Tài liệu Nghiên cứu tạo chủng escheria coli tái tổ hợp có khả năng lên men ethanol từ đường C5 và C6

Luận văn thạc sĩ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VŨ THỊ THU HÀ VŨ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI TÁI TỔ HỢP CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN ETHANOL TỪ ĐƯỜNG C5 VÀ C6 CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN : TS. TRƯƠNG QUỐC PHONG 2009 - 2011 HÀ NỘI - 2011 i Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Trương Quốc Phong, phòng Hóa sinh và Sinh học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa học trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm đã truyền đạt cho tôi những kiến thức khoa học vô cùng bổ ích trong suốt quá trình học tập. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong phòng thí nghiệm thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn mỗi khi tôi gặp khó khăn trong làm thí nghiệm. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội ngày 30/03/2011 Học viên: Vũ Thị Thu Hà ii Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, không sao chép của ai. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào. Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Vũ Thị Thu Hà iii Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ MỤC LỤC Mục lục …………………………………………………………………………… iv Bảng thuật ngữ viết tắt ……………………………………………………………. vii Danh mục các bảng sử dụng trong luận văn ……………………………………… viii Danh mục các hình vẽ sử dụng trong luận văn …………………………………… ix Mở đầu ……………………………………………………………………………. 1 Phần I : Tổng quan tài liệu ………………………………………………………... 3 1.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới và ở Việt Nam……………………… 3 1.1.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới. …………………………………... 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol ở Việt Nam. …………………… 4 1.2. Các vấn đề gặp phải khi sản xuất bioethanol. ………………………………. 5 1.2.1. Sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu thế hệ I …………………………… 5 1.2.2. Sản xuất ethanol đi từ nguồn nguyên liệu thế hệ II………………………... 5 1.3. Tìm kiếm chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng nguồn cacbon đa dạng có 7 khả năng lên men tạo thành ethanol. 1.4. Phát triển chủng vi sinh vật có khả năng lên men đồng thời cả hai loại đường 9 C5 và C6 1.4.1. Vi khuẩn Zymomonas mobilis tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol …... 11 1.4.2. Vi khuẩn Klebsiella oxytoca tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol. …… 13 1.4.3. Nấm men Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp cho quá trình lên men 13 ethanol. 1.4.4. Vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp cho quá trình lên men ethanol. ……… 15 1.5. Đặc điểm và tính chất hóa sinh của alcohol dehydrogenase (ADH) và 16 pyruvate decacboxylase (PDC) 1.5.1. Nguồn gốc và vai trò của ADH và PDC trong tự nhiên …………………… 16 1.5.1.1. Lịch sử nghiên cứu ………………………………………………………. 16 1.5.1.2. Nguồn gốc và vai trò của enzyme ADH …………………………………. 17 1.5.2. Nguồn gốc và vai trò của enzyme PDC ……………………………………. 18 iv Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 1.5.3. Đặc điểm cấu trúc của ADH II và PDC ……………………………………. 20 1.5.3.1. Đặc điểm cấu trúc của enzyme ADH2 ………………………………… 20 1.5.3.2. Đặc điểm cấu trúc của enzyme PDC ……………………………………... 21 1.5.3.3.Vai trò của enzyme ADH II và PDC trong con đường sinh tổng hợp 23 ethanol Phần II: Vật Liệu và phương pháp nghiên cứu…………………………………… 26 2.1. Vật liệu ………………………………………………………………………. 26 2.1.1. Chủng giống vi sinh vật ……………………………………………………. 26 2.1.2. Hóa chất ……………………………………………………………………. 26 2.1.3. Trang thiết bị ……………………………………………………………….. 27 2.2. Phương pháp nghiên cứu …………………………………………………….. 28 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật ……………………………………………………. 28 2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử …………………………………………….. 29 2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số……………………………………. 29 2.2.2.2. Phương pháp nhân gen đặc hiệu (Polymerase chain reaction-PCR) …….. 30 2.2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ......................................................... 31 2.2.2.4. Phương pháp cắt enzyme giới hạn .............................................................. 31 2.2.2.5. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR ………………………………….. 32 2.2.2.6. Phương pháp nối ghép gen ......................................................................... 32 2.2.2.7. Phương pháp biến nạp vào vi khuẩn ........................................................... 32 2.2.2.8. Phương pháp tách chiết plasmid …………………………………………. 33 2.3. Phương pháp tin sinh ………………………………………………………… 34 2.4. Phương pháp lên men ethanol ………………………………………………... 35 2.4.1. Phương pháp xác định hàm lượng ethanol trong dịch lên men ……………. 36 Phần III: Kết quả và thảo luận ……………………………………………………. 37 v Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................... 37 3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu gen pdc và adhB của Zymomonas mobilis …………… 39 3.3. Tách dòng gen mã hóa hai enzyme alcohol dehydrogenase II và pyruvate 41 decarboxylase từ Zymomonas mobilis 3.3.1. Khuếch đại gen mã hóa enzyme PDC và ADH II ......................................... 41 3.3.2. Kết quả cắt nối ghép gen PDC và ADH II vào vector …………….............. 42 3.3.3. Biến nạp và sàng lọc dòng tái tổ hợp ………………………………………. 45 3.4. Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli tái tổ hợp mang gen mã hóa PDC và 54 ADH II. 3.4.1. Thiết kế vector biểu hiện mang gen pdc và adhB ………………………….. 54 3.4.2. Tạo chủng E. coli tái tô hợp mang vector biểu hiện chứa hai gen pdc và 57 adhB 3.4.3. Nghiên cứu biểu hiện enzyme pyruvate decarboxylase và alcohol 60 dehydrogenase II trong chủng chủ 3.4.3.1. Đánh giá khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp ................................. 60 3.4.3.2. Đánh giá khả năng tổng hợp PDC và ADH II trong môi trường lên men 62 chứa đường glucose và xylose Kết luận và kiến nghị .............................................................................................. 65 Tài liệu tham khảo ................................................................................................... 66 vi Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ BẢNG THUẬT NGỮ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ 1 DNA Deoxyribonucleic acid 2 Amp Ampiclin 3 bp 4 dNTP Deoxynucleotide 5 EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid 6 EtBr 7 Da Dalton 8 LB Môi trường Luria Broth 9 OD Optical Density (mật độ quang học) 10 PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng Base pair (cặp bazơ nitơ) Ethidium Bromide chuỗi trùng hợp) 11 SDS Sodium Dodecyl Sulphate 12 TAE Tris- Acetate-EDTA 13 TE Tris-EDTA 14 v/ph Vòng/phút 15 PDC (pdc) Pyruvate decacboxylase 16 ADH II; ADH2; Alcohol dehydrogenase 2 adhB 17 PDCf/ PDCr Cặp mồi xuôi/ ngược của PDC 18 ADHf/ADHr Cặp mồi xuôi/ ngược của ADH. vii Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1. Sự đa dạng các thành phần đường đơn trong quá trình thủy phân 6 cellulose từ nguyên liệu gỗ. Bảng 1.2. Những đặc điểm quan trọng đối với vi sinh vật được lựa chọn trong 9 sản xuất ethanol sinh học Bảng 2.1. Danh mục hóa chất sử dụng ........................................................ 26 Bảng 3.1. Hai trình tự mồi đặc hiệu gen pdc và adhB ……………………. 40 Bảng 3.2. Kết quả blast trình tự đoạn gen pdc được tách dòng …………... 50 Bảng 3.3. Kết quả blast trình tự đoạn gen adhB được tách dòng ………… 53 viii Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1. Hướng tiếp cận tạo sinh vật tái tổ hợp chuyển hóa lignocellulose 11 thành ethanol Hình 1.2. Con đường chuyển hóa pentose, arabinose, glucose thành ethanol…. 12 Hình 1.3. Các con đường chuyển hóa xylose ………………………………….. 14 Hình 1.4. Cấu trúc phân tử cofactor NAD+ và NADH…………………………. 18 Hình 1.5. Mô hình cấu trúc không gian của tetramer ADH2 ………………….. 20 Hình 1.6. Trung tâm hoạt động của ADH2 ……………………………………. 21 Hình 1.7. Mô hình cấu trúc không gian của enzyme PDC …………………….. 22 Hình 1.8. Cấu trúc trung tâm hoạt động của PDC ……………………………... 23 Hình 1.9. Con đường chuyển hóa đường C5 và C6 thành ethanol …………….. 24 Hình 3.1. Phổ điện di DNA tổng số của vi khuẩn Zymomonas mobilis .............. 38 Hình 3.2. Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen rDNA 16S ………. 39 Hình 3.3. Phổ điện di sản phẩm PCR của gen PDC và ADH II ......................... 41 Hình 3.4. Sơ đồ nối ghép gen đích vào vector để tạo vector tái tổ hợp ……….. 43 Hình 3.5. Kết quả cắt kiểm tra vector pTAC-MAT bằng các enzyme giới hạn 44 Hình 3.6. Kết quả cắt và kiểm tra sản phẩm PCR gen pyruvate decarboxylase 45 và gen alcohol dehydrogenase II bằng các enzyme giới hạn. Hình 3.7. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH10b ….. 46 Hình 3.8. Phổ điện di plasmid tách từ 10 khuẩn lạc được biến nạp vector tái tổ 47 hợp mang gen mã hóa PDC. Hình 3.9. Điện di sản phẩm cắt kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn 48 PstI Hình 3.10. Phổ điện di plasmid tách từ 10 khuẩn lạc được biến nạp vector tái 51 tổ hợp mang gen mã hóa ADH II . Hình 3.11. Điện di sản phẩm cắt kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn 52 Pst I. Hình 3.12. Kết quả biến nạp sản phẩm lai ghép hai gen pdc và adh II với 54 ix Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ vector vào E. coli DH10b Hình 3.13. Phổ điện di plasmid tách từ 13 dòng khác nhau …………………… 55 Hình 3.14. Kết quả kiểm tra dòng tái tổ hợp bằng PCR ……………………….. 56 Hình 3.15. Kết quả cắt kiểm tra dòng 13 (C13) bằng enzyme giới hạn ……….. 57 Hình 3.16. Biến nạp vector tái tổ hợp pHBB1807 vào E. coli ATCC11303 ...... 58 Hình 3.17. Phổ điện di plasmid tách từ các dòng E. coli ATCC11303 sau khi 58 được biến nạp pHBB1807 Hình 3.18. Phổ điện di sản phẩm PCR sử dụng plasmid làm khuôn và cặp mồi 59 với mồi xuôi là PDCf và mồi ngược là ADHr Hình 3.19. Phổ điện di cắt enzyme giới hạn kiểm tra …………………………. 60 Hình 3.20. Động học sinh trưởng của chủng E. coli ATCC 11303 .................... 61 Hình 3.21. Khả năng sinh ethanol của chủng E. coli tái tổ hợp .......................... 63   x Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ MỞ ĐẦU Theo dự đoán, sản lượng dầu mỏ trên toàn thế giới sẽ sụt giảm vào năm 2025 và cạn kiệt hoàn toàn vào năm 2050. Với những báo động trên, thế giới đang đứng trước nguy cơ rơi vào khủng hoảng năng lượng nếu không nhanh chóng tìm kiếm được những nguồn nhiên liệu mới thay thế nguồn nhiên liệu từ dầu mỏ. Vì thế, tìm kiếm nguồn năng lượng thay thế đang được các nước đặt lên hàng đầu. Trong tiến trình tìm kiếm các nguồn năng lượng thay thế, ethanol nhiên liệu nổi lên như một ứng cử viên sáng giá nhất, đáp ứng được các tiêu chuẩn như dễ sản xuất, giá rẻ và “thân thiện” với môi trường. Việc sản xuất ethanol được xem là mục tiêu chiến lược cho việc sản xuất nguồn nhiên liệu sạch, có khả năng tái tạo do ethanol có rất nhiều ưu điểm như: góp phần ổn định an ninh năng lượng, giảm thiểu phát thải khí thải gây hiệu ứng nhà kính đến 60-80%, khai thác nguồn nguyên liệu từ phụ phẩm nông nghiệp và sinh khối thực vật, góp phần nâng cao thu nhập cho người nông dân trong quá trình trồng cây lương thực. Hiện tại, 98% ethanol nhiên liệu được sản xuất từ ngũ cốc hoặc nguyên liệu liên quan đến lương thực. Đây là nguyên liệu đắt nên sẽ đẩy giá thành sản phẩm lên rất cao, làm cho hiệu quả kinh tế thấp. Trong khi đó sản xuất nông nghiệp hàng năm sản sinh ra một khối lượng khổng lồ nguyên liệu sinh khối như rơm rạ, bã mía, vỏ thân cây, … với các thành phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose. Nguyên liệu này sau khi được thủy phân sẽ giải phóng một loạt các đường đơn như glucose, mannose, galactose, xylose, arabinose,... Khi sử dụng dịch đường này cho lên men sẽ hạ được giá thành sản phẩm. Như vậy, sản phẩm thủy phân nguồn nguyên liệu lignocellulose là một hỗn hợp các loại đường gồm đường C5 và đường C6. Tuy nhiên, không có chủng vi sinh vật tự nhiên nào có khả năng lên men ethanol từ hỗn hợp các loại đường này. Xuất phát từ những yêu cầu đặt ra và tiến tới nhằm hiện thực hóa việc sản xuất bioethanol thế hệ thứ hai, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen 1 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ mã hóa PDC và ADH II từ Zymomonas mobilis lên men ethanol từ đường C5 và C6”. Đề tài tập trung vào các vấn đề sau: 1. Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzyme pyruvate decarboxylase (PDC) và alcohol dehydrogenase II (ADH II) từ Zymomonas mobilis 2. Nghiên cứu tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen mã hóa PDC và ADHII Các kết quả trong luận văn này cũng mới chỉ là một phần của các bước đi đầu tiên trên con đường phát triển nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật. Còn rất nhiều các nghiên cứu tiếp tục để có thể áp dụng được chủng vi khuẩn tái tổ hợp này vào quá trình lên men ethanol ở quy mô lớn hơn. Tuy nhiên, kết quả của đề tài cũng là một bước quan trọng làm hiện thực hóa mục tiêu phát triển nhiên liệu sinh học trong chương trình năng lượng quốc gia. 2 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới và Việt Nam 1.1.1. Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới Năm 1908, Henry T. Ford, cha đẻ của ngành công nghiệp ô tô hiện nay đã vận hành chiếc xe hơi đầu tiên của ông, chiếc Quadricycle bằng nhiên liệu cồn. Theo Ford thì cồn là “nhiên liệu của tương lai” và là loại nhiên liệu tái tạo khả thi nhất cho ngành công nghiệp ôtô vừa mới ra đời lúc bấy giờ. Nhưng vào đầu thế kỷ 20, ngành công nghiệp lọc dầu phát triển nhanh chóng, đưa xăng chiếm vị trí hàng đầu của cồn. Nhờ giá rẻ, khối lượng cung cấp lớn và nhiều tiện lợi khác, xăng đã dần dần đẩy cồn ra khỏi thị trường nhiên liệu ôtô. Hiện nay, do giá dầu cao nên ở nhiều nước vị trí của cồn đang được phục hồi, và nhiên liệu này được xem là một hướng ưu tiên trong chính sách phát triển nhiên liệu tái tạo. Công nghiệp sản xuất cồn nhiên liệu cũng đang phát triển mạnh mẽ ở các nước châu Âu. Với mục tiêu giảm phụ thuộc vào nhiên liệu hóa thạch, EU đặt mục tiêu đến năm 2010 các loại nhiên liệu sinh học sẽ chiếm 5,7 % tổng mức tiêu thụ nhiên liệu trong giao thông vận tải [32], [49], [52], [85]. Ở Mỹ, trong tháng 6/2006, Bill Ford, cháu của Henry Ford, cùng các ông chủ của các hãng xe khổng lồ của Mỹ như General Motors, Chrysler đã cùng với Tổng thống Bush thảo luận tìm giải pháp để cồn được dùng nhiều hơn trong ngành vận tải, cụ thể là yêu cầu chính phủ cung cấp tài chính để xây dựng hệ thống phân phối cồn nhiên liệu trên toàn Liên bang. Từ năm 1990 đến nay, do