Tài liệu Nghiên cứu tăng cường khả năng chịu mặn bằng chuyển ghen coda trên mô hình cây xoan ta melia azedarach l

i .. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CƢ́U TĂNG CƢỜNG KHẢ NĂNG CHỊ U MẶN BẰNG CHUYỂN GEN CODA TRÊN MÔ HÌ NH CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cƣ́u trong luận văn là trung thƣ̣c và chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS . TS. Chu Hoàng Hà– Phó Viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Trƣởng phòng Công nghệ tế bào thƣ̣c vật– Viện Công nghệ Sinh học– Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôirong t suốt quá trì nh thực hiện và hoàn chỉnh luận văn. Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào thƣ̣c vật – Viện công nghệ sinh học , đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và động viên tôi trong thời gian thực tập tại phòng. Tôi cũng xin đƣợc trân trọng cảm ơn Ths Bùi Văn Thắng -Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã có nhiều đóng góp giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn sƣ̣ giúp đỡ và tạo điều kiện vô cùng quý báu của Ban Giám hiệu, các thầy các cô trong khoa Khoa học Sự sống , phòng Sau đại học Trƣờng Đại học khoa học – Đại học Thái Nguyên để tôi có thể hoàn thành tốt khóa học . Cuối cùng tôi xin bày t ỏ lòng biết ơn đến nhƣ̃ng ngƣời thân trong gia đì nh và bạn bè , đồng nghiệp đã tạo điều kiện , quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập , thƣ̣c hiện nghiên cƣ́u đề tài và thƣ̣c hiện thành công luận văn này. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cƣ́u.................................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cƣ́u................................................................................................... 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................................. 4 1.1. Giới thiệu về cây Xoan ta (Melia azedarach L.) ................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của cây Xoan ta.............................................................. 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................................ 4 1.1.3. Giá trị sử dụng ....................................................................................................... 5 1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống Xoan ta .. 6 1.2. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng ở thực vật ..................... 6 1.2.1. Cơ chế chịu mặn của thực vật............................................................................... 8 1.2.2. Vai trò của glycine betain đối với tính chống chịu ở thực vật ..........................12 1.2.3. Cơ chế sinh tổng hợp glycine betaine ................................................................13 1.2.4. Nguồn gốc và đặc điểm của gen codA ...............................................................15 1.3. Sử dụng gen codA trong cải tạo giống cây trồng ..................................................15 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................19 2.1. Vật liệu nghiên cƣ́u................................................................................................19 2.1.1. Vật liệu .................................................................................................................19 2.1.2. Hóa chất ...............................................................................................................20 2.1.3. Môi trƣờng nuôi câý ............................................................................................21 2.1.4. Thiết bị - Máy móc ..............................................................................................22 2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u.......................................................................................22 2.2.1. Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen codA .........................22 2.2.2. Tạo chủng vi khuẩnAgrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen....29 2.2.3. Tạo cây Xoan ta chuyển gen mang gencodA ...................................................30 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................................34 3.1. Kết quả nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK - codA .......34 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v 3.2. Kết quả thiết kế cấu trúc vector và tạo chủng vi khuẩn mang vector chuyển gen 35 3.2.