Tài liệu Nghiên cứu tận dụng phụ phế liệu lò mổ động vật để thu nhận một số chế phẩm enzyme có giá trị và các ứng dụng

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -------------------- LÊ VĂN BÌNH NGHIÊN CỨU TẬN DỤNG PHỤ PHẾ LIỆU LÒ MỔ ĐỘNG VẬT ĐỂ THU NHẬN MỘT SỐ CHẾ PHẨM ENZYM CÓ GIÁ TRỊ VÀ CÁC ỨNG DỤNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2008 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH ------------------------------ Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu Cán bộ chấm nhận xét 1: Cán bộ chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng 08 năm 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC Tp. HCM, ngày 30 tháng 06 năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Văn Bình Phái: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 23/07/1982 Nơi sinh: Đồng Tháp Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106663 Khóa: 2006 I. TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẬN DỤNG PHỤ PHẾ LIỆU LÒ MỔ ĐỘNG VẬT ĐỂ THU NHẬN MỘT SỐ CHẾ PHẨM ENZYM CÓ GIÁ TRỊ VÀ CÁC ỨNG DỤNG II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Thu enzym pepsin từ niêm mạc dạ dày heo. - Thu hỗn hợp enzym pancreatin từ tụy tạng heo. - Thu hỗn hợp enzym protease từ niêm mạc ruột non. - Thử nghiệm ứng dụng enzym trong sản xuất pepton. - Thử nghiệm ứng dụng enzym trong đông tụ sữa. III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày 25 tháng 02 năm 2008 IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 30 tháng 06 năm 2008 V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua. Ngày TRƯỞNG PHÒNG ĐT – SĐH tháng năm 2008 TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: ¾ Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh. ¾ Phòng Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh. ¾ Ban chủ nhiệm Khoa Công nghệ hóa học – Dầu khí, Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh. ¾ Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh, cùng tất cả quý thầy cô đã hết lòng truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. ¾ PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn. ¾ Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả quý thầy cô và các anh chị. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 06 năm 2008 Lê Văn Bình TÓM TẮT Protease là nhóm enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếu trong phân tử protein và peptide. Protease thực hiện được nhiều chức năng đa dạng và có những ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh học. Protease là một trong ba nhóm enzym công nghiệp lớn, được ứng dụng trong sản xuất các chất tẩy rửa, công nghiệp thuộc da, công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm,... Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu nhận enzym pepsin từ niêm mạc dạ dày heo, hỗn hợp enzym pancreatin từ tụy tạng heo và thu hỗn hợp enzym protease từ niêm mạc ruột non. Sau đó, chúng tôi thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzym trong sản xuất pepton và đông tụ sữa. Để thu nhận enzym pepsin, chúng tôi thực hiện quá trình tự phân bằng HCl 0,5% và kết tủa bằng muối amôn sulfat 70%. Để thu nhận enzym pancreatin và hỗn hợp protease từ niêm mạc ruột non, chúng tôi tiến hành tự phân trong môi trường kiềm và kết tủa enzym bằng cồn 960. Những kết quả đạt được: ¾ Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym pepsin, pancreatin và protease từ niêm mạc ruột non lần lượt là: 7,17%, 6,22% và 2,21%. ¾ Hoạt độ protease của chế phẩm enzym pepsin, pancreatin và protease từ niêm mạc ruột non lần lượt là: 16,670, 3,831 và 1,920 (UI/g CPE). ¾ Hoạt độ đông tụ sữa của chế phẩm enzym pepsin, pancreatin và protease từ niêm mạc ruột non đối với sữa không béo 10% lần lượt là: 344,400, 54,400 và 27,600 (x 103 UI/g CPE). ¾ Hiệu suất thủy phân của chế phẩm enzym pepsin 1% trên các dịch cơ chất đậu nành 25%, tôm 25%, thịt bò 25% và albumin 2% lần lượt là: 9,245%, 14,171%, 11,215% và 21,977%. ¾ Hiệu suất thủy phân của chế phẩm enzym pancreatin 3% trên các dịch cơ chất đậu nành 25%, tôm 25%, thịt bò 25% và casein 2% lần lượt là: 14,668%, 31,993%, 30,452% và 46,444%. Tương tự, protease của ruột non 3% là: 8,885%, 26,539%, 25,992% và 38,347%. ABSTRACT A protease is any enzyme that conducts proteolysis, that is, begins protein catabolism by hydrolysis of the peptide bonds that link amino acids together in the polypeptide chain. Proteases execute a large variety of functions and have important biotechnological applications. Proteases represent one of the three largest groups of industrial enzymes and find application in detergents, leather industry, pharmaceutical industry, food industry and so on. In this study, we recover pepsin from pig stomach mucosae, pancreatin from pig pancreases and proteases from pig small intestine mucosae. Then, we test enzymes for hydrolysing protein in pepton production and curdling milk. In order to recover pepsin, comminuted pig stomach mucosae were steeped in 0.5% hydrochloric acid solution and 70% amonium sulfate was used for enzyme precipitation. In order to recover pancreatin and proteases from pig small intestine mucosae, comminuted pig pancreases and small intestine mucosae were steeped in base solution and 96% ethanol was used for enzyme precipitation. Results: ¾ The recovery yields of pepsin, pancreatin and proteases from small intestine mucosae were 7.17%, 6.22% and 2.21%, respectively. ¾ The activities of pepsin, pancreatin and proteases from small intestine mucosae were 16.670, 3.831 and 1.920 (Units/g enzyme), respectively. ¾ The activities of curdling of pepsin, pancreatin and proteases from small intestine mucosae on 10% fat-free milk were 344.400.103, 54.400.103 and 27.600.103 (Units/g enzyme), respectively. ¾ The hydrolysis yields of 1% pepsin on 25% soya-bean, 25% shelled shrimp, 25% beef and 2% albumin solution were 9.245%, 14.171%, 11.215% and 21.977%, respectively. ¾ The hydrolysis yields of 3% pancreatin on 25% soya-bean, 25% shelled shrimp, 25% beef and 2% casein solution were 14.668%, 31.993%, 30.452% and 46.444%, respectively. Similarly, 3% proteases from small intestine mucosae were 8.885%, 26.539%, 25.992% and 38.347%. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 Phần 1:TỔNG QUAN ...............................................................................................2 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NHÓM ENZYM PROTEASE............................2 1.1.1. Khái niệm chung ...............................................................................................2 1.1.2. Phân loại nhóm enzym protease........................................................................2 1.1.3. Các ứng dụng của protease ...............................................................................4 1.2. PEPSIN................................................................................................................5 1.2.1. Lịch sử của pepsin.............................................................................................5 1.2.2. Nguồn thu nhận .................................................................................................6 1.2.3. Thành phần và cấu tạo.......................................................................................7 1.2.4. Đặc tính ...........................................................................................................10 1.2.5. Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin .............................................................11 1.2.6. Tính chất đặc hiệu và khả năng thủy phân protein của pepsin .......................14 1.2.7. Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin.........................................15 1.2.8. Các phương pháp thu nhận pepsin ..................................................................17 1.2.9. Ứng dụng của pepsin.......................................................................................20 1.3. PANCREATIN .................................................................................................21 1.3.1. Nguồn thu nhận enzym từ tụy tạng .................................................................21 1.3.2. Thành phần và tính chất của pancreatin..........................................................22 1.3.3. Protease tuyến tụy ...........................................................................................22 1.3.4. Amylase tuyến tụy...........................................................................................27 1.3.5. Lipase tuyến tụy ..............................................................................................28 1.3.6. Các phương pháp thu nhận pancreatin............................................................29 1.4. PEPTON............................................................................................................30 1.4.1. Khái niệm pepton ............................................................................................30 1.4.2. Phân loại pepton..............................................................................................30 1.4.3. Tính chất của pepton .......................................................................................31 1.4.4. Các dẫn xuất của pepton .................................................................................31 1.4.5. Phương pháp thu nhận pepton.........................................................................32 1.4.6. Ứng dụng của pepton ......................................................................................32 1.5. ENZYM ĐÔNG TỤ SỮA ...............................................................................33 1.5.1. Tính chất của enzym đông tụ sữa....................................................................33 1.5.2. Cơ chế đông tụ sữa..........................................................................................33 Phần 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............34 2.1. NGUYÊN LIỆU................................................................................................34 2.1.1. Nguyên liệu để thu enzym...............................................................................34 2.1.2. Các nguyên liệu sử dụng trong phương pháp xác định hoạt độ enzym, sản xuất pepton và đông tụ sữa........................................................................................34 2.2. HÓA CHẤT ......................................................................................................34 2.3. THIẾT BỊ SỬ DỤNG.......................................................................................35 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................35 2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................35 2.4.2. Phương pháp thu nhận pepsin .........................................................................36 2.4.3. Phương pháp tách chiết pancreatin và kết tủa bằng cồn 960 ...........................38 2.4.4. Phương pháp thu hỗn hợp protease từ niêm mạc ruột non và kết tủa bằng cồn 960 ......................................................................................................................39 2.4.5. Phương pháp xác định hoạt độ protease .........................................................39 2.4.6. Phương pháp định lượng protein theo Lowry .................................................41 2.4.7. Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl .........................................43 2.4.8. Xác định nitơ formol theo phương pháp Sorensen .........................................45 2.4.9. Xác định hoạt tính enzym α-amylase theo phương pháp Smith và Roe.........47 2.4.10. Xác định hoạt tính enzym lipase theo phương pháp định lượng axít béo.....49 2.4.11. Phương pháp xác định hoạt độ đông tụ sữa ..................................................51 2.4.12. Phương pháp sản xuất pepton .......................................................................52 Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN......................................................................53 3.1. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYM PEPSIN ................................................53 3.1.1. Dịch chiết enzym pepsin từ màng nhầy dạ dày sau tự phân ...........................53 3.1.2. Thu chế phẩm enzym pepsin từ dịch lọc.........................................................54 3.1.3. Xác định hoạt độ đông tụ sữa của chế phẩm enzym pepsin ...........................58 3.1.4. So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzym pepsin trên các dịch cơ chất khác nhau...................................................................................................................61 3.2. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYM PANCREATIN....................................64 3.2.1. Dịch chiết enzym pancreatin từ tụy sau tự phân .............................................64 3.2.2. Thu chế phẩm enzym pancreatin từ dịch lọc ..................................................66 3.2.3. Xác định hoạt độ đông tụ sữa của chế phẩm enzym pancreatin .....................72 3.2.4. So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzym pancreatin trên các dịch cơ chất khác nhau...........................................................................................................74 3.3. THU NHẬN HỖN HỢP ENZYM PROTEASE TỪ NIÊM MẠC RUỘT NON ..........................................................................................................................77 3.3.1. Dịch chiết hỗn hợp enzym protease từ niêm mạc ruột non sau tự phân .........77 3.3.2. Thu chế phẩm enzym protease từ dịch lọc......................................................78 3.3.3. Xác định hoạt độ đông tụ sữa của chế phẩm enzym protease từ ruột non......81 3.3.4. So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzym protease từ ruột non trên các dịch cơ chất khác nhau........................................................................................83 Phần 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................86 4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................86 4.2. ĐỀ NGHỊ...........................................................................................................87 Phần 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................88 Phần 6: PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần amino acid của pepsin.............................................................9 Bảng 1.2. Khối lượng phân tử của các loại pepsinogen và pepsin ...........................10 Bảng 1.3. Lượng enzym của tuyến tụy .....................................................................22 Bảng 3.1. Giá trị ΔOD theo hàm lượng tyrosin ........................................................53 Bảng 3.2. Hoạt độ protease của dịch lọc...................................................................54 Bảng 3.3. Hiệu suất thu chế phẩm enzym pepsin .....................................................54 Bảng 3.4. Hàm lượng muối (NH4)2SO4 trong chế phẩm enzym pepsin ...................55 Bảng 3.5. Hoạt độ của chế phẩm enzym pepsin .......................................................56 Bảng 3.6. Thời gian thủy phân protein theo Dược điển Việt Nam ...........................56 Bảng 3.7. Giá trị ΔOD theo hàm lượng albumin ......................................................57 Bảng 3.8. Hàm lượng protein của chế phẩm enzym pepsin......................................58 Bảng 3.9. Hoạt độ riêng của chế phẩm enzym pepsin ..............................................58 Bảng 3.10. Hoạt độ đông tụ sữa bột không béo 10% của chế phẩm enzym pepsin .59 Bảng 3.11. Hoạt độ đông tụ sữa bột béo 10% của chế phẩm enzym pepsin ............59 Bảng 3.12. Hoạt độ đông tụ sữa tươi của chế phẩm enzym pepsin ..........................59 Bảng 3.13. Hàm lượng Nitơ tổng của các dung dịch cơ chất thủy phân ..................61 Bảng 3.14. Hàm lượng Nitơ formol của dịch đậu nành 25% và hiệu suất thủy phân ..........................................................................................................................62 Bảng 3.15. Hàm lượng Nitơ formol của dịch tôm 25% và hiệu suất thủy phân.......62 Bảng 3.16. Hàm lượng Nitơ formol của dịch thịt bò 25% và hiệu suất thủy phân...62 Bảng 3.17. Hàm lượng Nitơ formol của dịch albumin 2% và hiệu suất thủy phân..62 Bảng 3.18. Hoạt độ protease của dịch lọc.................................................................64 Bảng 3.19. Hoạt độ enzym α-amylase của dịch lọc..................................................65 Bảng 3.20. Hoạt độ enzym lipase của dịch lọc .........................................................66 Bảng 3.21. Hiệu suất thu chế phẩm enzym pancreatin .............................................66 Bảng 3.22. Hoạt độ protease của chế phẩm enzym pancreatin.................................67 Bảng 3.23. Thời gian thủy phân protein theo Dược điển Việt Nam .........................68 Bảng 3.24. Hàm lượng protein của chế phẩm enzym pancreatin .............................69 Bảng 3.25. Hoạt độ riêng protease của chế phẩm enzym pancreatin .......................69 Bảng 3.26. Hoạt độ enzym α-amylase của chế phẩm enzym pancreatin..................70 Bảng 3.27. Hoạt độ riêng α-amylase chế phẩm enzym pancreatin...........................70 Bảng 3.28. Hoạt độ enzym lipase của chế phẩm enzym pancreatin .........................71 Bảng 3.29. Hoạt độ riêng lipase của chế phẩm enzym pancreatin ...........................72 Bảng 3.30. Hoạt độ đông tụ sữa bột không béo 10% của chế phẩm enzym pancreatin ..................................................................................................................72 Bảng 3.31. Hoạt độ đông tụ sữa bột béo 10% của chế phẩm enzym pancreatin ......73 Bảng 3.32. Hoạt độ đông tụ sữa tươi của chế phẩm enzym pancreatin....................73 Bảng 3.33. Hàm lượng Nitơ formol của dịch đậu nành 25% và hiệu suất thủy phân ...........................................................................................................................74 Bảng 3.34. Hàm lượng Nitơ formol của dịch tôm 25% và hiệu suất thủy phân.......75 Bảng 3.35. Hàm lượng Nitơ formol của dịch thịt bò 25% và hiệu suất thủy phân...75 Bảng 3.36. Hàm lượng Nitơ formol của dịch casein 2% và hiệu suất thủy phân .....75 Bảng 3.37. Hoạt độ protease của dịch lọc.................................................................77 Bảng 3.38. Hiệu suất thu chế phẩm enzym protease từ ruột non..............................78 Bảng 3.39. Hoạt độ của chế phẩm enzym protease từ ruột non................................79 Bảng 3.40. Thời gian thủy phân protein theo Dược điển Việt Nam .........................79 Bảng 3.41. Hàm lượng protein của chế phẩm enzym protease từ ruột non..............80 Bảng 3.42. Hoạt độ riêng của chế phẩm enzym protease từ ruột non ......................80 Bảng 3.43. Hoạt độ đông tụ sữa bột không béo 10% của chế phẩm enzym protease từ ruột non...................................................................................................81 Bảng 3.44. Hoạt độ đông tụ sữa bột béo 10% của chế phẩm enzym protease từ ruột non.............................................................................................................................81 Bảng 3.45. Hoạt độ đông tụ sữa tươi của chế phẩm enzym protease từ ruột non ....82 Bảng 3.46. Hàm lượng Nitơ formol của dịch đậu nành 25% và hiệu suất thủy phân ...........................................................................................................................83 Bảng 3.47. Hàm lượng Nitơ formol của dịch tôm 25% và hiệu suất thủy phân.......83 Bảng 3.48. Hàm lượng Nitơ formol của dịch thịt bò 25% và hiệu suất thủy phân...84 Bảng 3.49. Hàm lượng Nitơ formol của dịch casein 2% và hiệu suất thủy phân .....84 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của pepsin và pepsinogen .............................................................9 Hình 3.1. Đường chuẩn tyrosin.................................................................................53 Hình 3.2. Chế phẩm enzym pepsin ...........................................................................55 Hình 3.3. Dung dịch phản ứng ban đầu theo Dược điển Việt Nam..........................56 Hình 3.4. Dung dịch sau thủy phân theo Dược điển Việt Nam ................................56 Hình 3.5. Đường chuẩn albumin...............................................................................57 Hình 3.6. Biểu đồ so sánh hoạt độ đông tụ các loại sữa khác nhau của chế phẩm enzym pepsin.............................................................................................................60 Hình 3.7. Sữa đông tụ ...............................................................................................60 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng Nitơ formol theo thời gian thủy phân các protein khác nhau bởi chế phẩm enzym pepsin .........................................63 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thủy phân các protein khác nhau theo thời gian bởi chế phẩm enzym pepsin ......................................................................................63 Hình 3.10. Chế phẩm enzym pancreatin ...................................................................67 Hình 3.11. Biểu đồ so sánh hoạt độ đông tụ các loại sữa khác nhau của chế phẩm enzym pancreatin ......................................................................................................73 Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng Nitơ formol theo thời gian thủy phân các protein khác nhau bởi chế phẩm enzym pancreatin...................................76 Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thủy phân các protein khác nhau theo thời gian bởi chế phẩm enzym pancreatin................................................................................76 Hình 3.14. Chế phẩm enzym protease ......................................................................78 Hình 3.15. Biểu đồ so sánh hoạt độ đông tụ các loại sữa khác nhau của chế phẩm enzym protease từ ruột non .......................................................................................82 Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng Nitơ formol theo thời gian thủy phân các protein khác nhau bởi chế phẩm enzym protease từ ruột non ...................84 Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thủy phân các protein khác nhau theo thời gian bởi chế phẩm enzym protease từ ruột non ................................................................85 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu .....................................................................................35 Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết enzym pepsin ..........................................................36 Sơ đồ 2.3. Quy trình tách chiết pancreatin và kết tủa bằng cồn 960 .........................38 Sơ đồ 2.4. Quy trình sản xuất pepton........................................................................52 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT - CPE: Chế phẩm enzym - UI: Đơn vị hoạt độ enzym - HĐĐT: Hoạt độ đông tụ sữa 1 MỞ ĐẦU Một trong những thành tựu to lớn của khoa học và công nghệ trong nửa cuối thế kỷ XX là những nghiên cứu về enzym, khám phá về cấu trúc hóa học, cơ chế xúc tác, phương pháp thu nhận và tinh sạch enzym để phục vụ cuộc sống con người. Enzym là một chất xúc tác sinh học chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật, nó đóng vai trò quan trọng và không thể thiếu được trong trao đổi chất. Enzym là một trong những ngành khoa học mũi nhọn của công nghệ sinh học và là lĩnh vực đã đạt được nhiều thành tựu trong cả nghiên cứu khoa học lẫn ứng dụng trong sản xuất công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm. Thực tế ở nước ta, các chế phẩm enzym hầu hết phải nhập từ nước ngoài và có giá thành rất cao nên việc ứng dụng chế phẩm enzym trong sản xuất chưa được rộng rãi. Do đó căn cứ vào nguồn phế phụ liệu rẻ tiền, dồi dào từ lò mổ động vật chưa được tận dụng một cách khoa học và hiệu quả. Chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tận dụng phụ phế liệu lò mổ động vật để thu nhận một số chế phẩm enzym có giá trị và các ứng dụng”. Chế phẩm enzym thu nhận theo phương pháp này có giá thành rẻ hơn nhiều so với giá enzym nhập ngoại. Quy trình sản xuất góp phần tận dụng phế phụ liệu của công nghiệp và chống ô nhiễm môi trường. Mục tiêu của đề tài là hoàn thiện quy trình thu nhận một số chế phẩm enzym có giá trị và ứng dụng các enzym này để tạo một số sản phẩm. Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm: Thu nhận enzym pepsin từ niêm mạc dạ dày heo, hỗn hợp enzym pancreatin từ tụy tạng heo và thu hỗn hợp enzym protease từ niêm mạc ruột non. Ứng dụng các enzym này để thủy phân một số protit và đông tụ sữa. Trong đề tài này, chúng tôi giới hạn phạm vi nghiên cứu như sau: Xây dựng quy trình tách chiết enzym, xác định hoạt độ các chế phẩm enzym, ứng dụng chế phẩm enzym để tạo sản phẩm pepton và ứng dụng đông tụ sữa. 2 Phần 1 TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NHÓM ENZYM PROTEASE 1.1.1. Khái niệm chung [5] [11] [28] Protease là nhóm enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếu trong phân tử protein và peptide. Cơ chế thủy phân như sau: Endopeptidase HO H HO H NH2 – CH – CO – NHCH....NHCHCO – NHCHCO – NHCHCO – NHCHCOOH R1 R2 Amino peptidase R3 R4 HO H R5 R6 Carboxy peptidase Exopeptidase Thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen) và có thể chuyển thành dạng hoạt động do chính protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó, giải phóng một số peptide kìm hãm, khi đó sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, enzym chuyển sang trạng thái hoạt động. 1.1.2. Phân loại nhóm enzym protease [4] [5] [11] [13] Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử protein, người ta chia protease ra làm hai nhóm: 9 Endopeptidase: Chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide mạch ngắn, pepton,...). Nhóm các protease tiêu hóa chủ yếu ở 3 người và động vật gồm có: Pepsin và rennin có trong dịch dạ dày, trypsin và chymotrypsin của tuyến tụy và niêm mạc ruột non đều thuộc nhóm enzym này. 9 Exopeptidase: Chủ yếu phân cắt liên kết peptide ở hai đầu mạch. Ví dụ: Nhóm carboxypeptidase và aminopeptidase phân giải liên kết peptide từ hai đầu mạch polypeptide có nhóm carboxyl và amin tự do. Ngoài ra còn có dipeptidase phân giải dipeptide thành các amino acid tự do. Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia protease thành các nhóm: - Protease acid: Pepsin, rennin,... hoạt động ở vùng pH acid. - Protease kiềm: Trypsin, chymotrypsin,... hoạt động ở vùng pH kiềm. - Protease trung tính: Amylase, papain,... hoạt động ở vùng pH trung tính. Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động, người ta chia protease thành bốn nhóm: 9 Protease – serine Ở trung tâm hoạt động của những enzym này có mặt của một gốc serine và một gốc histidine. Các enzym này chủ yếu chỉ tấn công vào các liên kết peptide giữa một số acid amin. Những enzym thuộc nhóm này có khoảng pH hoạt động từ 7 – 10, hay gọi là các protease kiềm. Những enzym điển hình có nguồn gốc động vật như trypsin, chymotrypsin,... Một số vi sinh vật cũng có thể sinh tổng hợp được các enzym protease serine như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Bacillus subtilis,... 9 Protease – cysteine Là các protease có nhóm –SH của gốc cysteine trong trung tâm hoạt động, trực tiếp tham gia xúc tác thủy phân. Các enzym điển hình đại diện cho nhóm này bao gồm bromelin, papain, ficin, enzym từ Streptococcus. Khoảng pH hoạt động của chúng rất rộng từ 4,5 – 10, khoảng pH tối ưu là 6 – 7,5. Các enzym này thể hiện tính đặc hiệu rộng. 4 9 Protease – metalo Trung tâm hoạt động của các enzym này có chứa các ion kim loại (Zn2+, Mn2+,...), trực tiếp tham gia xúc tác phản ứng. Nhóm này bao gồm các exopeptidase như: carboxypeptidase, aminopeptidase, dipeptidase,... Một số vi sinh vật cũng có thể sinh tổng hợp được các enzym này như: Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis, Streptomyces griseus,... 9 Protease – aspartic Cấu trúc của trung tâm hoạt động của các enzym này gồm hai nhóm carboxyl của hai gốc aspartate. Nhóm này bao gồm các enzym điển hình như pepsin, rennin, cathepsin D. pH hoạt động của các enzym này trong khoảng 2 – 5, nó tùy thuộc vào loại cơ chất và loại enzym. 