Tài liệu Nghiên cứu tạo chế phẩm chitosan – nano bạc ứng dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch

MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT …………………………...viii DANH MỤC CÁC BẢNG ………….……………………………………………....x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ………….………………………………xii MỞ ĐẦU ………….…………………………………………………………………1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 4 1.1 Đặc điểm của chitosan ................................................................................. 4 1.1.1 Chitosan ....................................................................................................... 4 1.1.2 Sản xuất chitosan ......................................................................................... 4 1.1.2.1 Các phương pháp sản xuất chitosan ..................................................... 4 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu quy trình sản xuất tại Việt Nam ........................ 5 1.1.3 Các tính chất của chitosan ........................................................................... 5 1.1.3.1 Tính chất vật lý của chitosan ................................................................ 5 1.1.3.2 Tính chất hóa học của chitosan ............................................................ 6 1.1.3.3 Tính chất sinh học của chitosan ........................................................... 6 1.1.4 Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan ...................................................... 7 1.1.4.1 Khả năng kháng vi sinh vật của chitosan ............................................. 7 1.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng vi sinh vật của chitosan ... 7 1.1.4.3 Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan ................................................. 9 1.1.5 Ứng dụng của chitosan trong bảo quản rau quả tươi ................................... 9 1.2 Tổng quan về nano bạc .............................................................................. 12 1.2.1 Giới thiệu về công nghệ nano .................................................................... 12 1.2.1.1 Vật liệu nano ...................................................................................... 12 1.2.1.2 Phân loại vật liệu nano ....................................................................... 12 1.2.1.3 Cơ sở khoa học của công nghệ nano .................................................. 13 1.2.2 Tính chất lý học của hạt nano bạc ............................................................. 13 1.2.2.1 Tính chất quang .................................................................................. 13 1.2.2.2 Tính chất điện và nhiệt ....................................................................... 14 1.2.2.3 Hiệu ứng bề mặt ................................................................................. 14 1.2.3 Tổng hợp hạt nano bạc............................................................................... 14 1.2.4 Đặc tính kháng vi sinh vật của nano bạc ................................................... 15 1.2.4.1 Khả năng kháng vi sinh vật của nano bạc .......................................... 15 1.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của nano ............. 16 1.2.4.3 Cơ chế kháng vi sinh vật của nano bạc .............................................. 17 1.2.5 Ứng dụng của nano bạc trong bảo quản rau quả tươi ................................ 18 iii 1.3 Ứng dụng của nano bạc kết hợp với các loại màng và màng chitosan trong bảo quản thực phẩm .................................................................................................. 20 1.3.1 Ứng dụng của nano bạc kết hợp với màng polyme không phân huỷ sinh học ……. .................................................................................................................. 20 1.3.2 Ứng dụng của nano bạc kết hợp với màng polyme phân huỷ sinh học ..... 21 1.3.3 Ứng dụng của nano bạc kết hợp với màng chitosan trong bảo quản thực phẩm….. ................................................................................................................... 22 1.3.4 Sự giải phóng nano bạc từ màng bao vào thực phẩm ................................ 23 1.4 Giới thiệu một số loại quả sử dụng trong nghiên cứu và phương pháp bảo quản quả tại Việt Nam .............................................................................................. 24 1.4.1 Tình hình sản xuất và xuất khẩu quả tại Việt Nam ................................... 24 1.4.1.1 Giới thiệu chung về các loại quả sử dụng trong nghiên cứu .............. 24 1.4.1.2 Những biến đổi của quả sau thu hoạch .............................................. 25 1.4.1.3 Các bệnh của quả sau khi thu hoạch .................................................. 27 1.4.2 Một số phương pháp bảo quản quả sau thu hoạch..................................... 27 1.4.2.1 Công nghệ bảo quản bằng phương pháp xử lý nhiệt .......................... 28 1.4.2.2 Công nghệ bảo quản trong môi trường thay đổi thành phần khí quyển………. ........................................................................................................... 28 1.4.2.3 Công nghệ bảo quản bằng hóa chất .................................................... 29 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 32 2.1 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 32 2.1.1 Phế liệu tôm ............................................................................................... 32 2.1.2 Vi sinh vật .................................................................................................. 32 2.1.3 Các loại quả sử dụng trong nghiên cứu ..................................................... 32 2.1.4 Nguyên vật liệu khác ................................................................................. 33 2.1.4.1 Hóa chất ............................................................................................. 33 2.1.4.2 Môi trường.......................................................................................... 33 2.1.5 Thiết bị nghiên cứu .................................................................................... 33 2.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 33 2.2.1 Nội dung và phương pháp thực nghiệm .................................................... 33 2.2.1.1 Phương pháp tạo chế phẩm Chitin và chitosan .................................. 33 2.2.1.2 Phương pháp tinh sạch chitosan ......................................................... 35 2.2.1.3 Phương pháp tạo nano bạc ................................................................. 36 2.2.1.4 Phương pháp xác định khả năng kháng vi sinh vật của chế phẩm chitosan……. ............................................................................................................ 38 2.2.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của nano bạc ...... 40 2.2.1.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của chế phẩm chitosan-nano bạc ..................................................................................................... 40 iv 2.2.1.7 Phương pháp ứng dụng chế phẩm chitosan – nano bạc trong bảo quản vải thiều, cam và bưởi .............................................................................................. 41 2.2.2 Phương pháp phân tích .............................................................................. 43 2.2.2.1 Xác định độ deacetyl của chitosan bằng phương pháp UV ............... 43 2.2.2.2 Xác định độ nhớt của chitosan ........................................................... 43 2.2.2.3 Xác định độ hòa tan của chế phẩm chitosan thô ................................ 44 2.2.2.4 Tỷ lệ hao hụt ....................................................................................... 44 2.2.2.5 Phân tích hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp trung hòa ........ 44 2.2.2.6 Xác định màu của quả ........................................................................ 45 2.2.2.7 Xác định hàm lượng đường và chất khô hòa tan tổng số ................... 45 2.2.2.8 Xác định lượng tồn dư nano bạc trong quả vải bằng phổ hấp thụ nguyên tử AAS ......................................................................................................... 46 2.2.2.9 Phương pháp xác định tro, protein ..................................................... 46 2.2.2.10 Phương pháp xử lý thống kê .............................................................. 47 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 48 3.1 Một số cải tiến trong quá trình sản xuất chitosan tinh khiết để làm nguyên liệu cho chế tạo chế phẩm chitosan – nano bạc ........................................................ 48 3.1.1 Tạo chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sinh học ............................ 48 3.1.2 Tạo chitosan có độ deacetyl hóa cao ......................................................... 49 3.1.2.1 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến độ deacetyl ....................... 49 3.1.2.2 Quá trình deacetyl 2 giai đoạn............................................................ 50 3.1.3 Tinh sạch chitosan và ảnh hưởng của chế độ sấy đến tính chất của chitosan… ................................................................................................................. 52 3.1.4 Khả năng kháng vi sinh vật của chitosan .................................................. 54 3.1.4.1 Ảnh hưởng của pH đệm pha chitosan đến khả năng phát triển của vi sinh vật…….. ............................................................................................................ 55 3.1.4.2 Khả năng kháng vi khuẩn của chitosan .............................................. 56 3.1.4.3 Khả năng kháng nấm men của chitosan ............................................. 58 3.1.4.4 Khả năng kháng nấm mốc của chitosan ............................................. 58 3.2 Một số cải tiến trong quá trình tổng hợp keo nano bạc làm nguyên liệu cho chế tạo chế phẩm chitosan – nano bạc...................................................................... 62 3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đặc tính của dung dịch keo nano bạc .......... 62 3.2.2 Ảnh hưởng của tốc độ nhỏ dịch đến tính chất hạt nano bạc ...................... 63 3.2.3 Một số đặc tính của hạt nano bạc............................................................... 64 3.2.3.1 Hình ảnh dung dịch nano bạc ............................................................. 64 3.2.3.2 Phân tích hạt nano bạc bằng UV – vis ............................................... 64 3.2.3.3 Đặc điểm hạt nano bạc qua kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) ............................................................................. 65 3.2.4 Khả năng kháng vi sinh vật của dung dịch nano bạc................................. 66 v 3.2.4.1 Khả năng kháng vi khuẩn của nano bạc ............................................. 67 3.2.4.2 Khả năng kháng nấm men của nano bạc ............................................ 67 3.2.4.3 Khả năng kháng nấm mốc của nano bạc ............................................ 68 3.3 Tạo chế phẩm chitosan – nano bạc và xác định đặc tính của chế phẩm.... 70 3.3.1 Quy trình phối trộn .................................................................................... 70 3.3.2 Một số tính chất hóa lý của chế phẩm chitosan – nano bạc....................... 70 3.3.3 Tính ổn định của chế phẩm chitosan – nano bạc ....................................... 72 3.3.4 Khả năng kháng vi sinh vật in vitro của chế phẩm chitosan-nano bạc...... 72 3.3.4.1 Khả năng kháng vi khuẩn của chế phẩm chitosan-nano bạc .............. 73 3.3.4.2 Khả năng kháng nấm men của chế phẩm chitosan-nano bạc ............. 77 3.3.4.3 Khả năng kháng nấm mốc của chế phẩm chitosan-nano bạc ............. 79 3.4 Ứng dụng chế phẩm chitosan – nano bạc trong bảo quản quả vải thiều ... 81 3.4.1 Ảnh hưởng của chế độ tiền xử lý đến quá trình bảo quản vải thiều .......... 82 3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ thành phần chế phẩm đến quá trình bảo quản vải thiều…… .................................................................................................................. 85 3.4.2.1 Sự biến đổi các chỉ tiêu lý hóa của quả vải ........................................ 86 3.4.2.2 Sự biến đổi tỷ lệ thối hỏng quả vải..................................................... 88 3.4.2.3 Sự biến đổi chỉ tiêu vi sinh vật trong quá trình bảo quản quả ............ 89 3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường bảo quản .......................................... 90 3.4.3.1 Sự biến đổi các chỉ tiêu chất lượng của quả....................................... 90 3.4.3.2 Sự biến đổi tỷ lệ thối hỏng của quả .................................................... 92 3.4.4 Tồn dư nano bạc trên vỏ quả vải ............................................................... 93 3.4.5 Quy trình bảo quản vải bằng chế phẩm chitosan – nano bạc .................... 95 3.5 Ứng dụng chế phẩm chitosan – nano bạc trong bảo quản cam sành ......... 95 3.5.1 Ảnh hưởng của chế độ tiền xử lý đến quá trình bảo quản cam sành ......... 95 3.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ thành phần chế phẩm ......................................... 98 3.5.2.1 Sự biến đổi các chỉ tiêu lý hóa của quả .............................................. 98 3.5.2.2 Sự biến đổi tỷ lệ thối hỏng của quả .................................................. 100 3.5.2.3 Sự biến đổi chỉ tiêu vi sinh vật trong quá trình xử lý bằng chế phẩm……….. ......................................................................................................... 100 3.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường bảo quản ........................................ 101 3.5.3.1 Sự biến đổi các chỉ tiêu lý hóa của quả ............................................ 101 3.5.3.2 Sự biến đổi tỷ lệ thối hỏng quả ........................................................ 103 3.5.4 Quy trình bảo quản cam sành bằng chế phẩm chitosan – nano bạc ........ 104 3.6 Ứng dụng chế phẩm chitosan – nano bạc trong bảo quản quả bưởi Diễn104 3.6.1 Ảnh hưởng của chế độ tiền xử lý tới quá trình bảo quản quả bưởi ......... 104 3.6.1.1 Sự biến đổi các chỉ tiêu lý hóa của quả bưởi Diễn ........................... 104 3.6.1.2 Sự biến đổi tỷ lệ thối hỏng quả ........................................................ 106 vi 3.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ thành phần chế phẩm ....................................... 107 3.6.2.1 Sự biến đổi các chỉ tiêu lý hóa của quả ............................................ 107 3.6.2.2 Sự biến đổi chỉ tiêu vi sinh vật trong quá trình xử lý bằng chế phẩm……….. ......................................................................................................... 110 3.6.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường bảo quản ........................................ 110 3.6.4 Quy trình bảo quản quả bưởi Diễn bằng chế phẩm chitosan – nano bạc 112 3.7 Thảo luận về ứng dụng chế phẩm bảo quản quả ..................................... 112 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………118 TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………..……………………………………..120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN…….……135 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Tên đầy đủ tiếng Việt AgNPs: Silver nanoparticles Hạt nano bạc Phân tích phương sai ANOVA ANOVA: Analysis of variance ATCC: American Type Culture Collection CĐ: Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ Chế độ COS: Chitooligosaccharide Các dẫn xuất của Chitosan CT: Công thức Độ deacetyl hóa DDA: Degree of DeAcetylation DM: Demineralization Khử khoáng DP: Deproteinization Khử protein ĐC: Đối chứng E: Enzyme Enzyme EVOH: Ethylene vinyl alcohol FIC: Fractional Inhibitory Concentration h: hour Nồng độ ức chế riêng phần Giờ HDPE: High Density Polyethylene PE tỷ trọng cao LB: Luria Broth LDPE: Low Density Polyethylene MIC: Minimum Inhibitory Concentration PE tỷ trọng thấp Nồng độ ức chế tối thiểu MP: Meat Pepton MRS: de Man, Rogosa and Sharpe Mật độ quang OD: Optical Density PDA: Potato Dextrose Agar PDB: Potato Dextrose Broth PE: Polyethylene PLT: Phế liệu tôm ppm part per million Phần triệu PO: Peroxydase Enzyme peroxidase PPO: Polyphenoloxydase Enzyme polyphenoloxydase viii PS: Polystyrene PVC Poly vinyl cloride Cơ chất S: Subtance SEM: Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét TEM: Transmission Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử truyền qua TD: Tinh dầu TSC: Trisodium citrate Na3C6H5O7 UV-vis: Ultraviolet-visible Khả biến và tử ngoại ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích [69] .................................... 13 Bảng 1.2: Số nguyên tử và năng lượng bề mặt của hạt nano bạc ............................ 14 Bảng 1.3: Màng bao nano composite dựa trên phức hợp nano bạc và polyme không phân hủy ................................................................................................................... 20 Bảng 1.4: Bao bì nano composite từ phức hợp nano bạc và polyme phân hủy sinh học ............................................................................................................................ 21 Bảng 1.5: Thành phần hoá học của một vài loại qủa [132] ..................................... 25 Bảng 2.1: Các thông số sử dụng trong quá trình sản xuất chitosan thô .................. 35 Bảng 2.2: Nồng độ phối hợp chitosan-nano bạc ..................................................... 40 Bảng 2.3: Nồng độ chế phẩm chitosan-nano bạc sử dụng trong bảo quản vải ....... 42 Bảng 2.4: Nồng độ chế phẩm chitosan-nano bạc sử dụng trong bảo quản cam...... 42 Bảng 2.5: Nồng độ chế phẩm chitosan-nano bạc sử dụng trong bảo quản bưởi ..... 42 Bảng 3.1: Tính chất của chitin thu nhận .................................................................. 49 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ deacetyl đến màu sắc chitosan ........................ 50 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của quy trình deaxetyl đến độ nhớt chitosan ....................... 51 Bảng 3.4: Tính chất của chitosan sau tinh sạch ....................................................... 53 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của pH đệm pha chitosan đến khả năng phát triển của vi sinh vật ............................................................................................................................. 55 Bảng 3.6: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, %) của chitosan đối với vi khuẩn ........ 57 Bảng 3.7: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, %) của chitosan đối với nấm men ....... 58 Bảng 3.8: Nồng độ diệt nấm tối thiểu (MFC, %) của chitosan đối với nấm mốc ... 59 Bảng 3.9: Mật độ nấm mốc theo thời gian khi xử lý với 2 chế phẩm CA1 và CA2 ở nồng độ MFC ............................................................................................................ 61 Bảng 3.10: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, ppm) của nano bạc đối với vi khuẩn . 67 Bảng 3.11: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, ppm) của nano bạc đối với nấm men 67 Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm mốc (MFC, ppm) của nano bạc ......................... 68 Bảng 3.13: Nồng độ cuối của chitosan và nano bạc trong phức hợp chitosan – nano bạc ............................................................................................................................. 70 Bảng 3.14: Đặc tính hoá lý của chế phẩm chitosan-nano bạc ................................. 70 Bảng 3.15: Tính ổn định của chế phẩm chitosan-nano bạc CT3 theo thời gian ..... 72 Bảng 3.16: Khả năng kháng vi khuẩn của chế phẩm chitosan-nano bạc ................ 73 Bảng 3.17: Khả năng kháng nấm men của phức hợp chitosan-nano bạc ................ 77 Bảng 3.18: Khả năng kháng nấm mốc (%) của phức hợp chitosan - nano bạc ....... 79 Bảng 3.19: Sự thay đổi chỉ số L*, a*, b* của vải ở các nồng độ chế phẩm chitosan nano bạc sau 7 ngày bảo quản .................................................................................. 88 Bảng 3.20: Diễn biến tổng số bào tử nấm men-nấm mốc trên quả vải khi sử dụng chế phẩm ở các nồng độ khác nhau theo thời gian ................................................... 89 x Bảng 3.21: Dư lượng bạc (mg/kg) trên quả vải sau thời gian bảo quản với phức chitosan-nano bạc ..................................................................................................... 94 Bảng 3.22: Diễn biến tổng số bào tử nấm men – nấm mốc trên bề mặt quả cam khi sử dụng chế phẩm chitosan-nano bạc ở các nồng độ khác nhau theo thời gian ..... 101 Bảng 3.23: Sự thay đổi chỉ số L* của bưởi trong quá trình bảo quản ở các nồng độ chế phẩm chitosan và nano bạc .............................................................................. 108 Bảng 3.24: Sự thay đổi chỉ số a* của bưởi trong quá trình bảo quản ở các nồng độ chế phẩm chitosan và nano bạc .............................................................................. 109 Bảng 3.25: Sự thay đổi chỉ số b* của bưởi trong quá trình bảo quản ở các nồng độ chế phẩm chitosan và nano bạc .............................................................................. 109 Bảng 3.26: Diễn biến tổng số bào tử nấm men – nấm mốc trên quả bưởi khi sử dụng chế phẩm chitosan-nano bạc ở các nồng độ khác nhau theo thời gian.......... 110 xi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Công thức cấu tạo của chitosan ................................................................. 4 Hình 1.2: Tác động của ion bạc lên tế bào [79] ...................................................... 17 Hình 1.3: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn ...................... 18 Hình 2.1: Quy trình thu chitin từ phế liệu tôm theo phương pháp ứng dụng chế phẩm enzym .............................................................................................................. 34 Hình 2.2: Sơ đồ tinh sạch chitosan bằng phương pháp sấy đối lưu và sấy đông khô .................................................................................................................................. 36 Hình 2.3: Quá trình tổng hợp dung dịch hạt nano bạc ............................................ 37 Hình 2.4: Sơ đồ phương pháp đối kháng trực tiếp trong dịch nuôi cấy lỏng .......... 39 Hình 3.1: Quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sinh học ... 48 Hình 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến độ deacetyl DDA .................. 50 Hình 3.3: Quy trình sản xuất chitosan hoàn chỉnh .................................................. 52 Hình 3.4: Chitosan sấy đông khô ............................................................................ 54 Hình 3.5: Chitosan sấy đối lưu ................................................................................ 54 Hình 3.6: Khả năng ức chế của chitosan CA2 lên khả năng sinh trưởng và phát triển của A. niger D15 sau 24h nuôi cấy .................................................................. 59 Hình 3.7: Khả năng kháng nấm mốc A. niger của chitosan theo thời gian ............. 60 Hình 3.8: Dung dịch keo nano bạc ở nhiệt độ khử 80oC ......................................... 62 Hình 3.9: Dung dịch keo nano bạc ở nhiệt độ khử 90oC ......................................... 62 Hình 3.10: Dung dịch keo nano bạc ở nhiệt độ khử 85oC ...................................... 63 Hình 3.11: Nano bạc nhỏ TSC 10 phút ................................................................... 64 Hình 3.12: Nano bạc nhỏ TSC 45 phút ................................................................... 64 Hình 3.13: Nồng độ khác nhau của dung dịch nano bạc ......................................... 64 Hình 3.14: Phổ UV-vis của dung dịch hạt nano bạc ............................................... 65 Hình 3.15: Ảnh chụp SEM của nano bạc ................................................................ 65 Hình 3.16: Ảnh chụp TEM của nano bạc ................................................................ 66 Hình 3.17: Khả năng kháng nấm mốc A. niger D15 của nano bạc ......................... 68 Hình 3.18: Dung dịch chế phẩm chitosan-nano bạc theo CT3 ................................ 71 Hình 3.19: Hình ảnh TEM của phức hợp chitosan – nano bạc ............................... 72 Hình 3.20: Khả năng kháng vi khuẩn E. coli của chế phẩm chitosan-nano bạc (Các ô khác nhau được cấy chủng vi khuẩn đã xử lý đối kháng trong dịch lỏng ở nồng độ khác nhau)................................................................................................................. 73 Hình 3.21: Hình ảnh TEM về ảnh hưởng của chế phẩm chitosan-nano bạc đến các chủng vi khuẩn kiểm định ........................................................................................ 76 Hình 3.22: Hình ảnh TEM về ảnh hưởng của phức hợp chitosan-nano bạc đến Saccharomyces sp. BM ............................................................................................ 78 Hình 3.23: Khả năng kháng nấm mốc A. niger D15 của phức hợp chitosan-nano bạc ở các tỉ lệ phối trộn khác nhau ........................................................................... 79 xii Hình 3.24: Ảnh hưởng của chế độ tiền xử lý tới quá trình bảo quản vải thiều ....... 82 Hình 3.25: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý đến hàm lượng chất khô hòa tan tổng số của vải trong quá trình bảo quản .................................................................. 83 Hình 3.26: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý đến hàm lượng axit hữu cơ tổng số của vải trong quá trình bảo quản .............................................................................. 84 Hình 3.27: Ảnh hưởng của chế độ tiền xử lý tới tỷ lệ hư hỏng của vải trong quá trình bảo quản ........................................................................................................... 85 Hình 3.28: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan – nano bạc đến thời gian bảo quản vải .............................................................................................................. 86 Hình 3.29: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan - nano bạc tới hàm lượng chất khô hòa tan tổng số của vải trong quá trình bảo quản ...................................... 86 Hình 3.30: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan - nano bạc tới hàm lượng axit hữu cơ tổng số của vải trong quá trình bảo quản .............................................. 87 Hình 3.31: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan-nano bạc đến tỷ lệ hư hỏng của quả vải theo thời gian ......................................................................................... 89 Hình 3.32: Ảnh hưởng của nhiệt độ (3-5oC) tới thời gian bảo quản quả vải .......... 90 Hình 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng chất khô hòa tan tổng số của vải trong quá trình bảo quản ........................................................................................... 91 Hình 3.34: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng axit hữu cơ tổng số của vải trong quá trình bảo quản .................................................................................................... 91 Hình 3.35: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng đường tổng số của vải trong quá trình bảo quản ........................................................................................................... 92 Hình 3.36: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tỷ lệ hư hỏng của vải trong quá trình bảo quản .......................................................................................................................... 93 Hình 3.37: Hình ảnh SEM mặt trong và mặt ngoài vỏ vải sau khi xử lý với phức hợp chitosan-nano bạc .............................................................................................. 94 Hình 3.38: Sơ đồ quy trình bảo quản quả vải thiều bằng chế phẩm chitosan-nano bạc ............................................................................................................................. 95 Hình 3.39: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý tới hàm lượng chất khô hòa tan tổng số của cam trong quá trình bảo quản ................................................................ 96 Hình 3.40: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý tới hàm lượng axit hữu cơ tổng số của cam trong quá trình bảo quản............................................................................. 96 Hình 3.41: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý tới lượng đường tổng số của cam trong quá trình bảo quản ........................................................................................... 97 Hình 3.42: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý tới tỷ lệ hư hỏng của cam trong quá trình bảo quản .................................................................................................... 97 Hình 3.43: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan - nano bạc tới hàm lượng chất khô hòa tan tổng số của cam trong quá trình bảo quản .................................... 99 Hình 3.44: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan - nano bạc tới hàm lượng đường tổng số của cam trong quá trình bảo quản..................................................... 99 Hình 3.45: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan - nano bạc tới hàm lượng axit hữu cơ tổng số của cam trong quá trình bảo quản ............................................. 99 xiii Hình 3.46: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan - nano bạc tới tỷ lệ hư hỏng của cam trong quá trình bảo quản........................................................................... 100 Hình 3.47: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng chất khô hòa tan tổng số của cam trong quá trình bảo quản ................................................................................. 101 Hình 3.48: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng axit hữa cơ tổng số của cam trong quá trình bảo quản ......................................................................................... 102 Hình 3.49: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng đường tổng số của cam trong quá trình bảo quản .......................................................................................................... 103 Hình 3.50: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tỷ lệ hao hụt trong của cam quá trình bảo quản ........................................................................................................................ 103 Hình 3.51: Cam Sành bảo quản bằng chế phẩm chitosan-nano bạc ..................... 103 Hình 3.52: Sơ đồ quy trình bảo quản quả cam sành bằng chế phẩm chitosan-nano bạc ........................................................................................................................... 104 Hình 3.53: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý đến hàm lượng chất khô hòa tan tổng số của bưởi trong quá trình bảo quản ............................................................. 105 Hình 3.54: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý đến hàm lượng axit hữu cơ tổng số của bưởi trong quá trình bảo quản .......................................................................... 105 Hình 3.55: Ảnh hưởng của các chế độ tiền xử lý đến tỷ lệ hư hỏng của bưởi trong quá trình bảo quản .................................................................................................. 106 Hình 3.56: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan - nano bạc tới hàm lượng chất khô hòa tan tổng số của bưởi trong quá trình bảo quản .................................. 107 Hình 3.57: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm chitosan - nano bạc đến hàm lượng axit hữu cơ tổng số của bưởi trong quá trình bảo quản .......................................... 108 Hình 3.58: Tỷ lệ hư hỏng của bưởi Diễn ở nhiệt độ thường ................................. 111 Hình 3.59: Bưởi Diễn bảo quản bằng chế phẩm chitosan – nano bạc................... 111 Hình 3.60: Sơ đồ quy trình bảo quản quả bưởi Diễn bằng chế phẩm chitosan-nano bạc ........................................................................................................................... 112 xiv MỞ ĐẦU Sản xuất trái cây đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam. Năm 2018, diện tích cây ăn quả của Việt Nam đạt 969,4 nghìn ha với năng suất ước tính hơn 9 triệu tấn quả, giá trị xuất khẩu đạt 3,8 tỷ USD, lần đầu tiên vượt qua giá trị xuất khẩu lúa gạo (đạt 3,03 tỷ USD trong năm 2018). Theo Cục trồng trọt, trong năm 2019, diện tích cây ăn quả sẽ phấn đấu đạt 1 triệu ha, giá trị xuất khẩu đạt 4,2 tỷ USD. Theo các số liệu thống kê cho thấy, cây ăn quả phát triển đều hàng năm về cả diện tích, sản lượng và giá trị xuất khẩu, năm sau cao hơn năm trước trung bình 10%. Các loại cây ăn quả chính ở Việt bao gồm chuối, cam, quýt, nhãn, vải, xoài, thanh long, bưởi, sầu riêng và chôm chôm. Tuy nhiên, ở Việt Nam, tổn thất sau thu hoạch rau quả tươi là cao, theo các báo cáo thống kê, tổn thất về giá trị sản lượng trung bình hàng năm từ 25 – 30%. Tổn thất như vậy là do các rau quả có hàm lượng nước lớn, là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, việc áp dụng kỹ thuật công nghệ trong bảo quản sau thu hoạch còn yếu kém. Chính vì vậy, cần ứng dụng công nghệ bảo quản duy trì về chất lượng và số lượng rau củ quả sau thu hoạch. Các phương pháp bảo quản rau quả hiện nay trên thế giới dựa vào hai nguyên lý chính: hạn chế biến đổi do vi sinh vật và hạn chế biến đổi sinh lý bất lợi. Đến nay, trên thế giới có nhiều phương pháp bảo quản rau quả tươi phổ biến gồm hạn chế các biến đổi sinh lý của rau củ quả gồm: khí quyển kiểm soát (CA), khí quyển điều chỉnh (MA), phủ màng; hạn chế hoạt động của vi sinh vật gồm: xử lý hóa chất, nhiệt độ. Nghiên cứu của nhóm tác giả là một biến thể của MA, lớp màng tạo ra trên bề mặt quả là một loại bao bì có tác dụng điều chỉnh sự trao đổi khí qua màng dẫn tới làm chậm quá trình hô hấp tạo ra những biến đổi sinh lý cho bảo quản rau quả. Trong các phương pháp hóa học, do yêu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng, xu hướng sử dụng hợp chất tự nhiên tăng lên do các yêu cầu về an toàn thực phẩm. Trong các hợp chất tự nhiên thì Chitosan đặc biệt được quan tâm do là polyme tự nhiên, có khả năng tạo màng, hạn chế trao đổi khí O2 tốt, có khả năng kháng khuẩn tự nhiên, đồng thời màng tạo ra bởi chitosan có đặc tính bền nước, dễ áp dụng trên đối tượng rau củ quả. Tại Việt Nam, chitin, chitosan (sản phẩm deacetyl hóa chitin) được tách từ phế liệu công nghiệp chế biến thủy sản. Vì vậy, nếu khai thác và sử dụng hiệu quả chitosan không những có lợi cho tận dụng tài nguyên mà còn xử lý ô nhiễm môi trường. Các nghiên cứu về sử dụng chitosan trên thế giới hiện nay có nhiều, kể cả sử dụng chitosan lẫn các dẫn xuất của chitosan và cả nano chitosan. Tuy nhiên, trên thực tế thì những ứng dụng chitosan và các sản phẩm còn chưa như mong đợi. Hiện nay, chitosan đang được sử dụng với tính chất tạo màng là chính. Mặc dù chitosan có khả năng kháng vi sinh vật nhưng hiệu ứng như vậy còn chưa đủ để ứng dụng trong thực tiễn. Các nghiên cứu trên thế giới có xu hướng ứng dụng là tạo ra các chế phẩm từ chitosan có bổ sung các chất hóa học diệt vi sinh vật để tăng hiệu quả ứng dụng. 1 Trong số các chất hóa học, chất diệt nấm tự nhiên, gần đây được sử dụng nhiều là các hợp chất nano như: nano Ag, TiO2,... Nano Bạc (Nano Ag) có đặc tính kháng vi sinh vật cao, sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, môi trường, y tế, thực phẩm. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh nano Ag tiêu diệt nhiều loại vi sinh vật gây thối hỏng rau củ quả. Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu riêng rẽ về tác dụng của chitosan và nano Ag, nhưng chưa có các công bố về tác dụng phối hợp của hai hoạt chất. Quả vải, cam, bưởi là những loại quả được ưa chuộng và có giá trị xuất khẩu cao hiện nay ở Việt Nam. Quả vải trồng chủ yếu ở một số tỉnh miền bắc, có thời gian thu hoạch ngắn, khó bảo quản nên tổn thất cao. Quả cam sành Hà Giang và bưởi Diễn có nhu cầu về bảo quản lớn là do thu hoạch chính vào tháng 10 và tháng 11 âm hàng năm, tuy nhiên để bán được số lượng lớn và giá thành cao thì cần tiêu thụ vào dịp tết Nguyên đán và rằm tháng riêng. Vì vậy, hai loại quả này cần bảo quản và giữ được về hình thái và chất lượng trong thời gian dài khoảng hai tháng. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm chitosan – Nano Bạc ứng dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch”. Trong luận án này, chúng tôi đặt ra mục tiêu tạo ra một chế phẩm bảo quản rau quả tươi gồm hai thành phần Chitosan và Nano Ag, chế phẩm bảo quả có tính đa dụng, để sử dụng được trên nhiều đối tượng khác nhau. Đánh giá được hiệu lực của chế phẩm đối với một số vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm điển hình và thử nghiệm hiệu quả trong bảo quản đối với quả vải, quả cam và quả bưởi. Mục tiêu nghiên cứu: - - Nghiên cứu tạo ra chế phẩm chitosan – nano bạc, có khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, đồng thời đánh giá được khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh, gây hư hỏng điển hình. Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm chitosan – nano bạc trong bảo quản quả sau thu hoạch, hướng tới sử dụng rộng rãi chế phẩm trong các lĩnh vực thực phẩm, đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, nâng cao sức khỏe cộng đồng. Nội dung nghiên cứu: - - - Nội dung 1: Nghiên cứu chế tạo và tinh sạch chế phẩm chitosan, chế tạo chế phẩm nano bạc và đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của từng chế phẩm thu được. Nội dung 2: Nghiên cứu phương pháp phối hợp chitosan – nano bạc nhằm nâng cao hiệu quả kháng vi sinh vật và xác định khả năng kháng vi sinh vật của chế phẩm. Nội dung 3: Ứng dụng chế phẩm chitosan – nano bạc trong bảo quản thực phẩm (Vải thiều Lục Ngạn, cam sành Hà Giang và bưởi Diễn). Ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn của luận án: Ý nghĩa khoa học: - Tạo ra chế phẩm chitosan – nano bạc có khả năng kháng vi sinh vật và tạo màng bảo quản - Chế phẩm chitosan - nano bạc có hiệu quả kéo dài thời gian bảo quản quả vải, cam, bưởi Diễn 2 Giá trị thực tiễn của luận án: - Tạo ra chế phẩm màng chitosan – nano bạc hiệu quả kéo dài thời gian bảo quản một số loại quả như quả vải, cam, bưởi Diễn, có tiềm năng ứng dụng đối với các nông sản, thực phẩm khác. Điểm mới của luận án: - Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam tạo ra chế phẩm chitosan– nano bạc có khả năng kháng vi sinh vật và ứng dụng trong bảo quản quả sau thu hoạch. - Đây là công trình đầu tiên tại Việt Nam ứng dụng chế phẩm chitosan-nano bạc trong bảo quản quả vải thiều, cam sành Hà Giang, bưởi Diễn đạt được thời gian bảo quản từ 25 – 90 ngày, bảo đảm an toàn cho sức khỏe người sử dụng. Cấu trúc luận án: Luận án được trình bày trong 118 trang với 26 bảng và 60 hình. Mở đầu (3 tr.); Chương 1. Tổng quan (27 tr.); Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (15 tr.); Chương 3. Kết quả và thảo luận (69 tr.); Kết luận và kiến nghị (2 tr.); 183 tài liệu tham khảo và phần phụ lục. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm của chitosan 1.1.1 Chitosan Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (- COCH3) ở vị trí C(2). Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DDA > 50% thì gọi là chitosan [1]. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-β-Dglucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4)-glucoside (Hình 1.1) [1]. Hình 1.1: Công thức cấu tạo của chitosan Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chitosan chiếm khá cao dao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan [1]. Chitosan được xem là polyme tự nhiên quan trọng nhất, không độc, có khả năng phân huỷ sinh học, có khả năng tạo màng và có tính tương thích về mặt sinh học. Chitosan có khả năng tích điện dương do đó nó có khả năng kết hợp với những chất tích điện âm như chất béo, lipid và axit mật. Với đặc tính có thể hoà tan tốt trong môi trường axit, chitosan được chú ý đặc biệt như là một loại vật liệu mới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như dược phẩm, mỹ phẩm, xử lý nước thải và trong thực phẩm như là tác nhân kết hợp, gel hóa, hay tác nhân ổn định...[2]. 1.1.2 Sản xuất chitosan Chitosan thường được sản xuất từ chất thải giáp xác vỏ như tôm, cua, ghẹ [3]. Chitosan phân tách từ vỏ tôm được thực hiện qua 4 bước cơ bản: khử khoáng (DM), khử protein (DP), khử màu (DC), và deacetyl hóa (DDA). 1.1.2.1 Các phương pháp sản xuất chitosan Hiện nay, chitosan được thu từ chitin theo hai phương pháp chính là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. + Phương pháp hóa học: được chia làm 3 giai đoạn chính: loại bỏ khoáng bằng axit, loại bỏ protein bằng kiềm và tẩy màu loại sắc tố và chất béo [1]. Ưu điểm: Thời gian xử lý vỏ tôm thu được chitin nhanh. 4 Nhược điểm: Chitin thu được phụ thuộc nhiều vào qui trình xử lý với axit và kiềm. Quá trình này tiêu tốn năng lượng, đưa ra môi trường một lượng lớn nước thải chứa kiềm và axit gây ăn mòn và ô nhiễm mạnh, đồng thời rất khó tách các sản phẩm còn giá trị như: chất màu, protein… Chitin thu được có tính ổn định thấp. Giá thành của sản phẩm chitin và chitosan sản xuất theo phương pháp này cao, nên bất lợi trong vấn đề thương mại. + Phương pháp sinh học: sử dụng vi khuẩn sinh protease hay chế phẩm protease để loại protein, vi khuẩn lactic hay Bacillus để loại khoáng. Phương pháp dùng chế phẩm protease, các chế phẩm enzyme sử dụng như: trypsin, papain, pepsin [4], chymotrysin, pancreatin, alcalase [5]. Phương pháp enzyme có ưu điểm là thời gian ngắn (vài giờ) tuy nhiên có giá thành cao hơn so với phương pháp vi sinh, lượng protein còn lại trong chitin cao (4,4-7,9%) [6]. Phương pháp loại khoáng ra khỏi phế liệu tôm sử dụng vi khuẩn lactic là hướng nghiên cứu hiện nay [7]. So với loại protein, phương pháp sinh học loại khoáng dùng vi khuẩn lactic đạt hiệu quả khá cao, thường loại >90% khoáng thậm chí có thể loại được đến 99,7% khoáng chỉ trong thời gian 2-3 ngày [7]. Rao và Stevens (2006) cho thấy dùng Lactobacillus có thể khử 81,6% protein và 59,8% khoáng [8]. Phương pháp sinh học ngoài việc cho chitin có chất lượng cao, thân thiện môi trường còn cho phép tận thu dịch lên men dùng làm thức ăn cho gia súc có giá trị. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là thời gian lên men kéo dài. 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu quy trình sản xuất tại Việt Nam Tại Việt Nam đã có một vài nghiên cứu về tách chiết chitin, chitosan. Năm 1978, trường Đại học Thủy sản Nha Trang bắt đầu nghiên cứu vấn đề này. Sau đó, Nguyễn Văn Ngoạn và cs. thuộc viện nghiên cứu Hải sản (1993 - 1995) đã nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan. Vật liệu chitosan của Viện Hóa học được Bộ Y tế công nhận là nguyên liệu dược dụng, đạt tiêu chuẩn dùng trong y tế. Chitosan đã được thành công ứng dụng trong chế biến thực phẩm hoặc làm chế phẩm công nghiệp vải, màng chitosan và glucosamin [9]. Trần Thị Luyến và cs. nghiên cứu thu hồi chitin bằng phương pháp lên men lactic dùng vi khuẩn L. plantarum. Tuy nhiên, hàm lượng protein và khoáng bị khử chưa cao chỉ tương ứng 61% và 43% [10]. Hạn chế của các nghiên cứu trên là chưa đưa ra được qui trình hoàn thiện để thu hồi được chitin đạt tiêu chuẩn. Gần đây nhất, việc nghiên cứu thu nhận chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sinh học đã được nghiên cứu bởi Lê Thanh Hà và cs. thuộc Trường Đại học Bách Khoa Hà nội và đã thu được kết quả khả quan [11]. Gần đây nhất, tác giả Nguyễn Thị Minh Nguyệt và cs. (2015) đã hoàn thiện được quy trình tổng hợp nano chitosan bằng sử dụng axit methacrylic và đánh giá được hoạt tính kháng nấm của chế phẩm, đây là hướng mới trong việc sản xuất chitosan và các chế phẩm [12]. 1.1.3 Các tính chất của chitosan 1.1.3.1 Tính chất vật lý của chitosan Chitosan là chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, có độ nhớt tương đối cao phụ thuộc vào quá trình chế tạo [9, 13]. Chitosan 5 tan tốt trong axit có pH <6,0; tuy nhiên tại pH>7,0 chitosan khó hoà tan hơn do khuynh hướng xảy ra kết lắng hoặc tạo gel [14]. Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau ứng với các nguồn chitin khác nhau. Sản phẩm chitosan có khối lượng phân tử từ 100,000 - 1,200,000 Daltons phụ thuộc vào quá trình xử lý. Người ta thường phân loại chitosan dựa vào trọng lượng phân tử [15, 16]. Bản chất của chitosan là polyme sinh học có phân tử lượng lớn nên khi hòa tan vào dung môi, chitosan tạo dung dịch có độ nhớt lớn, dung dịch dạng gel, tạo thành màng mỏng khi được phun hay phủ một lớp mỏng lên bề mặt vật liệu và để khô tự nhiên. Màng chitosan dai, khó xé rách, có khả năng tự phân hủy sinh học [14]. Ứng dụng tính chất này nên chitosan được dùng để tạo màng không thấm bảo quản trứng, trái cây, hay dùng hỗ trợ trong điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng (trong môi trường axit của dạ dày, chitosan tạo gel che phủ, bảo vệ niêm mạc) [9]. Quá trình deacetyl hóa (DDA) bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao. Mức độ DDA của chitosan khoảng 56%-99% (nhìn chung là 80%) phụ thuộc vào loài giáp xác và phương pháp sử dụng [17]. Phương pháp để xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan bao gồm thử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ bằng HI. 1.1.3.2 Tính chất hóa học của chitosan Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 và nhóm – OH, nhóm -NH2, phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N- [15]. Mặt khác chitosan là những polyme mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết α-(1-4)-glicoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: axit, bazơ, tác nhân oxy-hóa và các enzyme thuỷ phân. Trong phân tử chitosan và một số dẫn xuất của chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử Oxi và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+..., tùy nhóm chức trên mạch polyme mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau. Hơn nữa chitosan và các kim loại như Ag+, Cu2+, Ni2+, …có tính chất khử trùng và diệt khuẩn, sau khi chitosan liên kết với các ion kim loại nhờ oxi hay nito, các liên kết ràng buộc làm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn [18]. 1.1.3.3 Tính chất sinh học của chitosan Chitosan được chứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học. Chitosan có khả năng kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, hạn chế sự phát triển của các tế bào u bướu, ung thư, HIV/AIDS, chống tia tử ngoại, chống ngứa,… [19, 20]. Ngoài ra, chitosan có thể hấp thụ chất bẩn trong đường ruột, phòng chống bệnh tiểu đường, hạ huyết áp, phòng bệnh xơ cứng động mạch, đào thải độc tố và hấp thụ kim loại nặng, cải thiện cơ năng tiêu hóa [20-22]. Chitosan có khả năng thúc đẩy làm lành da, phục hồi vết thương, cầm máu, thấm máu ở vị trí bị xuất huyết [23]. 6 Chitosan hầu như không độc, LD50 = 16 g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn (LD50 lượng chất độc gây chế 50% số cá thể thí nghiệm) [24]. 1.1.4 Đặc tính kháng vi sinh vật của chitosan 1.1.4.1 Khả năng kháng vi sinh vật của chitosan Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc các yếu tố: loại chitosan, pH, nhiệt độ, thành phần thực phẩm [38]. Chitosan có khả năng kháng virus [25] và nhiều loài vi sinh vật như vi khuẩn Gram (-), vi khuẩn Gram (+), nấm mốc và nấm men. a. Khả năng kháng vi khuẩn Chitosan ức chế sự phát triển của rất nhiều vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,…Nồng độ ức chế sự phát triển của vi khuẩn thay đổi trong khoảng 10 – 16000 ppm [26]. Ngoài ra, các thí nghiệm cũng cho thấy có rất nhiều ion kim loại có thể ảnh hưởng đến đặc tính kháng khuẩn của chitosan như K+, Na+, Mg2+,… Các nghiên cứu cho thấy chitosan có thể làm yếu đi chức năng bảo vệ của thành tế bào nhiều vi khuẩn [26-28]. b. Khả năng kháng nấm men và nấm mốc Hoạt tính kháng nấm của chitosan được chứng minh qua các nghiên cứu với nhiều loại nấm khác nhau như Saccharomyces ludwigii, Pichia, Pseudomonas fragi, Candida, Zygosaccharomyces bailii, Pyricularia grisea, …. Nồng độ nhỏ nhất ức chế sự phát triển thay đổi từ 10 – 5000 ppm. Nhìn chung, chitosan ở nồng độ 1000 ppm làm giảm sự phát triển của các loại nấm trừ Zygomycetes vì chitosan là một thành phần cấu tạo trong thành tế bào của chúng [2, 29]. Nghiên cứu hiệu quả kháng nấm mốc gây hư hỏng quả của chitosan nồng độ 0,5; 1; 1,5 và 2% cho thấy chitosan có tác dụng kháng nấm ở các giai đoạn phát triển khác nhau (sự tăng trưởng của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử) của cả Colettochitrum musae phân lập từ chuối, Colettochitrum gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh long [30]. Kết quả này cũng tương tự như kết quả của BautistaBaños và cs. (2004) [31] cho rằng sự tăng trưởng của sợi nấm và sự này mầm của bảo tử nấm Fusarium, Penicillium, và Rhizopus bị ức chế bởi chitosan, tuy nhiên so với Penicillium và Rhizopus thì Fusarium là nấm nhạy cảm nhất. Việc giảm tối đa trọng lượng khô của sợi nấm và ức chế hình thành bào tử được quan sát thấy ở chitosan nồng độ 2% đối với Colettochitrum musae phân lập từ chuối, Colettochitrum gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh long [30]. Hiệu ứng tương tự cũng được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây về F. oxysporum phân lập từ đu đủ [31]. Các nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng chitosan kích thích hình thành bào tử của Penicillium digitatum và C. gloeosporioides [31]. 1.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng vi sinh vật của 7 chitosan Tính kháng vi sinh vật của chitosan không chỉ phụ thuộc vào các điều kiện bên ngoài (vi sinh vật đích, tính chất của môi trường, pH, nhiệt độ, độ hòa tan,…), mà còn phụ thuộc vào các yếu tố bên trong (như trọng lượng phân tử, và mức độ polyme hóa và mức độ diacetyl hóa) [28, 32, 33]. a. Trọng lượng phân tử Nhiều nhà nghiên cứu khác cho rằng hoạt tính kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử. Chitosan có khối lượng phân tử thấp có khả năng kháng khuẩn cao hơn so với chitosan có khối lượng phân tử cao [34] vì chitosan có khối lượng phân tử thấp có khả năng tan trong nước cao hơn dẫn đến phản ứng tốt hơn với các vị trí hoạt động của vi sinh vật. Hwang và cs. kết luận rằng với chitosan trọng lượng phân tử lớn hơn 30 000 Dalton cho hiệu quả cao nhất kháng E. coli, với phạm vi khảo sát trọng lượng phân tử chitosan từ 10 000 – 170 000 Dalton [35]. Tuy nhiên, rất khó để tìm được mối tương quan rõ ràng giữa khả năng kháng khuẩn và trọng lượng phân tử của chitosan. Các nghiên cứu về hoạt động diệt khuẩn của chitosan có thể so sánh được tùy thuộc vào vi sinh vật thử nghiệm, điều kiện thử nghiệm và trọng lượng phân tử của chitosan, độ DDA của chitosan, nhưng các kết quả thu được không hoàn toàn tương thích, có sự khác biệt. Tăng trọng lượng phân tử dẫn đến giảm hoạt tính kháng E. coli của chitosan trong một số nghiên cứu [28, 36, 37]. Ngược lại với kết quả đề cập ở trên không có sự khác biệt trong hoạt động kháng khuẩn của chitosan có trọng lượng phân tử khác nhau đối với E. coli và B. subtilis [36, 38]. Thêm vào đó, do chitosan là một polyme tự nhiên, phạm vi trọng lượng phân tử chitosan rộng với độ deacetyl hóa là khác nhau phụ thuộc từng nghiên cứu. Chính vì vậy, khó có thể xác định trọng lượng phân tử tối ưu nhất của chitosan để cho hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất. b. Mức độ deacetyl hóa Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan tỷ lệ thuận với DDA của chitosan [39, 40]. Sự gia tăng DDA có nghĩa là số lượng các nhóm amin trên chitosan tăng lên, kết quả là trong môi trường có tính axit gia tăng sự tương tác giữa chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật [41]. Simpson và cs. báo cáo rằng chitosan với DDA là 92,5% có hiệu quả cao hơn so với chitosan có DDA 85% [42]. Mức độ diacetyl hóa cao làm tăng khả năng hòa tan chitosan và tăng mật độ điện tích do đó cải thiện độ bám dính của chitosan lên các tế bào vi sinh vật [43]. c. Độ pH Hoạt động kháng khuẩn của chitosan bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi pH [44-47]. pH thấp hơn làm tăng hoạt tính kháng khuẩn được giải thích bởi nhiều lí do, ngoài hiệu ứng ức chế vi sinh vật mục tiêu của các axit. Ở môi trường có giá trị pH thấp, khả năng hòa tan của chitosan cao và proton trong dung dịch chitosan cao làm tăng hiệu quả kháng khuẩn [43]. Nghiên cứu của Tsai & Su (1999) [47] kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chitosan (DDA 98%) đối với E. coli ở các giá trị pH khác nhau là 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 cho rằng chitosan có khả năng kháng khuẩn tốt nhất ở pH 5,0 và chitosan có hoạt tính kháng khuẩn kém ở pH 9,0. Các nhà nghiên cứu khác cũng kết luận rằng chitosan không có hoạt tính kháng khuẩn ở pH 7,0 do nhóm amin và độ hòa tan của chitosan ở pH này rất kém [28, 44]. 8