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121- codA .............................35 3.2.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp (pBI121-codA) vào E. coli DH5α .............36 3.2.3. Kết quả sàng lọc dòng vi khuẩn E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp ...........37 3.2.4. Kết quả biến nạp vector chuyển gen (pBI121-codA) vào A. tumefaciens .......39 3.2.5. Kết quả sàng lọc dòng A. tumefaciens mang vector chuyển gen ...................40 3.3. Kết quả tạo dòng Xoan ta mang cấu trúc gen codA .............................................42 3.3.1. Kết quả chuyển gen và tái sinh chồi Xoan ta chuyển gen ................................42 3.3.2. Kết quả tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh (ra rễ) .................................................45 3.3.3. Kết quả ra cây và kiểm tra cây chuyển gen ngoài nhà lƣới..............................46 3.3.4. Kết quả đánh giá sơ bộ cácdòng Xoan ta chuyển gen trên môi trƣờng muối.47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................52 PHỤ LỤC ...........................................................................................................................57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT AS Acetosyrigone bp Cặp base (base pair) BAP 6-benzyl adenin purine C:I Chloroform : Isoamyl alcolhol CodA Gen mã hóa Choline oxydase DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxynucleotide triphosphate Gus β-Glucuronidase gene = Gen mã hoá β- Glucuronidase E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate IBA Indole 3 - butyric acid kb kilo base (1 kb = 1000 base) LB Luria – Bertani MS Murashige and Skoog OD Mật độ quang học (Optical density) PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase SDS Sodium doecyl sulphate T-DNA Transfer – DNA = DNA chuyển TAE Tris base – Acetic acid – EDTA Ti-Plasmid Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khối u thực vật TE Tris-EDTA WT Cây không chuyển gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự các mồi nhân gen codA.......................................................................20 Bảng 2.2. Thành phần dung dịch tách plasmid.................................................................20 Bảng 2.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ..........................................................................21 Bảng 2.4. Môi trƣờng nuôi vàchọn lọc cây Xoan ta chuyển gen...................................21 Bảng 2.5. Thành phần các loại môi trƣờng gây nhiễm mặn nhân tạo .............................22 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA .....................................................23 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng xƣ̉ lý enzyme giới hạn.................................................24 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen codA với vector pBI121 ........................26 ..................................................28 Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra plasmid Bảng 2.10.Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn............29 Bảng 2.11. Thành phần dung dị ch tách chiết DNA.........................................................32 Bảng 2.12. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra DNA tổng số. ....................................33 Bảng 3.1. Kết quả tái sinh chồi Xoan ta chuyển gen sau hai lần chọn lọc .....................42 Bảng 3.3. Khả năng chị u mặn của các dòng Xoan ta chuyển gencodA. ........................48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn viii DANH MỤC CÁC HÌ NH Hình 1.1. Rừng, cây Xoan ta trƣởng thành ......................................................................... 4 Hình 1.2. Dạng hoa và quả xoan ........................................................................................ 5 Hình 1.3. Chu trình sinh tổng hợp GB ở thực vật ............................................................ 