Tài liệu Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm ah5n1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc” là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc tác giả công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Tôi xin chịu trách nhiệm về tính chính xác và trung thực của luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Nguyễn Thị Thu Hằng i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Trung Nam và PGS.TS. Chu Hoàng Hà - những ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, các cán bộ Phòng Quản lý tổng hợp, bộ phận Quản lý đào tạo Sau đại học của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi. Với lòng tri ân và biết ơn, tôi xin cảm ơn Dr. Robert G. Webster, Dr. Richard J. Webby (St. Jude Children's Research Hospital) đã cung cấp bộ plasmid pHW2000. Luận án đƣợc thực hiện bằng kinh phí của đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1” 2016 - 2018 (Mã số SPQG.05b.03). Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của ThS. Lê Hùng Chí, TS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán bộ của Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật và PTN trọng điểm Công nghệ gen, Viê ̣n Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện CNSH Lâm nghiệp, các đồng nghiệp đang công tác tại Trƣờng Đại học Lâm nghiệp vì đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới các thành viên trong đại gia đình thân yêu của tôi. Nhờ những động viên, khích lệ, đồng hành và chia sẻ khó khăn của những ngƣời thân trong gia đình mà tôi luôn có sự quyết tâm và nghị lực cao trong quá trình nghiên cứu. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thu Hằng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... viii DANH MỤC BẢNG BIỂU ...................................................................................... xi DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ..................................................................... xiii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5 1.1. Tổng quan về virus cúm A/H5N ................................................................. 5 1.1.1. Vị trí phân loại ............................................................................................... 5 1.1.2. Danh pháp ...................................................................................................... 6 1.1.3. Hình thái và cấu trúc ...................................................................................... 6 1.1.4. Chu trình nhân lên ........................................................................................ 13 1.1.5. Tiến hóa của virus ........................................................................................ 15 1.1.6. Độc lực của virus ......................................................................................... 18 1.2. Tình hình dịch bệnh và di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 .... 19 1.2.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 độc lực cao .................................................... 19 1.2.2. Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ................................................ 20 1.3. Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 .......................................................... 23 1.3.1. Phân loại vaccine cúm A/H5N1 ................................................................... 23 1.3.2. Nguyên tắc phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 ............ 25 1.3.3. Thành tựu trong nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1 ....................... 26 iii 1.4. Áp dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong nghiên cứu tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A .................................................................. 30 1.4.1. Nguyên lý của kỹ thuật ................................................................................ 30 1.4.2. Lịch sử nghiên cứu ....................................................................................... 31 1.4.3. Các bƣớc của quá trình phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A bằng di truyền ngƣợc ................................................................................... 34 1.4.4. Ƣu điểm của việc ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc trong phát triển chủng virus vacine cúm A ............................................................................ 35 1.5. Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm A ..................................................... 36 1.5.1. Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm vô hoạt............................................... 37 1.5.2. Đáp ứng miễn dịch với vaccine cúm sống giảm độc lực ............................. 38 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 39 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 39 2.1.1. Chủng virus, vi sinh vật, plasmid, tế bào và một số vật liệu khác ............... 