giá dầu tăng liên tục nên cồn được đưa vào chương trình an ninh năng lượng Mỹ. Ở châu Mỹ, Braxin sau gần 30 năm nghiên cứu và ứng dụng cồn làm nhiên liệu thay thế xăng dầu, đã trở thành quốc gia sản xuất cồn lớn nhất thế giới và là nước nắm vững nhất kỹ thuật sản xuất cồn nhiên liệu. Hiện nay Braxin là nước xuất khẩu cồn lớn nhất thế giới, chiếm tới 39,8% thương mại của thế giới. Ở châu Á, do đặc điểm khí hậu, với nguồn nguyên liệu sinh khối giàu có, tốc độ tăng trưởng cồn nhiên liệu rất ấn tượng: Năm 1984, tổng sản lượng cồn nhiên liệu là 1,5 triệu tấn. Năm 1990, tăng lên 3 triệu tấn, năm 2004 là 6 triệu tấn. Theo dự đoán, 3 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ tổng sản lượng cồn nhiên liệu trong khu vực đạt tới 15 triệu tấn vào năm 2010. Các nước trong khu vực như Thái Lan, Philippines, Indonesia, Campuchia đều xây dựng cho mình chương trình nghiên cứu và phát triển năng lượng cồn nhiên liệu cho mục tiêu tiêu dùng nội địa và xuất khẩu. Thái Lan đã có chính sách sản xuất cồn nhiên liệu từ 10 năm nay. Trung Quốc bắt đầu sản xuất cồn nhiên liệu từ 1990 thông qua sử dụng phế liệu ngũ cốc. Trong kế hoạch 2006-2010 Chính phủ đặt mục tiêu sản xuất 6 triệu tấn cồn, phục vụ cho vận tải trong các thành phố lớn. Chính phủ đang tăng cường hỗ trợ cho năng lượng sinh khối và hoạt động sản xuất cồn. Trong kế hoạch xã hội-kinh tế 5 năm lần thứ 11 (2006-2010) đã xác định rõ nhiệm vụ sản xuất nhiên liệu này cần tăng mạnh trong những năm tới. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol ở Việt Nam Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu khởi đầu cho phát triển công nghệ ethanol từ biomass đã và đang được triển khai. Một nghiên cứu đã được thực hiện tại Đại học Bách khoa Tp HCM và phát triển thành dự án xây dựng mô hình ”Thị trấn Biomasse” trong đó ethanol sau khi được tạo ra từ dịch thủy phân của phế thải nông nghiệp sẽ phục vụ trở lại nhu cầu năng lượng của địa phương. Một nghiên cứu khác đã được thực hiện tại Viện Công nghiệp thực phẩm về việc nghiên cứu phát triển và thử nghiệm công nghệ và dây truyền thiết bị cho sản xuất ethanol khan sử dụng nguồn đường thu được từ dịch thủy phân phế thải nông nghiệp như bã mía, rơm lúa. Các nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách khoa Hà Nội thử nghiệm sử dụng enzyme thương mại để thủy phân cỏ voi, sử dụng chế phẩm enzyme tái tổ hợp tạo ra để thủy phân bã mía nhằm chuyển hóa các nguồn nguyên liệu này thành ethanol. Thực hiện Đề án chiến lược phát triển nhiên liệu sinh học, năm 2009 chính thức đánh dấu sự ra đời của ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học tại Việt Nam, với sự tăng tốc nhanh chóng của các dự án đầu tư sản xuất ethanol nhiên liệu nhờ nguồn nhiên liệu thế hệ I là sắn, mía. Theo kế hoạch, đến 2011, sẽ đưa vào vận hành 5 cơ sở sản xuất ethanol nhiên liệu với tổng công suất thiết kế 380.000 tấn/năm đủ để pha 7,6 4 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ triệu tấn xăng E5, vượt mục tiêu của “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học” đề ra về số lượng và thời gian (Bộ Công thương, 2010). 1.2. Các vấn đề gặp phải khi sản xuất bioethanol. 1.2.1. Sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu thế hệ I. Nguồn nguyên liệu dùng để lên men sản xuất ethanol là các loại đường, các loại tinh bột hay từ sinh khối cellulose. Hiện nay, 98% bioethanol được sản xuất từ ngũ cốc như bột ngô (Mỹ), bột lúa mỳ hay củ cải đường (Châu Âu), đường mía (Châu Mỹ với sự phát triển mạnh mẽ ở Brazil), hay tinh bột sắn (Châu Á), trong đó chi phí nguyên liệu chiếm tới 50 – 70% giá thành. Như vậy, tính kinh tế của cồn làm từ ngũ cốc không khả thi do giá thành để mua nguyên liệu từ ngũ cốc chiếm tới 60% chi phí sản xuất ra cồn và chi phí này được tính theo giá trị của lương thực chứ không tính theo giá trị về năng lượng. Hiện nay, các nhà máy sản xuất bioethanol từ ngũ cốc không thể tồn tại được nếu không có chính sách trợ giá của chính phủ từ các quốc gia (8.5 cent/lit ở Canada; 54 cent US/ gallon ở Mỹ). Việc sản xuất bioethanol từ nguồn nguyên liệu thực phẩm hoặc từ ngành công nghiệp thực phẩm đã gây lên sự cạnh tranh với sự cung ứng thực phẩm, đe dọa vấn đề an ninh lương thực toàn cầu. Điều này được đặc biệt nhận thức rõ trong thời điểm hiện tại khi vào tháng 5/2008, giá lương thực tăng cao 180% so với 3 năm trước đây. Tổ chức Nông lương thế giới cho rằng một lý do quan trọng gây nên sự bất ổn định lương thực hiện nay là sự tăng cao tỷ trọng ethanol sản xuất từ ngô của Mỹ trong vòng 3 năm vừa qua. Ngoài ra việc sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu thực phẩm này sẽ dẫn đến giá thành sản phẩm rất cao, làm cho hiệu quả kinh tế thấp. Nhìn nhận một cách tổng quát, cồn nhiên liệu đang được chú ý phát triển và đưa vào chương trình an ninh năng lượng của rất nhiều quốc gia trên toàn thế giới trong đó có cả Việt Nam. 1.2.2. Sản xuất ethanol đi từ nguồn nguyên liệu thế hệ II. Sản xuất nông nghiệp và công nghiệp hàng năm sản sinh một khối lượng khổng lồ nguyên liệu sinh khối trong đó có sinh khối cellulose. Nếu lượng sinh khối này được 5 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ chuyển thành các dạng nguyên liệu có thể lên men được, chúng sẽ trở thành nguồn nguyên liệu rất hấp dẫn cho ngành công nghiệp sản xuất cồn. Khi đó chi phí nguyên liệu trong sản xuất cồn chỉ còn 35 – 40% so với ethanol sản xuất từ tinh bột. Với mục tiêu tìm kiếm nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền, có khả năng tái sử dụng cho quá trình sản xuất cồn sinh học, sinh khối lignocellulose với các thành phần chủ yếu là các polyme: cellulose (45% trong gỗ), hemicellulose (31% trọng lượng khô tổng số của sinh khối) và lignin khá dồi dào từ phụ phẩm nông – lâm nghiệp như: rơm, chấu, thân cây, gỗ,… chất thải có bản chất thực vật từ các khu dân cư… đang trở thành đối tượng được chú trọng nghiên cứu tại nhiều quốc gia khác nhau hiện nay. Bảng 1.1. Sự đa dạng các thành phần đường đơn trong quá trình thủy phân cellulose từ nguyên liệu gỗ. (tính theo % khối lượng) [17] Tên đường Gỗ mềm Gỗ mềm đã Gỗ cứng bóc vỏ Gỗ cứng đã bóc vỏ Glucose 61 – 65 57 - 63 55 – 73 53 - 65 Xylose 9 – 13 11 – 15 20 – 39 18 – 36 Mannose 7 – 16 6 -16 0.4 – 4 0.3 – 3 Galactose 6 – 17 1 -5 1–4 1–6 Arabinose < 3.5 4 – 11 <1 2–8 Rhamnose <1 <1 <1 <1 Uronic acids 4 -7 --- 4 -7 ---- Dựa vào bảng số liệu về thành phần của các loại đường đơn thu được trong quá trình thủy phân cellulose ta thấy: Xylose là loại đường có tỷ lệ chiếm vị trí thứ hai sau glucose, sau đó là mannose và galactose. Như vậy, để sử dụng nguồn lignocellulose làm nguồn cơ chất trong quá trình thủy phân sản xuất bioethanol thì một thách thức đặt ra là ngoài đường 6 cacbon, cần phải tìm kiếm giải pháp chuyển hóa được cả đường 5 cacbon (xylose, arabinose) tạo thành ethanol. Một trong những giải phát được đưa ra đó là tìm kiếm, lựa chọn và tạo chủng vi sinh vật có khả năng lên men ethanol từ hỗn hợp các loại đường là sản phẩm của quá trình thủy phân từ sinh khối cellulose. 6 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ 1.3. Tìm kiếm chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng nguồn cacbon đa dạng có khả năng lên men tạo thành ethanol. Vi sinh vật là nhân tố đóng vai trò then chốt trong quá trình lên men sản xuất ethanol, dù quá trình sản xuất đi từ bất cứ nguồn nguyên liệu ban đầu nào. Những phương pháp lên men với đường 6 cacbon đã được biết đến trước đây ít nhất 6000 năm khi người Xume, người Babylon, người Ai cập bắt đầu hoàn chỉnh và miêu tả quá trình sản xuất bia từ ngũ cốc (tinh bột). Đến cuối thế kỉ 19, sau khi quá trình thủy phân lignocellulose từ cây trồng tạo thành đường 6 cacbon được tiến hành dễ dàng thì sự chuyển hóa đường 5 cacbon trở thành vấn đề được quan tâm nhất. Đường 5 cacbon chiếm tỷ lệ phần trăm cao trong các loại đường đơn thu nhận được từ quá trình thủy phân lignocellulose, khả năng đồng hóa và chuyển chúng thành ethanol là rất quan trọng khi xét về năng suất và tính kinh tế của quá trình. Chỉ đến những năm 1980 những nghiên cứu về sự lên men xylose mới được bắt đầu với đồ uống có cồn lên men từ hoa quả, khi một số loại men bia hoang dã đã được xác định rằng có thể chuyển đổi xylose thành ethanol. Trong quá trình tìm kiếm chủng vi sinh vật có hoạt lực cao, có khả năng lên men được đường 5 cacbon thành ethanol, vi khuẩn đã thu hút được sự chú ý đặc biệt nhờ tốc độ lên men nhanh trong quá trình lên men. Tất cả những chủng vi sinh vật tự nhiên được tuyển chọn hiện nay đều có những hạn chế: hoặc là không có khả năng lên men đối với cả hai loại đường 5 và 6 cacbon, hiệu suất tạo ethanol thấp hoặc sự tạo ra sinh khối tế bào dễ bị kìm hãm bởi nồng độ ethanol. Cho đến thời điểm hiện nay, trong sản xuất ethanol trên quy mô công nghiệp, chủng được sử dụng phổ biến nhất là Saccharomyces cerevisiae nhờ có nhiều ưu điểm nổi trội [83]. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của nấm men này là chịu nồng độ ethanol kém, tối đa là 60g/l, và cơ chế xúc tác cơ chất khá chậm làm kéo dài thời gian lên men. Một số công trình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Zymomonas mobilis thay thế nấm men nhờ có những ưu điểm vượt trội về: tốc độ phát triển nhanh hơn, dễ điều chỉnh con đường chuyển hóa bậc cao cũng như khả năng chịu nồng độ ethanol tốt hơn, hiệu suất tạo ethanol cao gấp 2.5 lần nấm men [19]. Nhưng nhược điểm của vi khuẩn này là chỉ lên men được các loại đường 6 cacbon như glucose, fructose, hay saccarose 7 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ mà không có khả năng lên men được các loại đường 5 cacbon như xylose, arabinose,… [19], [36]. Tuy nhiên, hiện nay bằng con đường biến đổi gen Zymomonas mobilis tái tổ hợp đã có khả năng sử dụng đường 5 cacbon như xylose, arabinose tạo ethanol [55], [87]. Hướng tiếp cận dùng công nghệ gen để tạo chủng tái tổ hợp cũng đã được áp dụng thành công trên Saccharomyces cerevisiae [81], tuy nhiên các chủng tái tổ hợp không được sử dụng trong công nghiệp vì lí do tính di truyền không ổn định dẫn tới việc chuyển hóa cũng như hiệu suất tạo ethanol thấp. Ngoài ra, các loại vi khuẩn khác như Clostridium thermocellum [16], Clostridium acetobutylicum [37] nhờ khả năng tự nhiên lên men cellulose, hemicellulose, tinh bột thành ethanol cũng đã được tiến hành nghiên cứu song không đạt hiệu quả bằng Saccharomyces cerevisiae hay Zymomonas mobilis. Các nhà khoa học thuộc viện nghiên cứu khoa học quốc gia Mỹ (NAS) đã tạo ra được một chủng vi khuẩn theo phương pháp di truyền học, có thể giúp giảm giá thành sản xuất bioethanol từ hợp chất cellulose. Theo ông Lee Lynd, tác giả của nghiên cứu khoa học trên, các chủng vi khuẩn được sinh ra tự nhiên cũng có thể giúp lên men cellulose nhưng với điều kiện chỉ xảy ra ở nhiệt độ thấp và cần phải sử dụng một loại enzym rất đắt là cellulase. Loại vi khuẩn mới này, được tạo ra từ loại vi khuẩn yếm khí ưa nhiệt Thermoanaerobacterium saccharolyticum đã được loại các gen liên quan đến quá trình tạo ra các axit hữu cơ, được gọi là ALK2, có thể giúp lên men tất cả các loại đường ở nhiệt độ 500C, trong khi các loại vi khuẩn thông thường khác không thể làm được điều này khi nhiệt độ vượt quá 370C. Mặt khác, trong khi quá trình lên men thông thường hiện nay tạo ra các loại axit hữu cơ cùng với cồn ethanol, thì với phương pháp sử dụng vi khuẩn mới ALK2 sẽ cho sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men là ethanol. Với vi khuẩn ALK2, phương pháp sản xuất cồn từ cellulose – trữ lượng sinh khối lớn nhất trên thế giới, đã mở ra một hướng đi mới trong việc sản xuất nhiên liệu sạch vừa góp phần chống lại sự biến đổi khí hậu, vừa không ảnh hưởng đến sản lượng lương thực. Sự thủy phân các polyme cao phân tử như cellulose và hemicellulose sẽ giải phóng ra một hỗn hợp các đường đơn như đã chỉ ra trong bảng. Tuy nhiên, trong tự 8 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ nhiên không có một sinh vật nào có khả năng chuyển hóa nhanh và hiệu quả hỗn hợp đường khác nhau này thành ethanol. Điều đó là do sự thiếu hụt một hoặc một số enzyme quan trọng tham gia vào con đường chuyển hóa đường tạo thành ethanol. Do đó, một hướng nghiên cứu đã và đang được tiến hành đó là dùng công nghệ gen để tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng lên men được hỗn hợp các loại đường thu được từ dịch thủy phân sinh khôi thực vật và phế thải nông nghiệp với hiệu xuất cao. 1.4. Phát triển những chủng vi sinh vật có khả năng lên men đồng thời cả hai loại đường C5 và C6 Trong suốt hai thập kỉ qua, nhiều chủng vi sinh vật đã được nghiên cứu, cải biến để có thể ứng dụng trong sản xuất ethanol sinh học. Sinh khối lignocellulose có chứa hợp chất cacbonhydrates phức tạp đòi hỏi phải có những chủng vi sinh vật có khả năng lên men được các loại đường mà nấm men thông thường không thể lên men được. E. coli và K. oxytoca là những vi sinh vật tự nhiên có thể sử dụng một phổ rộng các loại đường nhưng không có khả năng lên men thành ethanol. Đối với Zymomonas mobilis mặc dù có khả năng men ethanol đạt hiệu suất cao nhưng chỉ có khả năng lên men được đường glucose và fructose. Những đặc tính quan trọng đối với một chủng vi sinh vật được chọn lựa cho sự lên men ethanol: Bảng 1.2. Những đặc điểm quan trọng đối với vi sinh vật được lựa chọn trong sản xuất ethanol sinh học. [19] Đặc điểm Yêu cầu đặt ra Hiệu suất tạo cồn > 90 % theo lý thuyết Khả năng chịu cồn > 40 g/l Khả năng sinh ethanol > 1 g/l/h Các yếu tố dinh dưỡng Rẻ tiền Khả năng sinh trưởng trong dịch thủy Ít bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế phân không pha loãng trong dịch thủy phân 9 Vũ Thị Thu Hà Luận văn thạc sĩ Do đó một số nghiên cứu cải biến gen đã được thực hiện trên những vi sinh vật này để có thể tạo ra chủng tái tổ hợp có thể lên men tạo thành ethanol từ nhiều loại đường khác nhau. Các loại vi sinh vật đã được cải biến gen như: vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis, Zymobacter palmae) [34], vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis), nấm men (Saccharomyces cerevisiae). Việc cải biến gen để tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng lên men ethanol từ hỗn hợp đường từ dịch thủy phân sinh khối có thể được thực hiện theo hai hướng tiếp cận: - Đưa các gen mã hóa các enzyme tham gia thủy phân lignocellulose từ các chủng tự nhiên vào các chủng vi sinh vật có khả năng lên men cồn nhưng lại thiếu hụt những enzyme thủy phân này. - Đưa các gen quan trọng của con đường chuyển hóa tạo ethanol từ các chủng có khả năng lên men cồn vào các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng được hỗn hợp các loại đường. 10 Vũ Thị Thu Hà