1.1.3. Các ứng dụng của protease [1] [13] [15] [18] 1.1.3.1. Trong công nghiệp thịt Trong công nghiệp chế biến thịt, có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm mềm thịt, các chế phẩm thường dùng là papain, bromelin, ficin và các chế phẩm protease từ vi sinh vật như Aspergillus oryzae. Khi sử dụng các chế phẩm protease thì chất lượng thịt được nâng lên, thời gian chín được giảm xuống rất nhiều. 1.1.3.2. Trong công nghiệp sữa Protease còn có khả năng làm đông tụ sữa trong sản xuất pho mát. Các enzym có hoạt tính đông tụ sữa cao như rennin và pepsin. Ngày nay người ta đã có các chế phẩm từ vi khuẩn (Bac. Mesentericus) hay từ nấm mốc (Asp. Candidus, Mucor) có hoạt tính enzym tương tự rennin có thể thay thế một phần cho rennin (từ 25 – 50%). 1.1.3.3. Trong công nghiệp thuộc da Dùng chế phẩm protease thô từ vi sinh vật có thể dùng trong thuộc da, tách lông, làm mềm da (chủ yếu phá bỏ collagen, protit trong da). Các loài vi sinh vật sau đây có thể dùng tạo chế phẩm enzym cho thuộc da: - Nấm mốc: Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. parasitucus. - Vi khuẩn: Bac. subtilis, Bac. mesentericus; Xạ khuẩn: Actinomyces fradiae. 5 1.1.3.4. Trong sản xuất tơ tằm Dịch enzym protease từ nấm mốc, vi khuẩn có thể làm bóng và tách rời các sợi tơ tằm, do thủy phân lớp xerixin (là 1 protit) làm dính bết các sợi tơ tự nhiên (lượng xerixin khoảng 30%). 1.1.3.5. Trong sản xuất các chất tẩy rửa Trong quá trình sản xuất bột giặt người ta có bổ sung các enzym có pH tối thích nằm trong vùng kiềm, trong đó có enzym protease để tẩy các vết bẩn, đặc biệt là các vết máu, sữa trên áo quần. 1.1.3.6. Trong mỹ phẩm Hiện nay ở một số nước người ta đã sản xuất các loại kem có chứa protease dùng để xoa mặt, xoa tay và cạo râu,... Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì của da đã chết sẽ được tách ra, tạo sự phát triển cho lớp da non. 1.1.3.7. Trong y học Chế phẩm protease để điều chế dịch thủy phân protein dùng làm môi trường nuôi vi sinh vật (ví dụ: pepton). Cô đặc tinh chế huyết thanh kháng độc (huyết thanh miễn dịch). 1.1.3.8. Trong đời sống và công nghiệp thực phẩm Từ xưa nhân dân ta dùng chế phẩm enzym vi sinh vật (như chế phẩm amilase, protease,...) để chế biến các món ăn dân tộc như: làm chao, tương, nước chấm, lên men rượu, bia. Ngày nay việc ứng dụng enzym này đã ở mức qui mô công nghiệp như ở các nhà máy làm nước chấm, rượu bia,... 1.2. PEPSIN (EC.3.4.4.1) 1.2.1. Lịch sử của pepsin [11] Vào năm 1713, Reaumur và Spallanzaai đã chứng minh bằng kết quả thí nghiệm là có “sự tồn tại một nguyên lý tiêu hóa thịt trong dịch vị”. Sau này, Braconnol và Paulo nghiên cứu về cơ chế tiết dịch vị ở dạ dày, nhưng mãi đến năm 1836 thì Schwann mới phát hiện ra là chất men phân giải protein của dịch vị. 6 Vào năm 1882, Langley đã thu được pepsinogen, là tiền pepsin bằng cách trích dịch vị dạ dày heo với dung dịch kiềm, sau đó dùng acid để chuyển pepsinogen thành pepsin. Đến năm 1930, Northrop đã thu nhận được pepsin dạng tinh thể. Pepsin là một enzym quan trọng của tuyến tiêu hóa động vật thuộc nhóm enzym thủy phân (hydrolase). Số phân loại: EC.3.4.4.1, pepsin có tên hệ thống là peptide – peptidohydrolase. 1.2.2. Nguồn thu nhận [11] 1.2.2.1. Cấu trúc và chức năng của dạ dày ™ Cấu trúc: Dạ dày là một đoạn phình ra của ống tiêu hóa có tác dụng chứa đựng thức ăn, nhào trộn thức ăn để thấm dịch vị. Thức ăn sẽ chịu sự tiêu hóa của các enzym tiêu hóa chứa trong dịch vị, chuẩn bị cho giai đoạn chính của việc tiêu hóa ở ruột non. Lúc đói dạ dày co bóp, khi thức ăn vào cử động co bóp sẽ mạnh hơn và phức tạp hơn. Dạ dày co bóp là nhờ ba lớp cơ khỏe: cơ dọc, cơ vòng và cơ chéo. Dạ dày chịu sự chi phối của hai tổ chức thần kinh: một tổ chức nội tại có búi neissner nằm dưới niêm mạc và búi auerbach nằm trong lớp cơ, hai là tổ chức thần kinh ngoại lai gồm những sợi cảm giác và sợi vận động. ™ Chức năng cơ học của dạ dày bao gồm: - Chức năng chứa thức ăn. - Chức năng co bóp để trộn thức ăn với dịch vị, tạo ra dịch trấp. - Đưa dịch trấp xuống ruột non với một tốc độ thích hợp cho sự hấp thụ và tiêu hóa ở ruột non. ™ Các tuyến chính của dạ dày: - Tế bào niêm dịch bài tiết chất nhầy. - Tế bào chính bài tiết pepsinogen, rennin và gelatinase. - Tế bào viền bài tiết HCl. - Tế bào bài tiết gastrin.