39 2.1.2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu........................................................ 40 2.1.3. Hóa chất và thiết bị ...................................................................................... 42 2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 43 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 44 2.2.1. Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 ............. 44 2.2.2. Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và 2.3.2.1c… .......................................................................................... 47 2.2.3. Khuếch đại và chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang phân đoạn gen đích..... 49 2.2.4. Ghép nối các phân đoạn gen virus cúm vào plasmid pHW2000 tạo hệ thống plasmid đơn gen ................................................................................. 51 2.2.5. Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào 293T và MDCK .............................................. 52 iv 2.2.6. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ........................... 54 2.2.7. Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng gà sạch có phôi .......................................................................... 56 2.2.8. Phân lập và bảo quản chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ................................................................................................ 59 2.2.9. Nuôi cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phôi và xác định tính ổn định di truyền của virus ........................................................... 60 2.2.10. Tạo vaccine trong phòng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c .................................................................................. 61 2.2.11. Xác định khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên gà của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c.................... 62 2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................... 63 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 64 3.1. Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào plasmid pHW2000........................................................................................ 64 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 .................................................... 64 3.1.2. Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dòng sáu phân đoạn gen khung ..... 64 3.1.3. Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 ....................... 72 3.2. Thiết kế và tách dòng gen HA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 ....................................................... 79 3.2.1. Thiết kế gen kháng nguyên HA ................................................................... 79 3.2.2. Khuếch đại gen HA ...................................................................................... 82 3.2.3. Tạo dòng plasmid pHW2000 mang gen HA …........................................... 83 v 3.3. Thiết kế và tách dòng gen NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 … .................................................. 84 3.3.1. Thiết kế gen kháng nguyên NA ................................................................... 84 3.3.2. Khuếch đại gen NA ...................................................................................... 87 3.3.3. Dòng hóa gen NA vào plasmid pHW2000 .................................................... 88 3.4. Tạo chủng virus tái tổ hợp bằng di truyền ngƣợc ............................. 89 3.4.1. Tách chiết DNA plasmid và nuôi cấy tế bào 293T ...................................... 89 3.4.2. Tối ƣu điều kiện chuyển nhiễm cho tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1clade 2.3.2.1c trong tế bào 293T........................................... 92 3.4.3. Kết quả tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1clade 2.3.2.1c bằng di truyền ngƣợc ...................................................................... 95 3.5. Nhân giống virus trong trứng gà sạch có phôi ........................................ 98 3.6. Phân lập và kiểm tra tính ổn định di truyền của chủng virus…………. .......................................................................................... 104 3.7. Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm ở qui mô phòng thí nghiệm và xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của vaccine ................................................................................................ 108 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ................................................................ 114 4.1. Ƣu điểm của hệ thống plasmid pHW2000 trong di truyền ngƣợc tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A ............................................... 114 4.2. Vai trò của sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 trong việc nâng cao hiệu suất nhân giống của chủng virus ứng viên vaccine cúm A ................................................................. 