14 Hình 1.4. Chu trình sinh tổng hợp GB ở vi khuẩn E.coli ............................................... 14 Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ vector tách dòng .......... 35 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm tinh sạch gen codA từ sản phẩm PCR ................. 35 Hình 3.3. Hình ảnh điện di gen codA và vector pBI121-gus cắt bằng cặp enzyme giới hạn XbaI và SacI ................................................................................................................. 36 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm thôi gel gen codA và vector pBI12 mở vòng ..... 36 Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc biến nạp plasmid tái tổ hợp mọc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanamycin ..................................................... 37 Hình 3.6. Hình ảnh plasmid tái tổ hợp tách từ vi khuẩn E. coli ..................................... 38 Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ plasmid tái tổ hợp. ........ 39 Hình 3.8. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp pBI121-codA cắt bằng XbaI và I. ......... 39 Hình 3.9. Khuẩn lạc Agrobacterium tumefacies EHA101 biến nạp vector pBI121-codA mọc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanaSacmycin, 50 mg/l rifamycin ............... 40 Hình 3.10. Hình ảnh điện di plasmid tái tổ hợp (pBI121- codA) tách chiết từ A. tumefaciens. 41 Hình 3.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân codA từ plasmid tái tổ hợp tách từ A. tumefaciens. ........................................................................................................................ 41 Hình 3.12. Mẫu Xoan ta lây nhiễm trong dị ch huyền phuA. ̀ tumefacien...................... 43 Hình 3.13. Mẫu Xoan ta trên môi trƣờng đồngnuôi cấy CCM ...................................... 43 Hình 3.14. Mảnh lá chuyển gen trên môi trƣờng SM sau1 tuần nuôi cấy ..................... 43 Hình 3.15. Đoạn thân chuyển gen trên môi trƣờng SM sau 1 tuần nuôi ........................ 43 Hình 3.16. Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen trên môi trƣờng SM lần 1 sau 2 tuần nuôi cấy ............................................................................................................................... 43 Hình 3.17. Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen trên môi trƣờng SM lần 1 sau 3 tuần nuôi cấy ............................................................................................................................... 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ix Hình 3.18. Chồi tái sinh từ mảnh lá chuyển gen trên môi trƣờng SM lần 1 sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................................................................... 44 Hình 3.19. Chồi tái sinh từ đoạn thân chuyển gen trên môi trƣờng SM lần 1 sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................................................................... 44 Hình 3.20. Chồi Xoan ta chuyển gen tái sinh trên môi trƣờng SM lần 2 sau 4 tuần nuôi cấy........................................................................................................................................ 44 Hình 3.21 Mảnh lá không chuyển gen(ĐC) trên môi trƣờng SM sau 4 tuần nuôi cấy . 44 Hình 3.22. Đoạn thân không chuyển gen (ĐC) trên môi trƣờng SM sau 4 tuần nuôi cấy44 Hình 3.23. Hình ảnh chồi Xoan ta chuyển gen ra rễ trên môi trƣờng PSM ................... 45 Hình 3.24. Hình ảnh chồi Xoan ta không chuyển gen (ĐC) trên môi trƣờng PSM ....... 46 Hình 3.25. Hình ảnh cây xoan ta chuyển gen trồng trong nhà lƣới. ............................... 46 Hình 3.26. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen codA từ DNA genome tách chiết từ cây Xoan ta chuyển gen và cây không chuyển gen ..................................................... 47 Hình 3.27. Đồ thị sinh trƣởng của các 3 dòng Xoan ta chuyển gen và đối chứng trên môi trƣờng tái sinh có các nồng độ NaCl khác nhau......................................... 49 Hình 3.28. Sinh trƣởng của dòng Xoan ta XT20 chuyển gen codA và dòng WT không chuyển gen trên môi trƣờng tái sinh có nồng độ NaCl khác nhau .................................. 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trên thế giới, các nghiên cứu nâng cao tính chống chịu đối với các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng (hạn hán, nhiễm mặn, nhiệt độ cao, nhiệt độ thấp…) đã và đang đƣợc tiến hành trên nhiều đối tƣợng cây trồng khác nhau. Trong lâm nghiệp, loài cây đƣợc sử dụng nhƣ là một loại cây mô hình cho các nghiên cứu trên thế giới là cây dƣơng (Populus sp.). Tuy nhiên, hạn chế duy nhất của loài cây này đó là khó sinh trƣởng trong điều kiện khí hậu của Việt Nam. Vì vậy, việc tìm kiếm một loài cây dễ thích ứng và phổ biến để làm cây mô hình cho các nghiên cứu theo hƣớng quan tâm trên đối tƣợng cây lâm nghiệp trở nên cần thiết. Cây Xoan ta đƣợc đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lƣợc phát triển lâm nghiệp ở nƣớc ta. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bƣớc đầu trong việc xây dựng phƣơng pháp chuyển gen ở đối tƣợng cây xoan ta là rất có triển vọng [3], [4], [8], [9], [23], [36], [37], cho phép các nhà khoa học có thể tiến hành các nghiên cứu cải thiện giống, đặc biệt là nâng cao tính chống chịu của loài cây này và có thể sử dụng nhƣ một mô hình cho các loài cây lâm nghiệp đặc hữu của Việt Nam. Những tác động bất lợi từ môi trƣờng nhƣ: hạn hán, ngập mặn, ngập úng, nhiệt độ cực đoan đã tác động mạnh mẽ đến sự sinh trƣởng và phát triển của các loài cây trồng. Cũng nhƣ các loài sinh vật khác, khi gặp các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng, thực vật có khả năng sinh ra các cơ chế thích nghi khác nhau để có thể tồn tại, sinh trƣởng và phát triển bình thƣờng. Cơ chế thƣờng gặp nhất khi cây gặp các điều kiện bất lợi về nƣớc đó là tăng cƣờng khả năng duy trì sức căng của các mô, tế bào thông qua việc tăng cƣờng tổng hợp các chất nhƣ các loại đƣờng tan, các loại acid amin,… để tăng áp suất thẩm thấu. Glycine betaine và proline là hai trong số những chất trao đổi đƣợc quan tâm do sự tích lũy hàm lƣợng cao các hợp chất này khi cây gặp các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng, đặc biệt là những yếu tố liên quan đến áp suất thẩm thấu nội bào. Ở một số loài thực vật bậc cao, glycine betaine đƣợc tổng hợp thông qua một chuỗi gồm hai phản ứng từ choline đƣợc chuyển hóa thành betaine aldehyde nhờ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 xúc tác bởi choline monooxygenase và từ betain aldehyde đƣợc chuyển hóa thành glycine betaine nhờ xúc tác bởi betaine aldehyde dehydrogenase. Tuy nhiên, để chủ động tăng cƣờng tổng hợp glycine betain trong cây, các nhà khoa học đã sử dụng gen codA mã hóa cho choline oxidase phân lập từ vi khuẩn Arthrobacter globiformis có khả năng chuyển hóa trực tiếp choline thành glycine betain. Các công trình công bố cho thấy: cây Arabidopsis thaliana chuyển gen codA tăng cƣờng khả năng chịu lạnh , nhiệt độ cao và mặn [15], [28], cây cải bẹ (Brassica juncea) chuyển gen codA có khả năng chị u mặn , hạn tốt hơn cây đối chứng không chuyển gen [24], cây lúa chuyển gen codA tăng cƣờng kh ả năng chị u lạnh , mặn [28], cây Salanum lycopersium chuyển gen codA cũng tăng cƣờng kh ả năng chị u lạ nh và mặn và cây B ạch đàn (Eucalyptus globules) chuyển gen codA có kh ả năng chị u mặn cao hơn hẳn so với cây đối chƣ́ng không chuyển gen [15], [24], [28], [29], [41]. Những bằng chứng khoa học trên đây cho thấy tính khả thi của việc sử dụng phƣơng pháp này đối với nghiên cứu nâng cao tính chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng cho các loài cây trồng. Việt Nam là một trong các quốc gia đang chị u ảnh hƣởng mạnh mẽ của việc biến đổi khí hậu , đặc biệt là vấn đề nƣớc biển dâng , dẫn đến nhiều vùng bị xâm nhập mặn gây ảnh hƣởng đến năng s uất và chất lƣợng cây trồng . Vì vậy, việc triển khai các nghiên cƣ́u nhằm tạ o ra đƣợc các giống cây trồng có khả năng chống chị u đƣợc các điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc năng s uất và chất lƣợng tốt đang là vấn đề cấp bách và cần thiết nhất hiện nay . Xuất phát tƣ̀ nhƣ̃ng lý do trên , tôi tiến hành thƣ̣c hiện đề tài “Nghiên cứu tăng cường khả năng chị u mặn bằng chuyển gen codA trên mô hì nh cây xoan ta (Melia azedarach L.)”. 2. Mục tiêu nghiên cƣ́u - Thiết kế đƣợc vector mang gen codA, nhằm mục đích tạo giống cây trồng có khả năng chống chịu tốt các điều kiện bất lợi của môi trƣờng; - Tạo đƣợc một số dòng cây Xoan ta chuyển gen mang gen codA có khả năng chịu mặn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 3. Nội dung nghiên cƣ́u - Nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK và thiết kế cấu trúc mang gen codA đƣợc điều khiển bởi promoter 35S. - Nghiên cứu tạo cây Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen codA; - Trồng, chăm sóc câ y chuyển gen ngoài nhà lƣới và k iểm tra sự có mặt của gen codA ở các dòng cây Xoan ta chuyển gen; - Đánh giá khả năng chịu mặn, sinh trƣởng và phát triển của các dòng cây Xoan ta chuyển gen bằng phƣơng pháp nhiễm mặn nhân tạo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Xoan ta (Melia azedarach L.) 1.1.1. Nguồn gốc và phân bố của cây Xoan ta Cây Xoan ta có tên khoa học (Melia azedarach L.) thuộc họ Xoan (Meliaceae) hay còn gọi là họ Dái ngựa, bộ Bồ hòn (Sapindales), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta). Họ Xoan có khoảng 50 chi và 550 loài, phân bố khắp miền nhiệt đới; một chi (Toona) phát triển tới tận vùng ôn đới phía Bắc của Trung Quốc và về phía Nam tới Đông nam Australia, một chi khác gần nhƣ phân bố hầu hết ở các vùng phía Bắc [1]. Ở Việt Nam, cây Xoan ta đƣợc gây trồng thành rừng hoặc phân bố ở hầu hết các tỉnh từ Bắc đến Nam, trên nƣơng rẫy cũ hoặc ven sông một số tỉnh vùng Tây Bắc có thể gặp các đám cây Xoan ta thuần loài do nhân dân trồng. Hình 1.1. Rừng, cây Xoan ta trƣởng thành 1.1.2. Đặc điểm sinh học Xoan ta là cây gỗ lớn, chiều cao có thể đạt tới 30m và đƣờng kính gần 100cm. Thân cây khá thẳng, tán lá thƣa, vỏ màu xám nâu, nứt hoặc rạn dọc, lúc non thƣờng có đốm xếp vòng quanh thân. Lá kép lông chim 2-3 lần, mọc cách. Lá chét mép có răng cƣa. Hoa đều, lƣỡng tính, màu tím nhạt, hợp thành cụm hình chùy ở nách lá phía đầu cành, có mùi thơm hắc, bầu nhụy có 5-6 ô. Quả hạch dài 1-2cm khi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 chín màu vàng, qua đông trên cành sang mùa xuân mới rụng, vỏ trong hóa gỗ cứng có 5-6 ô, mỗi ô chứa một hạt [1]. Hình 1.2. Dạng hoa và quả xoan Xoan ta là cây nguyên sản ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á. Cây ƣa sáng, sinh trƣởng nhanh, sau khi trồng 6-8 năm có thể sử dụng đƣợc. Xoan ta không chịu bóng, ƣa khí hậu nóng ẩm, sinh trƣởng đƣợc trên nhiều loại đất khác nhau, nhƣng thích hợp nhất là đất cát pha, đất phù sa ven sông có độ phì cao và sâu ẩm. Xoan có thể chịu đƣợc muối, lƣợng muối trong đất từ 0,4-0,5%. Những nơi đất bạc màu, khô hạn hoặc úng nƣớc đều không thích hợp với cây Xoan ta. Cây Xoan ta có hệ rễ ngang khá phát triển, thƣờng ăn nông và lan rộng, rễ cọc ăn sâu. Xoan ta thƣờng phân cành sớm, khả năng đâm chồi mạnh nên có thể lợi dụng tái sinh chồi đƣợc [1]. 1.1.3. Giá trị sử dụng Xoan ta là loài cây thân gỗ lớn, đa tác dụng, cây Xoan ta có thể đƣợc trồng rừng để lấy gỗ lớn hay trồng để che bóng và phòng hộ. Gỗ xoan ta thuộc nhóm V, có lõi màu hồng hay nâu nhạt, giác xám trắng, gỗ nhẹ mềm. Gỗ Xoan sau khi ngâm khá bền, khó bị mối mọt, cho nên thƣờng đƣợc dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng, trang trí nội thất và điêu khắc,… Ngoài ra, lá và rễ còn có thể sử dụng làm phân xanh, thuốc sát trùng, hạt có thể ép lấy dầu để chữa một số bệnh, than củi xoan cho nhiệt lƣợng cao. Loài cây này cũng có chất theraupic và một số hợp chất limonoids [1], [16], [17]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống Xoan ta Cây Xoan ta là loài cây đa tác dụng, có giá trị cao. Trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sinh học, công dụng của chúng đối với con ngƣời và môi trƣờng sinh thái. Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến chất lƣợng giống Xoan ta lại chƣa đƣợc quan tâm nhiều. Đã có một số công trình trong và ngoài nƣớc nghiên cứu về tái sinh Xoan ta [2], [4], [8], [9], [31], [32], [35], [39], [40]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mới chỉ tập trung vào việc xây dựng qui trình tái sinh in vitro phục vụ bảo tồn, nhân giống vô tính, chọn lọc biến dị soma và phục vụ chuyển gen. Số lƣợng công trình công bố về chuyển gen cải thiện giống Xoan ta còn ít. Trên thế giới mới chỉ có duy nhất một công trình công bố về chuyển gen GFP vào cây Xoan ta, ở Việt Nam có 5 công trình công bố về chuyển gen vào cây Xoan ta: Chuyển gen gus và bar [8]; Chuyển gen 4Cl [37]; Chuyển gen GA20 [3], [4]. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cây Xoan ta đƣợc đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp trọng điểm [7]. Một số trung tâm nghiên cứu nhƣ Trung tâm Giống và công nghệ sinh học thuộc Đại học Lâm nghiệp, Viện Khoa học Lâm nghiệp,… cũng đã tiến hành nhân giống in vitro loài cây này từ các dòng cây trội để sản xuất giống chất lƣợng cao. Đặc biệt, trong chƣơng trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã giao cho Trƣờng Đại học Lâm nghiệp chủ trì đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta biến đổi gen có sức sinh trƣởng nhanh, chất lƣợng gỗ tốt”, kết quả bƣớc đầu đã xây dựng đƣợc kỹ thuật chuyển vào cây Xoan ta và thu đƣợc một số dòng Xoan ta sinh trƣởng nhanh [4], đây là tiền đề quan trọng để cải tiến chất lƣợng giống Xoan ta hiện nay. 1.2. Cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng ở thực vật Điều kiện bất lợi từ môi trƣờng sống - stress (điều kiện bất lợi phi sinh học: mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao,…) dẫn đến hàng loạt các thay đổi về hình thái, tính chất vật lý, hóa sinh, phân tử, điều đó ảnh hƣởng xấu đến sự sinh trƣởng và phát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 triển của thực vật [19]. Để đảm bảo tính toàn vẹn và sống còn của chúng, nhiều loài thực vật có các chiến lƣợc đối phó với những bất lợi phi sinh học khác nhau. Những yếu tố cực đoan khác nhau (mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao,…) đều gây ra hiện tƣợng mất nƣớc trong tế bào. Sự phản ứng của cơ thể sống phụ thuộc vào từng loài, kiểu gen, thời gian tác động và tính khốc liệt của yếu tố cực đoan, độ tuổi và giai đoạn phát triển, dạng đặc thù của các cơ quan hoặc tế bào và phần ngoại vi của chúng [41]. Khi gặp các tác động bất lợi của môi trƣờng, thực vật sẽ tạo ra một số chất kích thích, protein giải độc,.... hoặc hoormon giúp chúng có khả năng thích ứng [5], [6]. Hiện nay, các nghiên cứu về cơ chế chống chịu các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng (mặn, hạn, lạnh, nhiệt độ cao, ...) ở thực vật đang đƣợc tập trung vào hƣớng nghiên cứu làm tăng cƣờng các chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu của tế bào khỏi sự mất cân bằng nƣớc gây chết. Sự tăng cƣờng các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đƣợc phát hiện trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng bất lợi nhƣ hạn hán, muối mặn và lạnh giá. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu là một đặc tính rất quan trọng của tế bào khi bị mất nƣớc do lạnh, muối hoặc hạn. Những thực vật sống trong môi trƣờng thiếu nƣớc bị mất cân bằng về áp suất thẩm thấu trong tế bào đòi hỏi phải có khả năng chống chịu lại điều kiện khắc nghiệt đó [12], [13], [30], [33], [34]. Một trong những phƣơng thức của thực vật chống lại sự mất cân bằng áp suất thẩm thấu đó là dựa trên sự thay đổi trong chuyển hóa tế bào chất dẫn đến sự xuất hiện và tích lũy các chất hòa tan, protein, hoặc các amino acid đặc hiệu [10]. Hiện tƣợng này xảy ra rất nhanh khi bị mất nƣớc. Sự tích lũy các chất này không làm ảnh hƣởng đến hoạt động bình thƣờng của các enzyme nội bào. Ngƣợc lại, sự tích lũy lƣợng lớn các chất hòa tan trong tế bào sẽ điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và lấy nƣớc vào tế bào. Ngoài ra, chúng có thể thay thế vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, tƣơng tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng tế bào và các phức hệ protein. Về mặt hóa học, chúng thƣờng là những phân tử trung hòa về điện, có kích thƣớc rất nhỏ, đóng vai trò quan trọng giúp các phân tử protein và màng tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 chống lại sự biến tính dƣới tác động của các điều kiện bất lợi phi sinh học (abiotic stress) [5], [24]. Chất bảo vệ áp suất thẩm thấu hay các chất hòa tan tƣơng thích thuộc các nhóm chất sau đây: (1). Glycine betaine (là dẫn xuất methyl hóa nhóm nitơ của amino acid); (2). Proline và ectoine (amino acid); (3). Polyols và trehalose (là một hợp chất polyme không phải đƣờng); (4). Các loại đƣờng tan: glucose, sucrose, fructan, manitol, pinitol. Glycine betaine, proline và các nhóm đƣờng thực hiện chức năng nhƣ các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu và bảo vệ tế bào khỏi bị mất nƣớc. Quá trình này liên quan đến một số enzyme chức năng đã đƣợc phân lập và phân tích về mặt sinh hóa nhƣ: các enzyme sinh tổng hợp và chuyển hóa proline, các enzyme giải độc, các enzyme chủ chốt tổng hợp các chất điều hòa áp suất thẩm thấu và các loại protease khác. Protein vận chuyển nƣớc qua màng, chất vận chuyển các đƣờng đơn, proline và glycine betaine đƣợc xem nhƣ có chức năng chuyển nƣớc, proline, glycine betaine, các chất đƣờng đơn qua màng nguyên sinh chất và màng không bào để điều chỉnh áp suất thẩm thấu khi gặp điều kiện cực đoan. Những enzyme giải độc nhƣ glutathione S-transferase, superoxide dismutase, catalase,… tham gia vào quá trình bảo vệ tế bào khỏi bị oxy hóa [5], [11], [19]. 1.2.1. Cơ chế chịu mặn của thực vật Khi môi trƣờng sống có nồng độ các ion Na+, Cl-, sulfate, borate, lithium,... cao sẽ gây độc cho tế bào thực vật. Một trong những hƣớng thay đổi trong thực vật để thích nghi với điều kiện sống là chuyển đổi hệ quang hợp từ hệ C3 sang hệ quang hợp CAM ở loài Mesembryanthemum crytallium, hoặc phát triển tuyến muối ở loài Limonium sp., hoặc phát triển tế bào mô biểu bì chứa không bào dự trữ muối ở loài M. crytallium. Những thay đổi này đã dẫn đến tăng cƣờng lƣợng nƣớc sử dụng có hiệu quả khi phát triển theo cách quang hợp C4. Ở cây lúa nƣớc, khi môi trƣờng có độ mặn cao, cây sẽ điều chỉnh để thích ứng bằng cách làm giảm diện tích lá. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 Muối tích tụ ở các lá già, lá già cuộn lại, héo và chết dần mang theo lƣợng muối nhất định. Những cây lúa chịu mặn chỉ còn lại những lá non có hàm lƣợng muối ít hơn [5]. Môi trƣờng sống có độ mặn cao sẽ làm ức chế sự hấp thụ nƣớc vào trong nội bào, thay đổi khả năng đóng mở của khí khổng và làm thay đổi khả năng hấp thụ CO2 vào tế bào lá cây,... gây tổn thƣơng mô tế bào thực vật. Những thay đổi trong trao đổi chất thƣờng dẫn đến sự gia tăng một số chất liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu nôi bào nhƣ glycine betain, proline, ectoine hoặc pylol,...Tuy nhiên, thông thƣờng sự điều chỉnh này chỉ đòi hỏi tăng cƣờng của một trong những enzyme trong con đƣờng tổng hợp hoặc chuyển hóa các chất đó [5]. Trong các vùng bị nhiễm mặn kéo dài (ven biển), những cây có khả năng chịu mặn thích nghi với môi trƣờng sống đều có những thay đổi sâu sắc trong trao đổi chất cũng nhƣ có các cơ chế chống chịu thích hợp [5]. Các biến đổi đó thƣờng đi theo các hƣớng sau: (1) Loại bỏ các dạng oxy hoạt hóa – ROS (reactive oxygen species) sinh ra trong điều kiện mặn. (2) Tăng cƣờng các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu. (3) Kiểm soát sự hấp thụ ion Na+, K+, Ca2+ và hấp thụ nƣớc. (4) Sinh tổng hợp một số protein có khả năng chống chịu mặn. 1.2.1.1. Loại bỏ các dạng oxy hoạt hóa – ROS sinh ra trong điều kiện mặn Trong trƣờng sống bị nhiễm mặn, tế bào thực vật bị mất nƣớc và tạo ra nhiều dạng oxy hoạt hóa – ROS trong tế bào nhƣ Ozon (O3), superoxide anion (O2*-), hydrogen peroxide (H2O2), gốc pehydroxyl tự do (O2H*),... Khi nồng độ ROS cao làm giảm tốc độ quanq hợp, gây tổn thƣơng cho lá, hạn chế tốc độ sinh trƣởng của mầm và rễ, đẩy nhanh sự già cỗi dẫn đến giảm năng suất cây trồng. ROS gây tổn thƣơng cho các đại phân tử nhƣ lipid và protein trên màng tế bào, tạo ra các gốc tự do, làm tổn thƣơng màng tế bào chất dẫn đến làm thay đổi sự lƣu chuyển các ion, ức chế hoạt tính bơm H+, tăng độ thấm của màng, suy giảm khả năng kiểm soát của màng và tăng lƣợng ion Ca2+ vào tế bào. Cụ thể: ROS làm biến đổi những điểm đặc biệt nhạy cảm, các vị trí amino acid quyết định của hoạt tích protein, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 làm ngắt đoạn chuỗi peptide, thay đổi điện tích. Các protein mất đi chức năng sinh học và cuối cùng chúng bị các protease nhận biết và phân hủy. Ngoài ra, ROS còn tác động gây tổn thƣơng phân tử DNA. ROS làm đội biến DNA nhƣ mất đoạn hoặc những hiệu ứng di truyền bất lợi khác. ROS có thể tác động lên các gốc glycosyl hoặc gốc base ở những vị trí mẫm cảm trên phân tử DNA. ROS tác động lên lục lạp và hệ quang hợp bằng cách làm giảm cƣờng độ phiên mã và dịch mã của RUBISCO. Khi nồng độ ozon cao, tế bào thực vật sẽ đóng khí khổng để ozon không xâm nhập thêm vào mô lá, đồng thời hoạt hóa các hệ thống chống oxy hóa. Chúng hoạt hóa tổng hợp ethylene và tích lũy salicylic acid, các chất này có vai trò hoạt hóa hệ thống bảo vệ của tế bào. Hệ thống bảo vệ tế bào nhằm loại bỏ ROS đƣợc thực hiện nhờ các chất chống oxy hóa tồn tại trong các bào quan. Các chất này gồm các enzyme (catalase, superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, monodehydroascorbate reductase, glutathione reductase,...) và các hợp chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme (ascorbate, glutathione dạng khử, α-tocopherol và carotenoid). 1.2.1.2. Tăng cường các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Sự tăng cƣờng tích lũy các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu đƣợc phát hiện thấy ở nhiều loài thực vật khi sống trong môi trƣờng bất lợi nhƣ mặn, hạn, lạnh giá. Nếu nồng độ muối bên ngoài môi trƣờng ngoại bào cao, môi trƣờng sẽ giữ lại nƣớc và nƣớc sẽ không đƣợc hấp thụ vào bên trong nội bào, ngây ra khan hiếm nƣớc trong tế bào. Để thích ứng tế bào thực vật tăng cƣờng tổng hợp và tích lũy các chất điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhƣ proline, các loại đƣờng tan (glucose, fructose,...),... Các chất này thƣờng có 2 chức năng: Sự tích lũy các chất này trong tế bào sẽ điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng tác động tổng thể mà chúng có khả năng giữ và lấy nƣớc vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+. Ngoài ra, chúng có thể thay thế vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản ứng hóa sinh, tƣơng tác với lipid hoặc protein trong màng nhằm bảo vệ màng tế bào chất không bị phá hủy và bảo vệ các phức protein. Đặc biệt trong điều kiện môi trƣờng mặn, một số loài thực vật còn tăng cƣờng tổng hợp chất glycine betaine và pinitol. Glycine betaine có thể tăng đến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 nồng độ 45 mM để chống chịu mặn. Glycine betaine đƣợc tổng hợp từ choline qua hai phản ứng đƣợc xúc tác bằng choline monooxygenase và betaine aldehyde dehydrogenase. Tuy nhiên, glycine betaine tích trữ và tổng hợp ở họ Plumbaginaceae, Chenopodiaceae và rong tảo biển, mà không tích trữ trong nhiều cây trồng có giá trị kinh tế. Vì vậy, có thể ứng dụng công nghệ gen để cải tiến cây trồng chịu mặn theo hƣớng này. 1.2.1.3. Kiểm soát sự hấp thụ ion Na+, K+, Ca2+ và hấp thụ nước. Đối với cây chịu mặn, việc kiểm soát đƣợc sự hấp thụ các ion và nƣớc đóng vai trò then chốt trong việc hạn chế sự xâm nhập của các ion Na+ và Cl-. Vận chuyển nƣớc, ion qua mang đều do các protein hoặc các phức hệ protein đảm nhiệm. Cơ chế kiểm soát việc gia tăng sƣ biểu hiện cũng nhƣ hoạt hóa các protein và phức hệ protein rất phức tạp và tiến hành theo nhiều bƣớc. Trên màng tế bào có hệ thống các chất làm nhiệm vụ vận chuyển các ion và các chất hữu cơ có trong lƣơng phân tử nhỏ qua màng. Các chất vận chuyển đó bao gồm các bơm, các chất mang và các kênh vận chuyển. Các bơm là các enzyme dạng ATPase vận chuyển các proton H+ và Na+ qua màng tế bào, thƣờng chuyển đƣợc 102 phân tử/giây. Chất mang là các protein hoặc phức hệ protein thƣờng chuyển đƣợc 103 phân tử/giây. Các kênh vận chuyển nƣớc và các chất ion K+, Ca+ và anion thành dòng, thƣờng chuyển đƣợc 108 phân tử/giây. 1.2.1.4. Sinh tổng hợp một số protein có khả năng chống chịu mặn. Khi gặp các điều kiện cực đoan, một số gen liên quan đến tính chống chịu thƣờng đƣợc biểu hiện với tốc độ nhanh để tổng hợp các protein/enzyme có khả năng chống chịu mặn nhƣ P5CS, protein LEA, Protein COR, Speroxide dismutase,... Ở cây Arabidopsis, các gen phản ứng với điều kiện lạnh chiếm từ khoảng 4 20% genome. Protein COR đƣợc cảm ứng bởi điều kiện lạnh thông qua yếu tố CRT/DRE trên promoter. Yếu tố phiên mã CBF1 điều khiển sự biểu hiện của một loạt các gen chịu lạnh nhƣ cor 6.6, cor 15a, cor 47, cor 78. Còn CBF3 tăng cƣờng biểu hiện các gen chịu lạnh liên quan đến sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhƣ tăng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn