VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
******************
ĐÀO MINH ĐỨC
NGHIÊN CỨU TẠO BIOSENSOR XÁC ĐỊNH KHÁNG
NGUYÊN HER2
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
Hà Nội - 2014
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê
Quang Huấn đã tạo điều kiện cũng như tận tình chỉ bảo và động viên trong suốt thời
gian thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ hết sức quý báu cả về kiến thức lẫn tinh
thần từ tập thể phòng Công nghệ tế bào động vật, Trung tâm giám định ADN, Viện
Công nghệ sinh học.
Nhân dịp này em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô, bạn bè và gia đình
đã chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Học viên
Đào Minh Đức
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................. i
MỤC LỤC ................................................................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................ - 1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... - 3 1. 1. UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN HER2 ............................................................................. - 3 1.1.1. Ung thư vú ................................................................................................................... - 3 1.1.2. HER2 ............................................................................................................................ - 3 1.1.2.1. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ADN ............................................................... - 5 1.1.2.2. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ARN ............................................................... - 7 1.1.2.3. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức protein ........................................................... - 7 1.2. BIOSENSOR .................................................................................................................. - 9 1.2.1. Giới thiệu chung về Biosensor ................................................................................... - 9 1.2.2. Lịch sử phát triển của Biosensor ............................................................................. - 10 1.2.3. Đặc điểm – Yêu cầu của Biosensor .......................................................................... - 11 1.2.4. Nguyên lý hoạt động chung của Biosensor ............................................................. - 12 1.2.5. Ứng dụng của Biosensor ........................................................................................... - 13 1.3. TỔNG QUAN VỀ APTAMER ................................................................................... - 15 1.3.1. Khái niệm................................................................................................................... - 15 1.3.2. Lịch sử ........................................................................................................................ - 15 1.3.3. Đặc trưng của Aptamer ............................................................................................ - 16 1.3.4. Ưu điểm của Aptamer so với kháng thể. ................................................................ - 17 -
ii
1.3.5. Phương pháp thu nhận Aptamer – Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of
Ligands by EXponential enrichment) ................................................................................. - 18 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... - 23 2. 1. VẬT LIỆU ................................................................................................................... - 23 2.1.1. Sinh phẩm .................................................................................................................. - 23 2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................................... - 23 2.1.3. Trang thiết bị ............................................................................................................. - 25 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................... - 25 2.2.1. Sàng lọc Aptamer đặc hiệu HER2 (Phương pháp SELEX) .................................. - 25 2.2.1.1. Chuẩn bị thư viện ................................................................................................... - 25 2.2.1.2. Sàng lọc ................................................................................................................... - 27 2.2.1.3. Phương pháp tách dòng và giải trình tự. ............................................................... - 29 2.2.1.3.1. Nhân bản Aptamer đặc hiệu với HER2 bằng phương pháp PCR ......................... - 29 2.2.1.3.2. Phân tích điện di trên gel agarose ........................................................................ - 31 2.2.1.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR ................................................ - 32 2.2.1.3.4. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng .............................................................. - 33 2.2.1.3.5. Biến nạp plasmid vào E.coli chủng DH5α............................................................ - 34 2.2.1.3.6. Phương pháp tách ADN plasmid từ vi khuẩn E. coli ............................................ - 35 2.2.1.3.7. Phương pháp xác định trình tự nucleotide ........................................................... - 36 2.2.1.4. Phương pháp gắn Aptamer lên hạt nano vàng. .................................................... - 37 2.2.2. Phương pháp gắn Aptamer lên bề mặt điện cực .................................................... - 37 2.2.2.1. Xử lý và làm sạch điện cực Au ............................................................................... - 38 2.2.2.2. Tạo lớp MPA trên bề mặt điện cực vàng ............................................................... - 38 2.2.2.3. Gắn NHS lên bề mặt điện cực đã xử lý với MPA .................................................. - 39 2.2.2.4. Gắn NH2-Aptamer lên điện cực Au/MPA-NHS ................................................... - 39 2.2.2.5. Định lượng HER2 trong mẫu bằng điện cực Au/MPA-NHS ............................... - 39 2.2.2.6. Tái sử dụng điện cực Au/MPA-NHS ..................................................................... - 39 2.2.2.7. Đánh giá hoạt động của Aptasensor ...................................................................... - 40 2.2.3. Phương pháp lai Dot blot ......................................................................................... - 40 -
iii
CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... - 41 3.1. SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU HER2 ............................................................. - 41 3.1.1. Kết quả thu nhận và xác định trình tự Aptamer ................................................... - 41 3.1.2. Kết quả xác định cấu trúc không gian của Aptamer ............................................. - 43 3.1.3. Xác định kết quả tạo phức hệ Aptamer-hạt nano vàng ........................................ - 46 3.1.4. Xác định gắn kết của Aptamer trên tế bào BT474 và tế bào MCF7 .................... - 48 3.1.5. Xác định sự gắn kết của Aptamer với HER2 bằng kỹ thuật Dot blot ................. - 50 3.2. CHẾ TẠO BIOSENSOR ĐIỆN HÓA ........................................................................ - 52 3.2.1. Làm sạch và hoạt hóa điện cực ................................................................................ - 52 3.2.2. Tạo đơn lớp mỏng trên bề mặt điện cực vàng ........................................................ - 52 3.2.3. Gắn Aptamer lên điện cực đã tạo lớp màng mỏng trên bề mặt ........................... - 54 3.2.4. Phong tỏa các vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt điện cực ....................... - 55 3.2.5. Định lượng kháng nguyên HER2 trong các mẫu phân tích .................................. - 59 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................... - 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. - 64 -
iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Apt
Aptamer
Bp
Cặp base
BSA
Bovine Serum Albumin
ADN
Axit deoxyribonucleic
EDTA
Axit ethyenediaminetetraacetic
E.coli
Vi khuẩn Escherichia coli
SELEX
Systematic Evolution of LigADNs by EXponential enrichment
NST
Nhiễm sắc thể
dUTP
2´-Deoxyuridine, 5´-Triphosphate
Kb
Kilo base
LB
Môi trường LB
PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp
RT – PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực
ARN
Axit Ribonucleic
mARN
ARN thông tin
PBS
Phosphate Buffered Saline
PVDF
Polyvilidene Fluoride
ssADN
Sợi đơn ADN
SDS
Natri dodexyl sulphat
TAE
Tris – acetate – EDTA
Taq polymerase
Enzyme polymerase chịu nhiệt
ddNTP
dideoxynucleotide triphosphat
HER
Human epidermal growth factor receptor
WHO
Tổ chức y tế thế giới
v
MAPK
Mitogen-activated protein kinase
PI3K
Phosphatidylinositol 3-kinase
FISH
Fluorescence in situ hybridization
CISH
Chromogenic In Situ Hybridization
SISH
Silver In Situ Hybridization
DAPI
4,6-diamidino-2-phenylindol.2 HCl l
IHC
Immunohistochemocal technique
DAB
3,3’-diaminobenzidine chromogen
TE
Tris – EDTA
MPA
3-Mercaptopropionic acid
MES
2-(N-morpholino) ethane-sulfonic acid
NHS
N-hydroxy-succinimide
EDC
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
KOH
potassium hydroxide
H2O2
hydrogen peroxide
NaBH4
sodium borohydride
Au
Vàng
CV
Cyclic voltammetry
SWV
Square wave voltammetry
DMSO
Dimethyl sulfoxide
DTT
Dithiothreitol
SB
Selex Buffer
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Khảo sát mức độ khuyếch đại của gen HER2 trên NST 17 của tế bào
mô vú bằng phương pháp FISH
Hình 1.2. Khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 bằng phương pháp IHC.
Mức độ biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo phương pháp DAKO
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của Biosensor
Hình 1.4. Các thành phần của yếu tố nhận biết sinh học và các dạng Biosensor
Hình 1.5. Nguyên lý hoạt động chung của một Biosensor
Hình 1.6: Quy trình Phương pháp Systematic Evolution of Ligands by
Exponential Enrichment (SELEX).
Hình 1.7. Sơ đồ Aptamer ssADN
Hình 2.1. Quy trình tách dòng và giải trình tự của những oligonucleotide gắn
đặc hiệu HER2
Hình 2.2. Sơ đồ cấu tạo vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
Hình 2.3. Sơ đồ tạo lớp mỏng trên điện cực để gắn Aptamer
Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR tạo thư viện thứ cấp
Hình 3.2. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR sau khi khuếch đại ở vòng sàng lọc
thứ 12 và sau vòng sàng lọc loại trừ
Hình 3.3. Cấu hình không gian của Aptamer-1 đặc hiệu HER2
Hình 3.4. Cấu hình không gian của Aptamer-2 đặc hiệu HER2
Hình 3.5. Phổ hấp thụ của Aptamer và phức hệ Aptamer hạt nano vàng
Hình 3.6. Phổ hấp thụ UV-Vis của phức hệ Aptamer-hạt nano vàng
Hình 3.7. Kết quả xác định ái lực của phức hệ Apt-Au đối với tế bào BT474 và
tế bào MCF7
Hình 3.8. Kết quả Dot Blot giữa mẫu hạt vàng có gắn Aptamer và hạt vàng
không gắn Aptamer.
Hình 3.9. Kết quả Dot Blot tính đặc hiệu của Aptamer với HER2
Hình 3.10. Thế vòng (CV-cyclic voltammetry) của điện cực Au trong dung dịch
H2SO4, nồng độ 0,5M
Hình 3.11. Thế vòng (CV) và sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au và Au-MPA
ở các thời gian ủ khác nhau
Hình 3.12. Thế vòng (CV) và sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au và AuMPA-Apt ở các nồng độ khác nhau
Hình 3.13. Thế vòng (CV- cyclic voltammetry) và sóng vuông (square wave
voltammetry - SWV) của điện cực Au và Au-MPA-Apt-BSA
Hình 3.14. Thế vòng (CV) của điện cực Au tại các bước sửa đổi
Hình 3.15. Đồ thị liên quan giữa thế và dòng đôi với các điện cực có bề mặt
biến đổi khác nhau khi xác định theo kỹ thuật quét sóng vuông (SWV) của điện
cực vàng tại các bước biến đổi
Hình 3.16. Thế vòng (CV) và sóng vuông (SWV) cuả điện cực Au và AuMPA-Apt-BSA ủ với các nồng độ kháng nguyên HER2 khác nhau
vii
13
16
18
20
21
27
28
37
41
46
50
52
53
54
55
56
58
60
60
61
62
63
65
66
67
69
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh ưu điểm của Aptamer và kháng thể
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR làm giàu thư viện
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR làm giàu thư viện
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng tạo sợi đơn ADN
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại các trình tự gắn
Bảng 2.6. Nồng độ gel sử dụng với kích thước ADN tương ứng
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng gắn đoạn gen vào vector PCR2.1
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ ADN sau sàng lọc ở bước 1
Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ (ng/µL) ADN sau các vòng sàng lọc
Bảng 3.3. Kết quả xác định phổ UV-Vis của phức hệ Aptamer-hạt nano
vàng
Bảng 3.4. Phổ hấp thụ của hạt nano vàng và phức hệ hạt nano vàngAptamer
Bảng 3.5. Kết quả đo dòng (µA) của điện cực sau khi xử lý MPA
Bảng 3.6. Kết quả xác định dòng đối điện cực vàng sau các bước xử lý
26
34
34
35
38
39
41
42
50
51
Bảng 3.7. Kết quả xác định dòng đối với điện cực vàng bước xử lý BSA
Bảng 3.8. Kết quả xác định thế và dòng của điện cực sau các bước biến
đổi
Bảng 3.9. Kết quả xác định thế và dòng của điện cực ủ với dung dịch
HER2
64
viii
55
56
62
63
66
68
MỞ ĐẦU
Ung thư vú là bệnh hiểm nghèo thường gặp ở phụ nữ, chiếm gần 30% số trường
hợp mắc bệnh ung thư mới mỗi năm, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng năm xấp xỉ 1.1
triệu ca và 410,000 trường hợp tử vong vì bệnh ung thư này. Theo thống kê của tổ chức
y tế thế giới (WHO), hiện nay Mỹ là nước có tỷ lệ mắc ung thư vú cao nhất thế giới,
trung bình cứ 8 phụ nữ thì có 1 người mắc bệnh ung thư vú. Các nước châu Âu có tỷ lệ
mắc ung thư vú thấp hơn Mỹ, trung bình khoảng 67,48/100.000 mỗi năm. Ở châu Á và
một số nước đang phát triển, tỷ lệ mắc ung thư vú thấp hơn tại Mỹ và châu Âu nhưng
đang có xu hướng tăng nhanh, trung bình khoảng 40,5/100.000 dân mỗi năm (Farooq,
2005).
Trong 15 năm qua tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú đã vượt qua ung thư
cổ tử cung và sẽ tiếp tục tăng cao trong những năm tới. Hiện nay, Hà Nội và TP Hồ
Chí Minh là hai nơi có tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao nhất. Trong 100.000 phụ nữ ở
Hà Nội thì có 30 phụ nữ mắc ung thư vú mỗi năm, ở TP Hồ Chí Minh thì tỷ lệ này là
20/100.000 (Nguyễn Chấn Hùng, 2010).
Một trong những chỉ thị ung thư vú được quan tâm là thụ thể yếu tố tăng trưởng
biểu mô 2 (Human epithelial growth factor receptor 2 hay HER2). Tế bào vú bình
thường chỉ có 2 bản sao gen HER2 nhưng ở tế bào ung thư vú dương tính HER2, gen
HER2 được khuếch đại thành nhiều bản sao dẫn đến hiện tượng HER2 biểu hiện trên
bề mặt tế bào vú gấp 50-100 lần so với bình thường (siêu biểu hiện) (Venter, 1987).
Bệnh nhân ung thư vú dương tính HER2 thường có tiên lượng xấu và chỉ sống sót được
vài năm sau khi mắc bệnh.
Như vậy, việc xác định sớm hàm lượng HER2 trong cơ thể có vai trò quan trọng
trong chẩn đoán và điều trị ung thư vú. Hiện có nhiều phương pháp xác định mức độ
biểu hiện quá mức của HER2. Tuy nhiên, mỗi phương pháp đã nêu đều có những ưu
điểm và hạn chế nhất định. Do vậy, việc tìm kiếm phương pháp mới để có thể xác định
-1-
chính xác hàm lượng HER2 trong máu cũng như trong các dịch sinh học giúp cho việc
chẩn đoán và theo dõi điều trị là rất cần thiết. Trong số các phương pháp mới thì
phương pháp điện hóa (Biosensor điện hóa) cho phép xác định nhanh, chính xác hàm
lượng HER2 trong máu hoặc trong dịch cơ thể. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài luận
văn “Nghiên cứu tạo Biosensor xác định kháng nguyên HER2”.
.Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu chế tạo Biosensor xác định kháng nguyên
HER2 trong mẫu phân tích theo nguyên lý điện hóa.
Các nội dung nghiên cứu chính của luận văn:
1. Nghiên cứu sàng lọc Aptamer đặc hiệu kháng nguyên HER2.
2. Ứng dụng Aptamer đã sàng lọc để chế tạo Biosensor xác định kháng nguyên
HER2 hoạt động theo nguyên lý điện hóa.
-2-
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. 1. UNG THƯ VÚ BIỂU HIỆN HER2
1.1.1. Ung thư vú
Ung thư vú là bệnh hiểm nghèo thường gặp ở phụ nữ, chiếm gần 30% số trường
hợp mắc bệnh ung thư mới mỗi năm, tỷ lệ mắc bệnh trung bình hàng năm xấp xỉ 1,1
triệu ca và 410.000 trường hợp tử vong vì bệnh ung thư này. Theo thống kê của tổ chức
y tế thế giới (WHO), hiện nay Mỹ là nước có tỷ lệ mắc ung thư vú cao nhất thế giới,
trung bình cứ 8 phụ nữ thì có 1 người mắc bệnh ung thư vú. Ở Mỹ, trong những năm
gần đây, ước tính có khoảng 230.480 trường hợp mắc ung thư vú xâm lấn và 57.650
trường hợp mắc ung thư vú tại chỗ. Các nước châu Âu có tỷ lệ mắc ung thư vú thấp
hơn Mỹ, trung bình khoảng 67,48/100.000 mỗi năm, đứng đầu là Anh. Năm 2009, ở
Anh mỗi ngày có 125 ca ung thư vú mới, 35 người tử vong do ung thư vú và 12 bệnh
nhân được cứu sống do phát hiện sớm. Ở châu Á và một số nước đang phát triển, tỷ lệ
mắc ung thư vú thấp hơn tại Mỹ và châu Âu nhưng đang có xu hướng tăng nhanh,
trung bình khoảng 40,5/100.000 dân mỗi năm (Farooq, 2005).
Trong 15 năm qua tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú đã vượt qua ung thư
cổ tử cung và sẽ tiếp tục tăng cao trong những năm tới. Hiện nay, Hà Nội và TP Hồ
Chí Minh là hai nơi có tỷ lệ phụ nữ mắc ung thư vú cao nhất. Trong 100,000 phụ nữ ở
Hà Nội thì có 30 phụ nữ mắc ung thư vú mỗi năm, ở TP Hồ Chí Minh thì tỷ lệ này là
20/100,000 (Nguyễn Chấn Hùng, 2010).
1.1.2. Thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì (Human
epithelial growth factor
receptor - HER2).
HER2 được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1984 bởi Schechter AL và các cộng
sự. HER2 là protein xuyên màng thuộc họ thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu bì gồm
-3-
HER1, HER2, HER3 và HER4. Các thụ thể này đều có cấu trúc gồm ba vùng: vùng
ngoại bào là vị trí gắn với phối tử, vùng xuyên màng và vùng nội bào có hoạt tính
enzyme tyrosine kinase tham gia tương tác với các protein truyền tín hiệu nội bào.
Trong đó, thụ thể HER2 không có vị trí gắn với phối tử, vùng nội bào của HER3 không
có hoạt tính tyrosine kinase. Các thụ thể HER chỉ có hoạt tính khi gắn với phối tử,
chúng giữ vai trò quan trọng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào và điều hòa sự phát
triển, biệt hóa và tăng sinh của tế bào.
HER2 luôn tồn tại ở dạng cấu hình mở nên nó có khả năng tạo dimer với các thụ
thể HER khác hoặc với chính nó để tạo phân tử dị dimer hoặc đồng dimer. Khi đó các
phân tử dimer liên kết được với phối tử nên thụ thể HER2 có hoạt tính.
Tế bào vú bình thường chỉ có 2 bản sao gen HER2 nhưng ở tế bào ung thư vú
dương tính HER2, gen HER2 được khuếch đại thành nhiều bản sao dẫn đến HER2 biểu
hiện trên bề mặt tế bào vú gấp 50-100 lần so với bình thường (siêu biểu hiện) (Venter,
1987). Siêu biểu hiện HER2 làm tăng số lượng phức hợp thụ thể đồng dimer hoặc dị
dimer chứa HER2. Những phức hợp thụ thể này phosphoryl hóa protein nội bào gắn
với nó làm hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu nội bào như MAPK (mitogenactivated protein kinase) và PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) dẫn tới kích thích sự
tăng sinh và phân chia của tế bào. Điều này khiến tế bào phát triển và phân chia mất
kiểm soát dẫn đến hình thành các khối u. Ngoài ra, các con đường truyền tín hiệu này
còn ức chế quá trình apoptosis đồng thời hình thành mạch máu mang chất dinh dưỡng
tới nuôi khối u, duy trì sự sống sót của các khối u giúp chúng phát triển và xâm lấn các
tế bào xung quanh, di căn đến những vị trí khác (Witton, 2003). Bệnh nhân ung thư vú
dương tính HER2 thường có tiên lượng xấu và chỉ sống sót được vài năm sau khi mắc
bệnh.
Các kỹ thuật sinh học phân tử giữ vai trò quan trọng trong việc phát hiện, dự đoán
và tiên lượng ung thư vú để tìm ra liệu pháp điều trị phù hợp. Hiện nay có một số
-4-
phương pháp được áp dụng phổ biến để khảo sát sự biểu hiện thụ thể HER2 ở bệnh
nhân ung thư vú ở mức độ protein (IHC), mức độ ARN (q-RT-PCR), mức độ ADN
(FISH) (Moelans, 2011).
1.1.2.1. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ADN
Phương pháp sử dụng để khảo sát sự biểu hiện thụ thể HER2 ở mức ADN thường
là kỹ thuật lai tại chỗ nhiễm sắc thể như FISH, CISH, SISH. Trong đó, FISH là phương
pháp thường quy đánh giá mức độ khuếch đại của gen HER2/neu trên NST 17 của tế
bào mô vú. Mảnh mô vú của bệnh nhân ung thư vú chứa ADN mã hóa thụ thể HER2
(ADN đích) được cố định trên bề mặt tiêu bản và làm biến tính. Mẫu dò ADN được
đánh dấu bằng chất nhuộm huỳnh quang (fluorochrome) và/hoặc một hapten không
nhuộm huỳnh quang (nonfluorescent hapten), biến tính và lai trước với ADN lặp lại
không đánh dấu. Sau đó, mẫu dò ADN được lai với ADN đích. Sau khi rửa để loại bỏ
chuỗi đơn ADN không gắn và những đoạn ADN gắn không đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ
hapten không gắn huỳnh quang và bổ sung dung dịch chống phai màu DAPI (4,6diamidino-2-phenylindol.2 HCl l), quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang
(Hình 1.1).
-5-
Hình 1.1. Khảo sát mức độ khuyếch đại của gen HER2 trên NST 17 của tế bào mô vú
bằng phương pháp FISH. Tín hiệu màu xanh là tín hiệu của HER2/neu, tín hiệu màu
xanh lục là tín hiệu của tâm động của nhiễm sắc thể số 17. Nhiều tín hiệu màu đỏ: ung
thư vú, hai tín hiệu màu đỏ: bình thường. Các mẫu A là mô vú bình thường, mẫu B là
mô vú của bệnh nhân ung thư vú nhưng gen HER2 không được khuếch đại, mẫu C là
mô vú của bệnh nhân ung thư vú có gen HER2 được khuếch đại ở mức thấp, mẫu D là
mô vú của bệnh nhân ung thư vú có gen HER2 được khuếch đại ở mức cao.
Ngoài các phương pháp đã mô tả ở trên, phương pháp sử dụng kháng thể đơn
dòng đặc hiệu thụ thể HER2 khảo sát sự biểu hiện HER2 ở tế bào ung thư vú dương
tính đang được phát triển. Phương pháp này được coi là phương pháp hiện đại, có
nhiều triển vọng cho kết quả nhạy, chính xác và được ứng dụng kết hợp với điều trị
ung thư vú để kiểm tra đáp ứng của thuốc (Moelans, 2011).
Cách đọc kết quả: Tìm và đếm trên 20 tế bào u các tín hiệu màu đỏ (tín hiệu của
HER2) và các tín hiệu màu xanh lục (tín hiệu tâm động của nhiễm sắc thể số 17). Lấy
trung bình cộng của các tín hiệu màu đỏ chia cho trung bình cộng của các tín hiệu màu
xanh. Nếu kết quả > 2.2 là dương tính HER2, kết quả < 1.8 là âm tính HER2, kết quả
nằm trong khoảng 1.8-2.2 thì phải đếm lại trên 60 tế bào và tính toán tương tự như trên.
-6-
FISH là một phương pháp xét nghiệm cho kết quả khách quan hơn và được coi là
một xét nghiệm tiêu chuẩn phát hiện sự khuếch đại của gen HER với độ nhạy và độ đặc
hiệu cao. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là giá thành khá cao, mất nhiều
thời gian, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và việc đọc kết quả khó khăn
hơn do khó ghi nhận được những dấu hiệu hình thái học kèm theo, đôi khi rất khó xác
định vùng ung thư xâm lấn trên tiêu bản FISH. Tiêu bản không thể quan sát lại nếu thời
gian lưu giữ lâu vì tín hiệu huỳnh quang bị nhạt màu dần theo thời gian (Dhillon,
2007).
1.1.2.2. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức ARN
Phương pháp định lượng real-time PCR (qRT-PCR) được sử dụng để đánh giá
mức độ biểu hiện của HER2 bằng cách định lượng hàm lượng ARN trong khối u. Để
tăng độ nhạy của phương pháp, các nhà khoa học thường sử dụng PCR lồng. Phương
pháp qRT-PCR hiếm khi được sử dụng để đánh giá trạng thái biểu hiện HER2 do việc
phân lập mARN từ tế bào khối u vú tương đối khó và phân tử ARN không bền như
ADN (Moelans, 2011).
1.1.2.3. Xác định sự biểu hiện HER2 ở mức protein
Phương pháp hóa mô miễn dịch IHC (Immunohistochemistry) thường được sử
dụng để khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 ở mức độ protein từ sinh thiết của
bệnh nhân ung thư vú. Phương pháp IHC bao gồm các bước theo thứ tự: cắt mẫu được
cố định trên paraffin, chuyển mẫu lên lam kính, xử lý mẫu khử paraffin, nhuộm lam
kính (để bộc lộ kháng nguyên HER2), đọc kết quả. Kháng thể thứ nhất là c-erB-2,
kháng thể thứ hai có gắn Biotin, Streptavidin, chất hiện màu 3,3’-diaminobenzidine
chromogen (DAB). Kết quả được đọc bằng kính hiển vi quang học. Sự biểu hiện của
thụ thể HER2 được đánh giá theo bảng điểm của DAKO (Moelans, 2011; Dhillon,
2007). Điểm 0: Màng tế bào không bắt màu, điểm 1+: bắt màu yếu, rải rác trên màng tế
-7-
bào, điểm 2+: bắt màu vừa trên màng tế bào > 10% tế bào, điểm 3+: bắt màu mạnh trên
màng tế bào > 10% tế bào (Hình 1.2).
Hình 1.2. Khảo sát sự biểu hiện của thụ thể HER2 bằng phương pháp IHC. Mức độ
biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá theo phương pháp DAKO. Điểm 0: mẫu âm
tính; điểm 1+: mẫu âm tính, điểm 2+: HER2 biểu hiện yếu, là mẫu nghi ngờ; điểm 3+:
mẫu dương tính, HER2 biểu hiện mạnh.
Ưu điểm của phương pháp IHC là tiện lợi, rẻ tiền, tiêu bản xét nghiệm dễ bảo
quản sau khi đã phân tích, và chỉ cần sử dụng kính hiển vi quang học thông thường để
quan sát. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là kết quả không khách quan
do ảnh hưởng của điều kiện bảo quản mẫu trước đó, thời gian và kỹ thuật cố định bệnh
phẩm, loại kháng thể sử dụng (đơn dòng hay đa dòng), và điều quan trọng là khó khăn
khi áp dụng bảng tính điểm để đưa ra kết luận chính xác. Có một tỉ lệ khá lớn trường
hợp kết quả biểu hiện là 2+ khi dùng phương pháp IHC nhưng không thấy có sự
khuyếch đại gen tương ứng khi dùng phương pháp FISH (lai huỳnh quang tại chỗ).
-8-
Theo nghiên cứu của Tan và cộng sự (2011), trong số 126 trường hợp ung thư vú
nguyên phát có 81/126 trường hợp (64,3%) là âm tính với HER2 (mức độ 0); 17/126
trường hợp (chiếm 13,6%) dương tính yếu (mức độ 1+); 19/126 trường hợp dương tính
ở mức trung bình (mức độ 2+); và 9/126 trường hợp (chiếm 7,1%) dương tính mạnh
với HER2 (mức độ 3+). Hàm lượng HER2 trong huyết thanh của các bệnh nhân ung
thư vú được xác định từ 0,7 ng/ml đến 133,1 ng/ml, giá trị trung bình là 20,5 ng/ml.
Nếu xét theo mức độ biểu hiện: Âm tính (0), thì nồng độ HER2 < 19 ng/ml; Dương
tính yếu (1+) thì hàm lượng HER2 từ 19 đến 32 ng/ml; Dương tính mức độ trung bình
(2+) thì hàm lượng HER2 từ 32 đến 66 ng/ml; Dương tính mạnh (3+) thì hàm lượng
HER2 trong huyết thanh là >66 ng/ml. Các kết quả xác định hàm lượng HER2 trong
huyết thanh bằng kỹ thuật Dot blot và hóa mô miễn dịch (immunohistochemical, IHC)
trên mô ung thư có sự tương quan chặt chẽ với P=0,001, (Tan et al., 2011).
1.2. BIOSENSOR
1.2.1. Giới thiệu chung về Biosensor
Biosensor thực chất là một thiết bị phân tích định tính hoặc định lượng một chất
dựa trên sự chuyển đổi một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu mầu, quang hoặc tín
hiệu điện. Đối với Biosensor điện hóa thì đầu tiên, Biosensor sẽ nhận dạng hiện tượng
và biên dịch thành một đặc tính có thể định lượng được, sau đó đặc tính định lượng này
được chuyển đổi thành một tín hiệu điện bởi một bộ biến năng. Trong Biosensor, hiện
tượng được nhận dạng bởi một hệ thống sinh học gọi là bioreceptor. Hệ thống này sẽ
tiếp xúc trực tiếp với mẫu phân tích gây ra phản ứng và tạo thành hợp chất nhạy cảm
cho Biosensor. Cơ quan thụ cảm sinh học có đặc tính chọn lọc đặc biệt đối với chất
phân tích. Sơ đồ cấu tạo chung của một Biosensor được trình bày tại hình 1,3, và một
số dạng Biosensor cũng như các yếu tố nhận biết sinh học, các bộ chuyển đổi được
trình bày tại Hình 1.4.
-9-
1.2.2. Lịch sử phát triển của Biosensor
Năm 1956, giáo sư Leland Clark Jnr – người khai sinh về khái niệm điện cực sinh
học (Biosensor) đã có công bố về điện cực Oxy. Dựa trên kinh nghiệm và tâm huyết
của mình, ông đã phát triển lĩnh vực phân tích giúp có thể đo lường được trong cơ thể.
Năm 1962, tại Hội nghị Khoa học ở Viện hàn lâm New York, ông đã có bài diễn
thuyết: “Làm thế nào để các điện cực điện hóa (phương pháp pH, cực phổ, phép đo
điện thế, phép đo độ dẫn điện) thông minh hơn”. Trong đó, ông trình bày cách làm điện
cực điện hóa thông minh hơn bằng cách thêm enzyme vào máy chuyển đổi như những
chiếc bánh sandwich được bao bọc bởi một lớp màng.
Năm 1975, ý tưởng của Clark trở thành hiện thực với sự công bố của công ty
Yellow Springs Instrument (Ohio) về máy phân tích glucose dựa trên việc đo dòng
điện của hydro peroxide. Đây là lần đầu tiên các phòng thí nghiệm trên thế giới phân
tích dựa trên một Biosensor. Cũng vào năm này, Biosensor tiến thêm một bước mới là
khi Divis đề xuất rằng vi khuẩn có thể được dùng như một yếu tố sinh học trong điện
cực vi khuẩn để đo hàm lượng rượu.
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo của Biosensor. Các bước hoạt động chính của Biosensor: Chất
xúc tác sinh học (a) chuyển cơ chất (S) thành sản phẩm (P). Bộ biến năng (b) chuyển
sản phẩm phản ứng thành tín hiệu điện. Bộ khuếch đại (c) nhằm khuếch đại tín hiệu
điện của bộ biến năng. Bộ vi xử lý tín hiệu (d). Màn hình hiển thị (e).
- 10 -
Hình 1.4. Các thành phần của yếu tố nhận biết sinh học và các dạng Biosensor.
1.2.3. Đặc điểm – Yêu cầu của Biosensor
Để định lượng, Biosensor phải đáp ứng yêu cầu liên quan đến đo lường: khả năng
lặp lại, khả năng tái sử dụng cao, tính chọn lọc, tính nhạy cảm, vùng trả lời tuyến tính
và thời gian đáp ứng tín hiệu tốt.
Các phép đo có độ lặp lại tốt nếu như hai loạt kết quả thu được tương tự nhau
được thực hiện bởi cùng người phân tích, sử dụng cùng Biosensor trong cùng một mẫu
phân tích. Phương pháp đo có khả năng tái sử dụng cao nếu các kết quả trước có thể
đạt được khi tiến hành phân tích lặp lại lần hai.
Tính chọn lọc của Biosensor thể hiện ở khả năng nhận ra một hợp chất đơn trong
hỗn hợp các cấu tử của mẫu, khả năng này phụ thuộc vào cơ quan thụ cảm sinh học và
- 11 -
- Xem thêm -