117 4.3. Tổng hợp nhân tạo phân đoạn gen HA mã hóa protein không chứa các amino acid kiềm độc ................................................................ 120 vi 4.4. Ảnh hƣởng của loại tế bào biến nạp đến sự tái tạo virus cúm A tái tổ hợp ......................................................................................................... 123 4.5. Khả năng thích ứng nhân lên của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng gà sạch có phôi và tính ổn định di truyền gen kháng nguyên của virus .......................................... 125 4.6. Khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ở gia cầm .................................. 126 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 128 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI .......................................................................................................... 129 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ...................................................... 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 135 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết Chữ viết đầy đủ (tiếng Anh) Nghĩa tiếng Việt ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng Giống chuẩn Hoa kỳ CPE Cytopathic Effect cRNA Complementary Ribonucleic Acid Axit ribonucleic bổ sung DNA Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleic Acid EID50 50% Eggs Infectious Dose FAO Food and Agriculture Organization FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drug Administration Gal Galactose Galactose GMT Geometric Mean Titer Giá trị HI trung bình hình học HA Hemagglutinin Hemagglutinin HAU Hemagglutinin unit Đơn vị Hemagglutinin HI Hemagglutination Inhibition Ức chế ngƣng kết hồng cầu HPAI High Pathogenic Avian Influenza Virus cúm độc lực cao IIV Inactivated Influenza Vaccine Vaccine cúm bất hoạt tắt Hiệu ứng cytopathic (hiệu ứng hủy hoại tế bào) Liều lƣợng virus lây nhiễm 50% trứng Tổ chức Nông lƣơng Liên Hiệp Quốc Huyết thanh bào thai bê Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ viii LAIV Live Attenuated Influenza Vaccine Vaccine cúm sống nhƣợc độc LPAI Low Pathogenic Avian Influenza Virus cúm độc lực thấp M Matrix/Marker Protein M/Marker MDCK Madin-Darby Canine Kidney Tế bào thận chó thƣờng trực ml Milliliter Milliliter mRNA Messenger Ribonucleic Acid RNA thông tin NA Neuraminidase Neuraminidase NCR Non Coding Region Vùng không mã hóa NEP Nuclear Export Protein Protein ngoài nhân NK Natural Killer Tế bào miễn dịch NK nm Nanometer Nanometer NP Nucleoprotein Protein NP NS Non-Structural protein Protein không cấu trúc PA Polymerase Acidic Protein PA PB1 Polymerase Basic 1 Protein PB1 PB2 Polymerase Basic 2 Protein PB2 PBS Phosphate Buffered Saline Đệm PBS PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gen PFU Plaque Forming Units Đơn vị tạo thành plaque PolI RNA polymerase I Enzyme RNA polymerase I ix PolII RNA polymerase II Enzyme RNA polymerase II PR Puerto Rico Puerto Rico RdRp RNA dependent RNA polymerase Enzyme RdRp RG Reverse Genetics Di truyền ngƣợc RT-PCR Reverse Transcriptase PCR PCR phiên mã ngƣợc RNA Ribonucleic Acid Ribonucleic Acid RNP Ribonucleoprotein Ribonucleoprotein SA Sialic Acid Sialic Acid SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPF Specific Pathogen Free Không nhiễm mầm bệnh ssRNA Single stranded RNA RNA sợi đơn Th T helper Tế bào T hỗ trợ vRNA Viral Ribonucleic Acid RNA của virus vRNP Viral Ribonucleoprotein RNP của virus WHO World Health Organisation Tổ chức Y tế Thế giới x DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các phân đoạn vRNA mã hóa 11 protein của virus cúm A .................. 8 Bảng 1.2. Thụ thể liên kết đặc hiệu với HA ở các vật chủ của virus cúm A ....... 13 Bảng 1.3. Các clade cúm A/H5N1 lƣu hành ở Việt Nam .................................... 22 Bảng 1.4. Thành tựu nghiên cứu và danh sách các chủng virus ứng viên sản xuất vaccine cúm A/H5N1 bằng di truyền ngƣợc theo WHO ............ 27 Bảng 2.1. Các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản và xác định trình tự nucleotide của các phân đoạn gen virus cúm A .................................. 41 Bảng 2.2. Các cặp mồi sử dụng cho xác định trình tự gen ................................. 41 Bảng 2.3. Các hóa chất, enzyme và kit sử dụng trong nghiên cứu ..................... 42 Bảng 2.4. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy tế bào ...................................... 43 Bảng 2.5. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại cDNA của sáu phân đoạn gen khung ................................................. 46 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng RT-PCR một bƣớc........................................... 56 Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR một bƣớc ............................... 