhiều đỉnh sinh trưởng bất định [3], [10], [16], [20]. Từ những điều trên cho thấy, phôi hữu tính địa lan khi ở giai đoạn hạt, có giai đoạn hình cầu, cấu tạo rất đơn giản và chỉ khi phôi được nảy mầm trong điều kiện thích hợp mới hình thành mô phân sinh, chồi, rễ… (giai đoạn protocorm). 1.2. VI NHÂN GIỐNG ĐỊA LAN (CYMBIDIUM) Kỹ thuật nuôi cấy mô đã và đang phát triển rộng rãi để nhân giống các loài lan. Trong việc nhân giống in vitro Cymbidium, nhiều phương pháp đã sử dụng như gieo hạt, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, phương pháp lớp mỏng tế bào, phương pháp phát sinh phôi sinh dưỡng [22], [23], [34], [89], [90], [143], [161], [170], [233]. Phương pháp phát sinh phôi sinh dưỡng sẽ được trình bày ở mục 1.3. 1.2.1. Nhân giống hữu tính bằng hạt Hạt lan rất bé, phôi chưa phân hoá, chưa có lá mầm lẫn phôi nhũ và có khoảng vài trăm tế bào. Vì vậy, để hạt nảy mầm cần có sự cộng sinh với nấm (cung 9 cấp nguồn carbon) hoặc gieo hạt trong môi trường in vitro [171], [180]. Sự phát triển của hạt Cymbidium bắt đầu với một phôi chưa trưởng thành, tiếp theo là giai đoạn protocorm và sau cùng là cây con. Các protocorm có thể được nhân lên từ các bề mặt cắt để hình thành các protocorm mới. Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi cây ra hoa mất khoảng hơn 4 năm [226]. Tuy nhiên, trong nhân giống hữu tính, biến dị thường xảy ra nên sẽ không thuận lợi cho việc sản xuất hạt đồng nhất về di truyền [17], [171]. 1.2.2. Vi nhân giống địa lan – Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Nuôi cấy mô là kỹ thuật chủ yếu trong nhân giống địa lan. Ngoài việc nuôi cấy đỉnh chồi, lá, đầu rễ, phát hoa trong vi nhân giống địa lan thì phương pháp hiệu quả hơn cả là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của các chồi lan. Mô phân sinh: Đặc tính hình thái quan trọng của các tế bào mô phân sinh là: kích thước nhỏ, đẳng kính, vách mỏng, giàu tế bào chất (chỉ có những không bào nhỏ), nhân to và hạch nhân rõ. Lúc đầu, các tế bào dẫn xuất từ mô phân sinh không khác với các tế bào đã sinh ra chúng; sau đó, các tế bào dẫn xuất này phân hóa dần dần để thành mô nền, mô bì hay mô mạch, trong khi mô phân sinh tồn tại mãi ở trạng thái phôi [9]. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Cymbidium: Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một trong những kỹ thuật hữu hiệu nhằm đảm bảo các đặc tính di truyền của mẹ trong các cây tái sinh [160]. Khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mô phân sinh ở vùng đỉnh này, không như một số giống cây khác là hình thành cấu trúc protocorm để sau đó có thể biệt hóa thành cây. Nhân các protocorm sẽ tạo thành các protocorm mới gọi là protocorm-like body [161], [255]. Không như trong nuôi cấy mô sẹo in vitro của những loài thực vật khác, việc thiết lập gene của protocorm được xác định ngay từ protocorm hình thành ban đầu [85], [159], [171]. Protocorm-like body (PLB) là thuật ngữ để chỉ những cấu trúc giống với protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh của chồi bất định ở các loài lan [106], [160]. Đây là cấu trúc lần đầu tiên được đặt ra bởi Morel [160] khi nuôi cấy đỉnh chồi của Cymbidium để tạo ra những cây sạch 10 virus với các protocorm hình thành từ đỉnh sinh trưởng mà không phải là từ hạt. Như vậy, nuôi cấy mô phân sinh họ Lan sẽ hình thành các protocorm-like body [3], [63], [160], [161]. Đỉnh chồi Đỉnh chồi Đỉnhchồi chồi Đỉnh Phôi hợp tử Đỉnh Đỉnh Đỉnh Đỉnh Đỉnh chồi chồi chồi chồi chồi Phôi nang Hạt Rễ Chồi Chồi Chồi Chồi Đỉnh chồi Đỉnh chồi Đỉnhchồi chồi Đỉnh Chồi Chồi Chồi Chồi Chồi Chồi Chồi Chồi Hình 1.2. Hệ thống nhân giống bằng hạt (trái) và nhân giống sinh dưỡng (phải) ở địa lan [20]. Protocorm-like body (PLB) Kỹ thuật này vừa tạo ra cây sạch bệnh virus, đồng nhất về kiểu gene vừa cho tỷ lệ nhân giống cao. Mô phân sinh đỉnh sinh trưởng, bộ phận đặc biệt của cây, được che chắn bởi những sơ khởi lá, không liên kết với hệ thống mạch, không có các cầu liên bào do đó thường không bị xâm nhiễm bởi virus vốn đi vào cây thông qua hệ thống này. Hơn nữa, sự di chuyển của virus không theo kịp với tốc độ phân chia tế bào ở vùng này. Bộ phận đỉnh sinh trưởng còn ở giai đoạn non nên quá trình phân chia và phân hóa diễn ra mạnh mẽ. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có ý nghĩa quan trọng trong công tác phục tráng và nhân nhanh giống cây trồng [159], [161], [171], [217]. Vùng đỉnh sinh trưởng Cymbidium với kích thước 1- 2 mm (gồm mô phân sinh ngọn với 1 - 2 sơ khởi lá, được tách vô trùng từ chồi đỉnh hay chồi nách có chiều dài 3 - 10 cm) được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng bổ sung kinetin, myo-inositol và IAA. Khoảng 4 tuần, trên bề mặt cắt của mẫu sẽ hình thành 11 protocorm mà sau đó có thể hình thành cây con hoặc được dùng để sản xuất các protocorm thứ cấp (PLB). Các PLB này chứa vài đỉnh sinh trưởng. Vì vậy, vài cây con có thể hình thành từ việc cắt một PLB sau 3 tuần nuôi cấy. Có thể nhân các PLB cũng như phát triển các PLB thành cây con mà không cần sử dụng CĐHSTTV. Tuy nhiên, việc sử dụng CĐHSTTV là khả thi cho việc nhân PLB (môi trường nuôi cấy bổ sung 0,8 mg/l kinetin và 16 mg/l IAA tạo ra 45 PLB cho một bình nuôi cấy trong 6 tuần) [171]. 1.2.3. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào Lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu có kích thước nhỏ cắt từ những tổ chức thực vật (thân, lá, phát hoa, sơ khởi hoa hay tổ chức hoa, lá mầm trụ trên/dưới lá mầm, vùng đỉnh hay phôi). Các lát cắt có thể cắt dọc (lTCL), hay cắt ngang (tTCL). Các lTCL chỉ chứa một loại mô như các tế bào biểu bì nhưng các tTCL lại bao gồm các tế bào từ các kiểu mô khác nhau: tế bào biểu bì, vùng vỏ, tầng phát sinh gỗ, quanh mạch và lõi, nhu mô [6]. Nuôi cấy các TCL có thể phân lập các tế bào, các tầng mô và phụ thuộc vào trạng thái di truyền, các yếu tố ngoài gene, các điều kiện sinh trưởng có kiểm soát (ánh sáng, nhiệt độ, pH, CĐHSTTV, các chất bổ sung vào môi trường…) dẫn tới sự cảm ứng in vitro phát sinh hình thái. Khả năng phát sinh hình thái của một TCL phụ thuộc các yếu tố như: sự nhận biết các dấu hiệu đúng, sự truyền tính trạng, khả năng di truyền để đáp ứng và phản ứng với các dấu hiệu này, tình trạng sinh lý và nguồn gốc (mô hay tổ chức) của TCL, các yếu tố stress, các trạng thái im lặng của gene. Các tế bào trong TCL có thể phản biệt hóa dẫn đến việc thiết kế các kiểu hình. Trong các TCL, con đường phát sinh hình thái của những mô chuyên trách xuất phát từ các tế bào, các mô có thể được điều khiển và kiểm soát rõ ràng, cho phép nghiên cứu về sự thay đổi phân tử, sinh lý, sinh hóa có thể xảy ra. Các TCL cũng sử dụng trong tăng cường trao đổi các hợp chất thứ cấp, dược chất qua việc nuôi cấy các tổ chức chuyển gene, nuôi cấy thực vật tự dưỡng bằng bioreactor [6], [228]. Nhân giống các loài lan là một ví dụ về việc áp dụng phương pháp TCL. Laskshmanan [125] đã nuôi cấy các tTCL của lan đơn thân Aranda ‘Deborah’có 12 chiều dày 0,6 - 0,7 mm từ các chồi đỉnh dài 6 - 7 mm. Sau 45 ngày nuôi cấy, các PLB hình thành với 13,6 PBL/mẫu TCL so với 2,75 PLB từ một đỉnh chồi. Một tTCL có khả năng sản xuất được khoảng 80.000 cây con/năm so sánh với 11.000 cây con/năm khi sử dụng phương pháp nhân giống bằng chồi đỉnh. Ở Phaleanopsis, các mẫu TCL từ phiến lá non có diện tích 4 mm2 hay các phát hoa có thể được cảm ứng để tạo trực tiếp các protocorm theo rìa vết thương của cuống lá và trên bề mặt của TCL [230]. Sử dụng CPPU (10 µM) với nồng độ sucrose thấp (1%) đã cho tỷ lệ đạt được cao nhất của mẫu (95%) sinh trưởng chồi và rễ ở Rhynchostylis gigantean [31]. Ở đối tượng Cymbidium Twilight Moon “Day Light”, sử dụng các lTCL của biểu bì PLB đã hình thành các chồi, PLB thứ cấp hoặc mô sẹo có khả năng phát sinh phôi (Hình 1.2), [229], [230]. A B C Hình 1.3. Phát sinh hình thái và phát sinh phôi sinh dưỡng từ các PLB (lTCL và tTCL) của Cymbidium Twilight Moon “Day Light” in vitro. A. Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi trong điều kiện tối; B. Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi trong điều kiện có chiếu sáng; C. Các PLB hình thành từ mô sẹo có khả năng phát sinh phôi [230]. 1.3. PHÔI SINH DƯỠNG THỰC VẬT 1.3.1. Khái niệm về phôi sinh dưỡng (somatic embryo) Ngược với sự phát triển cơ quan chỉ tạo ra hoặc cực rễ hoặc cực chồi, phát sinh phôi sinh dưỡng giúp tạo ra cấu trúc hai cực: cực rễ lẫn cực chồi. Phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ được định nghĩa là một cấu trúc mang tính lưỡng cực giống phôi hợp tử, phát triển từ tế bào sinh dưỡng và không có liên kết mạch với tế bào gốc ban đầu. Sự phát sinh phôi sinh dưỡng xảy ra thông qua một số giai đoạn tương tự như phôi hữu tính với các tế bào sinh dưỡng biệt hóa thành phôi và sự nảy mầm của phôi sinh dưỡng thì tương tự như của phôi hợp tử để hình thành cây con. Phôi 13 sinh dưỡngcó thể biệt hóa trực tiếp từ mẫu cấy không cần đi qua giai đoạn trung gian mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo. Tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân, nhờ vậy, chỉ sau một thời gian ngắn có thể tạo được một số lượng phôi đáng kể, quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng in vitro đã được báo cáo trên hơn 200 loài [189]. Giống như các tế bào của mô phân sinh hay hợp tử, các tế bào có khả năng sinh phôi có các đặc tính cơ bản như sau: tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính, có hoạt động biến dưỡng rất mạnh mẽ, cường độ tổng hợp acid nucleic cao, thể tích không bào giảm, tăng thể tích tế bào chất, nhân và hạch nhân to và đậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một số lượng lớn các ribosome, ty thể, hạt tinh bột và có mạng lưới nội chất nhỏ [62], [192], [232]. Tuy nhiên, về mặt phát sinh hình thái, có sự khác biệt, tế bào sinh phôi cho phôi còn tế bào mô phân sinh cho mô và cơ quan [77]. Hai sự kiện quan trọng xuất hiện trong sự hình thành in vitro các tế bào phôi, đó là sự phân chia tế bào không cân xứng và sự kiểm soát việc mở rộng tế bào [55], [77]. Sự phân chia không cân xứng tế bào gia tăng bởi CĐHSTTV và sau đó, hình thành tính hữu cực của tế bào, liên quan đến chênh lệch pH hay khu vực mang điện quanh tế bào [220]. Khả năng kiểm soát việc mở rộng tế bào được kết hợp với các polysaccharide của thành tế bào và tương ứng với các enzyme thủy phân [55], [62]. Sự phân hóa cấu trúc trong sự phát sinh phôi sinh dưỡng bắt đầu ở giai đoạn hình cầu với sự xuất hiện của tiền bì (protoderm), lớp ngoài thật sự của phôi bởi sự phân chia thẳng góc. Tiền bì có vai trò tạo hình dạng phôi do hoạt động như một tác nhân lý học đối với các tế bào bên trong, có khả năng điều hòa sự phân chia và biệt hóa tế bào trong phôi. Sự hình thành mô phân sinh ngọn thường bắt đầu vào cuối giai đoạn phôi hình cầu và cấu trúc của mô phân sinh ngọn có thể thấy rõ ở giai đoạn tử diệp [120]. 1.3.2. Các cơ sở của phát sinh phôi sinh dưỡng Có ba giai đoạn phát triển trong phát sinh phôi sinh dưỡng in vitro: cảm ứng, phát triển và trưởng thành. 14 Con đường phát sinh phôi xảy ra ngay sau nuôi cấy khởi đầu. Các yêu cầu trong phát sinh phôi sinh dưỡng và cả trong phôi hợp tử: Các tế bào chuyên trách, một môi trường thích hợp hay một sự kích thích. Trong phát sinh phôi sinh dưỡng trực tiếp, phôi phát triển từ các tế bào đơn, chẳng hạn từ trụ hạ diệp, cuống lá mà không cần sự hình thành mô sẹo. Trong phát sinh phôi sinh dưỡng gián tiếp, sự hình thành mô sẹo trong đó có các tế bào tiềm năng (competent cell), hoạt động theo con đường tạo phôi, hình thành các tế bào tiền phôi (proembryogenic cell) rồi đến giai đoạn phôi hình cầu, giai đoạn phôi hình trái tim, phôi hình cá đuối, giai đoạn lá mầm ở cây hai lá mầm... Ở cà rốt (Daucus carota), cả hai dạng phát sinh này đều xảy ra [83], [132], [177]. Trong nuôi cấy khởi đầu của phát sinh phôi sinh dưỡng gián tiếp, đã hình thành mô sẹo từ hoạt động phân chia tế bào cao với sự “tái chương trình” (reprogramming) dẫn đến một vài tế bào trong đó có tiềm năng phát sinh phôi sinh dưỡng [171]. 1.3.3. Các khía cạnh di truyền – tổ chức DNA Quá trình sinh phôi sinh dưỡng thật sự là một chương trình biểu hiện gene. Trong đó, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò trung tâm trong việc khởi động dòng thông tin tế bào. Có khoảng 30.000 gene được hiển thị ở phôi và cây con [249], [171] và khoảng 3.500 gene được trang bị cho sự phát triển phôi. Khoảng 40 gene ảnh hưởng đến phôi Arabidopsis thaliana [71], [249], [251]. Các yếu tố di truyền cũng đóng vai trò trung tâm trong cảm ứng phôi sinh dưỡng. Sử dụng sinh học phân tử với kỹ thuật RAPD, trên cơ sở trình tự các nucleotid đã hình thành protein leucine-rich repeat receptor-like kinase (SERK). Sử dụng cấu trúc bao gồm promoter SERK và gene phát sáng luciferase cho thấy sự hiển thị của SERK xảy ra chỉ đến giai đoạn hình cầu của sự phát triển phôi. SERK mRNA cũng được tìm thấy ở phôi hợp tử đến giai đoạn hình cầu nhưng không có ở các hoa không thụ phấn hay những mô sinh dưỡng khác. Rõ ràng, SERK là hoàn toàn chuyên trách trong những giai đoạn sớm của phôi sinh dưỡng và phôi hợp tử [206]. SERK được 15 định vị ở màng tế bào, nơi SERK có thể được vận chuyển trong các nang nội bào như tế bào chất [171]. Sự tương đồng của SERK cũng đã được mô tả ở nhiều loài thực vật khác. Ở A. thaliana, một họ gene của SERK gọi là AtSERK tồn tại mà AtSERK1 là đặc trưng nhất.Trong nuôi cấy cây mía (Saccharum sp.), các gene của họ được gọi là SoSERK có 5 phần tử. SoSERK1 có 72% giống hệt AtSERK1. Vài phần tử của họ SoSERK có tỷ lệ tương đồng với những cây một lá mầm khác. Ở cây bắp (Zea mays), có 2 gene SERK đã được mô tả (ZmSERK1 và ZmSERK2). Những gene sao chép này có khoảng 80% giống hệt trình tự nucleotide và có các cấu intron/exon tương tự như trình tự của các gene SERK. Gene đặc trưng nhất liên quan đến tiềm năng phát sinh phôi là gene mã hoá cho enzyme SERK1. Sự hiển thị của SERK2 cũng xảy ra trong tất cả các mô đã được điều tra.Trong nuôi cấy mô sẹo cây mía, các SoSERK cũng được hiển thị [171]. Nolan và cộng sự [178] sử dụng hệ thống nuôi cấy cây Medicago truncatula cho thấy gene SERK1 (MtSERK1) tiến hóa từ AtSERK1 (có đến 92% là giống nhau) được đặc trưng và các kết quả đề nghị rằng gene này lẽ ra đã có vai trò rộng hơn trong phát sinh hình thái và không chỉ trong phát sinh phôi sinh dưỡng. Ở các loài thực vật khác, những gene SERK tương đồng cũng được xác định, thậm chí còn được biểu hiện mạnh hơn, cho thấy vai trò của các gene này trong việc điều hoà sự phát sinh phôi. Nghiên cứu 2 dòng của Medicago truncatula, một dòng khó cho phôi và một dòng cho tiềm năng phôi cao. Hơn 2.000 protein được phát hiện trong đó có 54 protein được thay đổi có ý nghĩa trong biểu thị suốt 8 tuần nuôi cấy với sự phát triển phôi của dòng mang phôi. Hơn 60% trong đó có sự khác nhau giữa 2 dòng này trong mẫu của việc hiển thị gene [96]. Điều này cho thấy vai trò của gene trong việc hình thành phôi. Cái gì gây kích thích cảm ứng chương trình phát sinh phôi trong các tế bào tiềm năng? Có thể nói gì về bản chất của kích thích đó đã cảm ứng các tế bào tiềm năng để sản xuất phôi? Sự xáo động phân lập của mẫu từ cây mẹ: Auxin (hay chất điều hòa sinh trưởng khác) trong môi trường dinh dưỡng, hay cả hai? [171]. 16 Thực nghiệm cho thấy, khả năng auxin như là một chất kích thích được công nhận. Nghiên cứu 2 dòng cà rốt phôi và không phôi về nồng độ IAA cho thấy mẫu ở dòng có khả năng sinh phôi, suốt quá trình cảm ứng, IAA gia tăng nhưng mẫu ở dòng không có khả năng sinh phôi thì không xảy ra hiện tượng này. Sự gia tăng CĐHSTTV cũng xảy ra song song với quá trình cảm ứng phát triển phôi trong phát sinh phôi hợp tử và các cấu trúc vô tính khác. Các chương trình này có thể được khởi đầu trong điều kiện sáng hay tối [171]. 1.3.4. Các yếu tố tác động trong phát sinh và nhân phôi sinh dưỡng 1.3.4.1. Vai trò sinh lý của sự hình thành và phát triển phôi Sự hình thành và phát triển phôi sinh dưỡng phụ thuộc vào loài (như đã nêu ở mục 1.3.2. và 1.3.3.) cũng như vào điều kiện nuôi cấy trong đó vai trò của CĐHSTTV có ý nghĩa quan trọng trong việc đạt đến những phản ứng phát sinh hình thái. Con đường phát sinh hình thái có thể được định hướng qua phát sinh chồi hay phôi sinh dưỡng chỉ bởi thay đổi thành phần CĐHSTTV trong môi trường nuôi cấy [65], [102]. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong sự phát sinh phôi sinh dưỡng Auxin Auxin được tổng hợp ở ngọn thân, các mô phân sinh và lá non. Auxin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào tượng tầng, phân hóa mô dẫn, phát triển chồi, phát sinh rễ [9]. Auxin kích thích sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo, điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi kết hợp với cytokinin. Auxin có vai trò khởi đầu sự phân chia tế bào để hình thành các mô phân sinh, các tổ chức cơ quan thực vật. Auxin cảm ứng sự tiết ion hydro từ nguyên sinh chất ra ngoài làm pH vách tế bào giảm, làm lỏng lẻo các liên kết giữa hemicellulose, các hợp chất pectic và cellulose [4], [77]. Sự di chuyển ngược dòng của ion kali từ ngoài vào trong làm tăng áp suất thẩm thấu tế bào dẫn đến sự di chuyển nước từ ngoài vào trong làm tăng kích thước tế bào. Auxin cũng ảnh hưởng lên sự biến dưỡng RNA làm tăng 17 sinh tổng hợp các protein cần cho các hoạt động của tế bào (Bottger, 1986 trong [77]). Auxin có vai trò quan trọng trong việc cảm ứng sự hình thành và phát triển phôi sinh dưỡng [115]. Trong số hơn 80% các nghiên cứu khoa học được công bố gần đây, việc cảm ứng sinh phôi sinh dưỡng cần có sự hiện diện riêng lẻ của auxin hay kết hợp với cytokinin. Trong nhóm auxin, 2,4-D là một trong những CĐHSTTV quan trọng nhất trong sự điều hòa cảm ứng phôi sinh dưỡng [58], [152]. Ngoài 2,4-D, còn có các auxin khác như α-NAA, IAA, IBA, picloram và dicamba cũng được dùng [9], [44]. 2,4-D được chứng minh là có tác dụng điều hoà sự phân chia của tế bào [33]. 2,4-D làm gia tăng mức auxin của mẫu cấy, một trong những dấu hiệu quan trọng xác định số phận của tế bào nuôi cấy để trở thành phôi. 2,4-D thường kết hợp với BA trong cảm ứng các mô có khả năng phát sinh phôi. Ngoài tác dụng kích thích tổng hợp ABA và ethylene, 2,4-D còn có tác dụng làm tăng mức auxin nội sinh (IAA) trong tế bào thực vật [134], [152]. Cần có một lượng auxin nội sinh thích hợp của mẫu cấy có thể là yêu cầu chủ yếu trong quá trình phát sinh phôi. Ngay cả ở những hệ thống mà không đòi hỏi phải có auxin để cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng thì vẫn dễ dàng nhận thấy tầm quan trọng của các auxin nội sinh. Ví dụ, ABA chỉ có khả năng cảm ứng phát sinh phôi đối với những mẫu cấy cà rốt còn chồi đỉnh, là vùng tổng hợp auxin [177]. Việc xử lý những stress khác nhau cũng có tác dụng đẩy mạnh sự cảm ứng tạo phôi của các tế bào đỉnh và nụ hoa [76], [95], [181]. Nhu cầu về loại và hàm lượng auxin cần cho sự tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi phụ thuộc vào mục đích thí nghiệm, hàm lượng auxin nội sinh trong mẫu cấy, khả năng tự tổng hợp auxin trong mẫu cấy, sự tương tác giữa auxin nội sinh và ngoại sinh, đặc tính của loại auxin cũng như sự liên hệ của auxin với các chất khác [9], [51]. Đặc điểm tế bào sau khi được cảm ứng để phát sinh phôi là sự di chuyển của nhân tế bào về gần vách, sự phân chia nhân xảy ra và sự hình thành tế bào con bất đối xứng [93]. 18 Auxin ảnh hưởng lên tính hữu cực của tế bào và kích thích các phân chia không cân xứng sau đó, vì vậy, có vai trò trong sự hình thành các tế bào có khả năng sinh phôi. Trong nuôi cấy in vitro, khi xử lý auxin thì sự di chuyển hữu cực của auxin có vai trò chìa khóa trong sự thay đổi hình thái phôi. Sự thay đổi này xảy ra khi phôi hình cầu chuyển sang giai đoạn chuyển tiếp. Tế bào thiết lập tính hữu cực đã bị mất trước đó bằng cách thay đổi hướng vi ống, vị trí mặt phẳng phân chia và hướng kéo dài tế bào, tính hữu cực mới được tái lập [9], [93]. Vai trò của auxin trong cảm ứng mô sẹo lan như α-NAA hay 2,4-D cảm ứng hình thành mô sẹo có khả năng phát sinh phôi từ các mô bên trong của PLB Cymbidium Thanksgiving “Nativity” [23] hay từ lá của cây lan Trăng Phamabilis (L.) Bl. [239], Paphiopedilum niveum [107], Vanda Miss Joaquim [108] cũng được xác nhận. Cytokinin Mô phân sinh ngọn rễ và phôi là nơi tổng hợp chủ yếu các cytokinin. Cytokinin cần thiết cho giai đoạn khởi đầu của quá trình phân bào, làm tăng tốc độ phân chia tế bào và định hướng sự phân hóa tế bào trong nuôi cấy. Cytokinin giúp tế bào gia tăng kích thước và sinh tổng hợp protein, là nhân tố chính kích thích quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi. Cytokinin cùng với auxin thúc đẩy sự phân chia tế bào, điều hòa sự phát sinh hình thái, làm gia tăng số lượng tế bào trong phôi [77]. Cytokinin có thể được thêm vào môi trường nuôi cấy cùng với auxin để cảm ứng tạo phôi sinh dưỡng. Vài trường hợp, chỉ cần thêm cytokinin là đủ để hình thành phôi sinh dưỡng [101]. Gibberellin và acid abscisic Gibberellin (thường dùng GA3) làm tăng hàm lượng auxin trong mô mà chúng kích thích. Auxin và gibberellin có vai trò thiết lập tính hữu cực ở tế bào do tác động đến hướng của các vi sợi bộ xương tế bào. Tuy nhiên, gibberellin làm giảm sự tăng trưởng mô sẹo khi phối hợp auxin với cytokinin (Kartha, 1977 trong [77]). 19 Ngược với auxin, ABA cản sự tăng trưởng của diệp tiêu và mô nuôi cấy. Ở nồng độ thấp (0,1 - 1 mg/l), ABA thúc đẩy sự trưởng thành của phôi sinh dưỡng, ức chế sự nhân phôi thứ cấp, cản sự nảy mầm sớm của phôi sinh dưỡng [11]. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng trong sự phát triển của phôi sinh dưỡng Sự giảm tỷ lệ auxin/cytokinin và sự di chuyển hữu cực của auxin là yếu tố cần thiết để thiết lập trục xác định giúp phôi hình cầu tiếp tục phát triển. Trong nhiều hệ thống cảm ứng tiếp theo của quá trình phát triển phôi không cần điều kiện auxin [57]. Điều này cho thấy tế bào có khả năng tự tổng hợp auxin. Việc thiết lập tổng hợp auxin và quá trình vận chuyển có cực auxin là bước chìa khóa trong sự hình thành mô phân sinh của quá trình phát triển phôi. Việc tách khỏi auxin khỏi môi trường nuôi cấy, xử lý với ABA, sucrose, bảo quản lạnh và nuôi cấy lỏng với GA3 thường được sử dụng để ngăn cản sự hình thành phôi thứ cấp và làm phôi trưởng thành [72], [189]. Sự di chuyển hữu cực của auxin từ trên xuống theo một trục thẳng góc với bề mặt nuôi cấy cần cho sự hình thành hệ mạch và phát sinh cơ quan phôi [115]. Sự quan trọng của việc vận chuyển hữu cực auxin (PAT) trong phát sinh hình thái phôi được chứng minh bởi các giai đoạn xử lý khác nhau trong phôi sinh dưỡng cà rốt với các chất ức chế PAT như 2,3,4-triiodobenzoic acid (TIBA) [44]. TIBA ngăn cản khả năng phôi sinh dưỡng trải qua từ sự chuyển tiếp phát sinh hình thái đến các giai đoạn kế tiếp. Xử lý trụ hạ diệp cà rốt trong đó phôi sinh dưỡng được cảm ứng trực tiếp 2,4-D, TIBA theo nhịp 24 giờ và acid 2,4,6-trichlorophenoxyacetic, một chất ức chế PAT khác và cho thấy đã có hiện tượng ức chế sự phát triển các phôi sinh dưỡng nhưng không thường xuyên [235]. Sự hình thành chênh lệch hữu cực auxin xuất hiện là cần thiết để thiết lập tính đối xứng của phôi trong suốt các bước khởi đầu của quá trình phát sinh phôi sinh dưỡng, một điều kiện tất yếu cho sự phát triển xa hơn của phôi [65]. Cytokinin có lẽ đóng vai trò quan trọng trong phân chia tế bào hơn là sự biệt hóa phôi [48], [81]. Trong nuôi cấy mô, TDZ có thể làm gia tăng tổng hợp và tích 20