56 Bảng 3.1. So sánh trình tự nucleotide và amino acid của sáu phân đoạn gen khung đã phân lập với các gen tƣơng ứng của chủng PR8 ................ 71 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của loại hóa chất chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ......................... 92 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c .................. 93 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng plasmid chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c .............. 94 Bảng 3.5. Kiểm tra sự có mặt và đặc điểm di truyền gen HA của virus rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 ............... 96 xi Bảng 3.6. Kết quả xác định hiệu giá HA và hiệu giá virus của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 ........... 100 Bảng 3.7. Kiểm tra khả năng thích ứng nhân lên trong trứng, tế bào MDCK và tính ổn định di truyền của các chủng virus ................................... 105 Bảng 3.8. Kiểm tra một số chỉ tiêu của kháng nguyên virus trong vaccine, tính vô hoạt và vô trùng của chế phẩm vaccine ................................ 109 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c đến sức sống và khả năng kích thích sinh kháng thể đặc hiệu của gà 3 ngày tuổi .............................................. 110 xii DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Phân loại virus cúm A dựa sự khác biệt về trình tự amino acid của protein HA ...................................................................................... 5 Hình 1.2. Hình thái và cấu trúc của virus cúm A .................................................. 7 Hình 1.3. Cấu trúc và chức năng của phức hệ vRNP .......................................... 12 Hình 1.4. Chu trình tái bản của virus cúm A....................................................... 14 Hình 1.5. Vật chủ tự nhiên của các subtype virus cúm A ................................... 17 Hình 1.6. Sự khác biệt về trình tự amino acid ở vị trí cắt của protease nội bào giữa các chủng virus LPAI và HPAI ............................................ 19 Hình 1.7. Hệ thống 8 plasmid PolI-PolII cho tái tạo virus cúm A bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc .......................................................................... 33 Hình 2.1. Sơ đồ plasmid pHW2000 .................................................................... 40 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngƣợc ............................................................. 45 Hình 2.3. Sơ đồ cấu trúc gen HA và NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c .................................................................................. 47 Hình 2.4. Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c trƣớc và sau khi xử lý loại vùng độc và tránh lại độc ........... 48 Hình 3.1. Khuếch đại sáu phân đoạn gen khung của virus A/PR/8/34 ứng dụng kỹ thuật RT-PCR hai bƣớc với mồi Uni12 ................................ 65 Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân bản 6 phân đoạn gen mã hóa các protein khung của virus NIBRG-14 ................................. 66 Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR chọn dòng khuẩn lạc mang sáu phân đoạn gen khung, sử dụng cặp mồi đặc hiệu của từng phân đoạn gen và cặp mồi bắt cặp trên plasmid ........................ 69 xiii Hình 3.4. Dòng hóa các phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus PR8 vào plasmid pHW2000............................................................................... 72 Hình 3.5. Điện di sản phẩm cắt sáu plasmid mang sáu phân đoạn gen khung bằng enzyme giới hạn............................................................... 73 Hình 3.6. Chọn dòng khuẩn dƣơng tính với plasmid pHW2000 tái tổ hợp bằng phƣơng pháp conoly-PCR .......................................................... 75 Hình 3.7. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của sáu phân đoạn gen khung với mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid pHW2000 ................. 77 Hình 3.8. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt sáu plasmid pHW2000 tái tổ hợp mang sáu phân đoạn gen khung bằng cặp enzyme NheI và SmaI....... 78 Hình 3.9. Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc............................................................. 80 Hình 3.10. Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR các dòng E. coli DH5α dƣơng tính với gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c ..................... 82 Hình 3.11. Kiểm tra sự có mặt của gen HA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c trong plasmid pHW2000............................................................................... 83 Hình 3.12. Trình tự nucleotide và amino acid của gen NA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c ................................................................................................ 86 Hình 3.13. Điện di kiểm tra sản phẩm conoly-PCR các dòng E.coli DH5α dƣơng tính với gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c ..................... 87 Hình 3.14. Kiểm tra kết quả tách dòng gen NA vào plasmid pHW2000 ............. 88 Hình 3.15. Sơ đồ tái tạo chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c bằng di truyền ngƣợc theo nguyên tắc 6 + 2 plasmid ................................................................................. 90 Hình 3.16. Kiểm tra chất lƣợng DNA plasmid và tế bào 293T ............................ 91 xiv Hình 3.17. Điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng RT-PCR nhân gen HA của các mẫu virus tái tổ hợp thế hệ P0 thu nhận sau thí nghiệm chuyển nhiễm 6 + 2 plasmid vào tế bào 293T .................................... 97 Hình 3.18. Trình tự nucleotide gen HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 không chứa vùng độc ................ 98 Hình 3.19 Kết quả xác định hiệu giá HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 thu nhận sau 48h nhân giống trong trứng gà sạch có phôi ............................................................... 102 Hình 3.20. Kết quả xác định hiệu giá virus gián tiếp thông qua số lƣợng plaque tạo thành khi nuôi cấy virus trên tế bào MDCK .................... 103 Hình 3.21. Hiệu giá HA của các chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P5 ......................................................... 106 Hình 3.22. Điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng RT-PCR nhân bản 8 phân đoạn vRNA của virus rg-A/H5N1 ..................................................... 107 Hình 3.23. Hiệu ứng hủy hoại tế bào xuất hiện khi cấy truyền virus rgA/H5N1 vào tế bào MDCK ............................................................... 108 Hình 3.24. Hiệu giá HI trong huyết thanh sau 2 và 4 tuần tiêm phòng vaccine chứa kháng nguyên virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c của các lô gà thí nghiệm .............................. 111 Hình 4.1. Các hệ thống plasmid sử dụng trong di truyền ngƣợc tái tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A ................................................ 115 xv 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở ngƣời và gia cầm, do virus cúm A subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Nhóm virus cúm A đƣợc phân thành nhiều subtype khác nhau dựa trên protein kháng nguyên Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) với 18 subtype HA (H1- H18) và 11 subtype NA (N1 - N11). Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI H5N1) thƣờng gây chết gia cầm hàng loạt, có thể lây nhiễm sang ngƣời nên luôn là mối nguy hiểm tiềm ẩn trong chăn nuôi gia cầm và sức khỏe cộng đồng. Biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu quả nhất là tiêm phòng vaccine. Trong quá trình sản xuất vaccine phòng chống virus A/H5N1 (thuộc nhóm virus có hệ gen dễ biến đổi do đột biến và tái tổ hợp gen), yếu tố chủng virus gốc bảo đảm tính an toàn và có khả năng bảo hộ cao với chủng lƣu hành là rất cần thiết. Để tái tạo đƣợc chủng virus đáp ứng tiêu chí của chủng ứng viên vaccine cúm A, kỹ thuật di truyền ngƣợc (reverse genetics) thƣờng đƣợc các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng với ƣu điểm: Cho phép thao tác với genome virus, tạo một hoặc một số biến đổi trong gen để loại bỏ các yếu tố tạo nên độc lực của chủng virus, giúp tạo chủng virus tái tổ hợp an toàn (có độc lực thấp) và mang các đặc tính mong muốn trong thời gian ngắn. Ở Việt Nam, công tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ năm 2003 (dịch cúm do virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến nay vẫn chủ yếu sử dụng chủng virus gốc tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngƣợc có nguồn gốc từ nƣớc ngoài. Sự phụ thuộc vào chủng giống nhập ngoại khiến công tác sản xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam thiếu tính chủ động và gặp nhiều khó khăn, đặc biệt khi các chủng cúm lƣu hành trong nƣớc có thể mang tính kháng nguyên chuyên biệt, hệ gen luôn biến đổi dẫn đến vaccine tạo ra trƣớc đó có thể không đạt hiệu quả bảo hộ cao với biến chủng virus mới xuất hiện. Do vậy, để chủ động đối phó với những diễn biến phức tạp của các dịch cúm gia cầm có khả năng bùng phát, Việt Nam cần 2 xây dựng và làm chủ qui trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc (Reverse Genetics - RG) để chủ động tạo ra các chủng virus vaccine có hiệu quả bảo hộ cao với những chủng virus đang lƣu hành. Hƣớng dẫn của WHO cho phát triển chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 bằng di truyền ngƣợc là tạo chủng virus tái tổ hợp có sự sắp xếp nguồn gen theo công thức 6 + 2 gồm: 6 phân đoạn gen khung nguồn gốc từ chủng A/Puerto Rico/8/1934 H1N1 (PR8); 2 phân đoạn gen mã hóa kháng nguyên H5 và N1 của chủng virus hoang dại đang lƣu hành (chủng dự tuyển vaccine). Hiện nay, ở Việt Nam, trong số các clade virus cúm HPAI H5N1 đã và đang lƣu hành, clade 1.1 và clade 2.3.2.1c có tính tƣơng đồng kháng nguyên và đặc tính di truyền với nhiều clade khác nên đáp ứng yêu cầu của chủng dự tuyển vaccine phòng chống cúm A/H5N1. Do vậy, việc nghiên cứu tạo chủng virus A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1 đáp ứng yêu cầu làm chủng ứng viên cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm HPAI H5N1 ở gia cầm là cần thiết. Đặc biệt, việc nghiên cứu để ứng dụng thành công và làm chủ công nghệ di truyền ngƣợc trong chủ động tạo ra chủng virus vaccine là rất có ý nghĩa. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo đƣợc chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngƣợc. 3. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập cDNA của 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa các protein khung của virus cúm A/PR/8/34 và tách dòng riêng rẽ từng gen vào plasmid pHW2000. 2. Thiết kế và tách dòng hai gen H5 HA (đã đƣợc loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc và tránh lại độc) và hai gen N1 NA của chủng A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Viet Nam/HT- 3 02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000. 3. Chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn gen khung + 2 plasmid mang gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rgA/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. 4. Phân lập và tuyển chọn chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng yêu cầu của chủng ứng viên vaccine: Có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền. 5. Xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu của hai chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ở gà sạch 3 ngày tuổi. 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn Kế t quả đa ̣t đƣơ ̣c của luâ ̣n án có ý nghĩa về lý luận và thƣ̣c tiễn vì đã làm chủ đƣợc công nghệ di truyền ngƣợc để tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm ứng viên cho sản xuất vaccine đáp ứng nhanh, đặc hiệu với chủng virus đang lƣu hành. 4.1. Ý nghĩa lý luận Kế t quả nghiên cƣ́u của luận án cung cấp cơ sở khoa học cho nghiên cứu và ứng dụng công nghệ di truyền ngƣợc để lắp ráp nhân tạo chủng giống gốc cho sản xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn 1. Tạo đƣ ợc bộ plasmid đơn gen mang 6 phân đoạn cDNA mã hóa các protein khung của virus cúm A/PR/8/34 (H1N1) - nguồn cung cấp gen khung đƣợc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo nên sử dụng trong nghiên cứu tái tạo chủng cúm tái tổ hợp ứng viên cho sản xuất vaccine cúm vô hoạt. Bộ plasmid mang các gen phân đoạn gen khung là nguồn vật liệu đƣợc chuẩn bị sẵn sàng cho sự kết hợp với các plasmid mang 2 phân đoạn gen kháng nguyên - HA và NA - của các chủng cúm A đang lƣu hành hay trong tƣơng lai sẽ xuất hiện để kịp thời lắp ráp nhân tạo chủng virus cúm tái tổ hợp làm ứng viên cho sản xuất vaccine. 4 2. Thiết kế đƣợc sơ đồ cấu trúc gen kháng nguyên HA và NA thích hợp làm ứng viên gen kháng nguyên cho tạo chủng virus vaccine. Trên cơ sở các cấu trúc gen đã thiết kế, trong tƣơng lai khi có các chủng cúm HPAI HxNy mới xuất hiện, dựa trên trình tự nucleotide đã đƣợc xác định của các gen kháng nguyên của virus mới, có thể nhanh chóng sinh tổng hợp nhân tạo các gen HA và NA làm ứng viên gen kháng nguyên cho lặp ráp chủng virus ứng viên vaccine phòng chống virus HPAI HxNy bằng công nghệ di truyền ngƣợc. 3. Tái tạo và chọn lọc đƣợc hai chủng virus vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-clade 2.3.2.1c phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus HPAI H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c gây nên. Hai chủng virus tái tổ hợp có khả năng thích ứng nhân giống trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024), có tính ổn định di truyền về gen kháng nguyên và kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (HI ≥ 4 log2) ở gà sạch 3 ngày tuổi. 5. Đóng góp mới của luận án 1. Là công trình khoa học đầu tiên chứng minh Việt Nam đã làm chủ công nghệ di truyền ngƣợc để tái tạo hiệu quả chủng virus ứng viên vaccine cúm A. 2. Đã tối ƣu một số yếu tố công nghệ trong qui trình chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp: Công thức chuyển nhiễm thích hợp là sử dụng hóa chất chuyển nhiễm Lipofectamine-2000 trong thời gian 30 phút, nồng độ plasmid thích hợp cho chuyển nhiễm là 1,0 µg/ 1 plasmid. 3. Tạo hai chủng virus ứng viên vaccine (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rgA/H5N1 clade 2.3.2.1c) có bộ genome gồm 6 phân đoạn gen của virus A/PR/8/34 và 2 phân đoạn gen kháng nguyên HA (đã đƣợc loại bỏ vùng độc, tránh lại độc) và NA của virus HPAI H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c. Các chủng virus ứng viên có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024 ở thế hệ P1 - P5), có tính ổn định di truyền gen kháng nguyên và kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể ở gà sạch 3 ngày tuổi (100% gà tiêm kháng nguyên virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 4 log2 ở tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng).