Tài liệu Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh alpha và bêta thalassemia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH ALPHA VÀ BÊTA THALASSEMIA LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH ALPHA VÀ BÊTA THALASSEMIA Chuyên ngành: MÔ PHÔI THAI HỌC Mã số: 62.72.01.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. TRƯƠNG ĐÌNH KIỆT 2. PGS. TS. BS. LÂM THỊ MỸ Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2012 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng có ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nguyễn Khắc Hân Hoan i MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục ................................................................................................................ i Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................ iii Ký hiệu các đột biến gen globin......................................................................... v Danh mục các bảng ..........................................................................................vii Danh mục biểu đồ .............................................................................................. x Danh mục các sơ đồ ........................................................................................... x Danh mục các hình ............................................................................................xi ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Các gen globin và sinh tổng hợp hemoglobin............................................ 3 1.2. Phân loại bệnh thalassemia ........................................................................ 5 1.3. Tầm soát và chẩn đoán trước sinh............................................................ 14 1.4. Các quy trình tầm soát và chẩn đoán trước sinh ...................................... 24 1.5. Tình hình nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh thalassemia tại Việt Nam ............................................................................................... 28 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 31 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn vào mẫu nghiên cứu .................................................. 31 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ................................................................................ 31 2.1.3. Cỡ mẫu .................................................................................................. 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 33 2.2.1. Biến số sử dụng trong nghiên cứu......................................................... 33 2.2.2. Phương pháp tiến hành .......................................................................... 35 2.2.3. Thu thập và phân tích số liệu ................................................................ 50 ii 2.2.4. Y đức ..................................................................................................... 51 2.2.5. Lợi ích mong đợi từ nghiên cứu............................................................ 51 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 52 3.1. Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu ................................ 52 3.2. Tỉ lệ các loại alen đột biến và kiểu gen thalassemia ở các đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 55 3.3. Khả năng tầm soát phát hiện đột biến thalassemia của chỉ số MCV và MCH ...................................................................................................... 70 3.4. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen thalassemia ở các đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 75 3.4.1. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia ............................ 76 3.4.2. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia ............................ 81 3.4.3. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia kèm thalassemia ............................................................................................. 86 Chương 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 89 4.1. Đánh giá về phương pháp nghiên cứu ...................................................... 89 4.2. Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu ................................ 92 4.3. Tỉ lệ các loại alen đột biến -thalassemia và -thalassemia .................... 94 4.4. Tỉ lệ phát hiện đột biến -thalassemia và -thalassemia của chỉ số MCV và MCH...................................................................................... 101 4.5. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia, -thalassemia, -thalassemia kèm -thalassemia ........................................................ 105 KẾT LUẬN .................................................................................................. 119 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 121 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt -3.7 -4.2 --MED --SEA   19 31 (832) CS QS αTα ααT WS  0 + -28 cd17 cd26 cd41 cd43 cd71 cd95 cd119 del1393 del9.6 E Ivs1 Ivs2 tail thal Ý nghĩa đột biến xóa đoạn 3,7 kb α+-thalassemia đột biến xóa đoạn 4,2 kb α+-thalassemia đột biến xóa đoạn Mediterranean α0-thalassemia đột biến xóa đoạn South East Asia α0-thalassemia gen globin alpha alen gen globin 1 và 2 bình thường đột biến điểm gen globin α1 tại codon 19, CGC>GGC đột biến điểm gen globin α2 tại codon 31 AGG>TGG đột biến điểm gen globin α2 tại vị trí +832 G>A đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Constant Spring đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Quong Sze đột biến điểm gen globin α2 đột biến điểm gen globin α1 đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Westmead gen globin beta, alen gen globin  bình thường đột biến 0-thalassemia không tổng hợp chuỗi globin β đột biến +-thalassemia giảm tổng hợp chuỗi globin β đột biến điểm gen globin  tại vị trí -28 A>G đột biến điểm gen globin  tại codon 17AAG>TAG đột biến điểm gen globin  tại codon 26 GAG>TAG đột biến điểm gen globin  tại codon 41/42 -TCTT đột biến điểm gen globin  tại codon 43 GAG>TAG đột biến điểm gen globin  tại codon 71/72 +A đột biến điểm gen globin  tại codon 95 +A đột biến điểm gen globin  tại codon 119 -G đột biến xóa đoạn gen globin  Del 1393 bp đột biến xóa đoạn gen globin  Del 9,6 kb đột biến gen globin  tạo HbE (codon 26 GAG>AAG) đột biến điểm gen globin  tại IVS 1-1 G>T đột biến điểm gen globin  tại IVS 2-654 C>T đột biến điểm gen globin  tại poly A tail T>C đột biến -thalassemia giảm hoặc không tổng hợp chuỗi globin β, iv   ()del   ARMS BVTD CĐTS ĐB DCIP ddNTP DEAE ĐLC dNTP Hb HbCS HbE Hct HgB HGVS HS IVS MCH MCV MLPA NESTROFT OF PCR sequencing SLHC TMNS WHO wt XN không bao gồm đột biến E (codon 26 GAG>AAG). gen globin delta alen gen  bình thường đột biến xóa đoạn DNA chứa gen  và  gen globin gamma gen globin zetta amplification refractory mutation system: hệ thống khuếch đại đột biến có tính chất trơ bệnh viện Từ Dũ chẩn đoán trước sinh đột biến dichlorophenolindophenol dideoxynucleotide triphosphat diethyl aminoethyl độ lệch chuẩn deoxynucleotide triphosphat hemoglobin: huyết sắc tố hemoglobin Constant Spring hemoglobin E hematocrit: dung tích huyết cầu khối lượng hemoglobin Human Genome Variation Society: Hiệp hội Đa dạng Bộ gen người hypersensitive site: vị trí rất nhạy cảm intervening sequence: trình tự chèn hay intron mean corpuscular hemoglobin: số lượng Hb trung bình hồng cầu mean corpuscular volume: thể tích trung bình hồng cầu multiplex ligation-dependent probe amplification: khuếch đại nhiều đoạn dò phụ thuộc kết nối naked eye single tube red cell osmotic fragility test: xét nghiệm sức bền thẩm thấu hồng cầu 1 ống quan sát bằng mắt thường osmotic fragility: xét nghiệm sức bền thẩm thấu polymerase chain reaction: phản ứng kéo dài chuỗi giải trình tự số lượng hồng cầu thiếu máu nhược sắc World Health Organisation: Tổ chức Y tế Thế giới wild type: kiểu gen bình thường xét nghiệm v KÝ HIỆU CÁC ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN Ký hiệu Ý nghĩa Đột biến gen globin α --SEA Đột biến xóa đoạn DNA khoảng 20 kb chứa 2 gen α và không tạo ra được mRNA. Loại đột biến α0-thalassemia. Danh pháp HGVS: NG_000006.1:g.26264_45564del19301 Thai -Đột biến xóa đoạn DNA khoảng 34 – 38 kb chứa 2 gen α và không tạo ra được mRNA. Loại đột biến α0-thalassemia. Danh pháp HGVS: NG_000006.1:g.10664_44164del33501. Dutch 2 -Đột biến xóa đoạn hoàn toàn nhóm gen có chiều dài gần 70 kb và không tạo ra được mRNA. Loại đột biến α0-thalassemia. Đột biến xóa đoạn DNA dài 3,7 kb bao gồm đầu 3’ gen α2 và đầu 5’ -3.7 gen α1. Loại đột biến α+-thalassemia. Danh pháp HGVS: NG_000006.1:g.34164_37967del3804. Đột biến xóa đoạn DNA dài 4,2 kb làm mất hoàn toàn gen α2. Loại -4.2 đột biến α+-thalassemia. Đột biến ở gen α2 tại codon 142, TAA (Stop) đổi thành CAA, làm CS kéo dài thêm 31 codon tạo ra chuỗi globin Constant Spring variant. Loại đột biến α+-thalassemia. Danh pháp HGVS: HBA2:c.427T>C Đột biến ở gen α2 tại codon 125, CTG (Leucine) đổi thành CCG QS (Proline) tạo ra chuỗi globin Quong Sze variant rất kém bền. Loại đột biến α+-thalassemia. Danh pháp HGVS: HBA2:c.377T>C. Đột biến ở gen α2 tại codon 122, CAC (Histidine) đổi thành CAG WS (Glutamine) tạo ra chuỗi globin Westmead variant. Loại đột biến α+thalassemia. Danh pháp HGVS: HBA2:c.369C>G 1 Codon 19 Đột biến ở gen α1 tại codon 19, CGC (Arginine) đổi thành GGC (Lysine). Loại đột biến α+-thalassemia. CGC>GGC 2 Codon 31 Đột biến ở gen α2 tại codon 31, AGG (Arginine) đổi thành TGG (Tryptophan). Loại đột biến α+-thalassemia. Danh pháp HGVS: AGG>TGG HBA2:c.94A>T. 2 +832 G>A Đột biến ở gen α2 tại vị trí +832, A đổi thành G. Loại đột biến α+thalassemia. Danh pháp HGVS: HBA2:c.*+107A>G. Đột biến gen globin β -28 A>G Đột biến vùng promoter, vị trí -28, A đổi thành G làm giảm phiên mã gen β. Loại đột biến: β+. Danh pháp HGVS: HBB:c.-78A>G. Codon 17 Đột biến ở codon 17 thuộc exon 1, AAG (Lysine) đổi thành TAG AAG>TAG (Stop) làm dừng dịch mã gen β tại codon 17. Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.52A>T. vi Codon 26 GAG>AAG Codon 26 GAG>TAG IVS 1-1 G>T Codon 41/42 -TCTT Codon 43 GAG>TAG Codon 71/72 +A Codon 95 +A IVS 2-654 C>T Codon 119 -G Poly A tail T>C Del 9,6 kb Del 1393 bp ()del Đột biến ở codon 26 thuộc exon 1, GAG (Glutamate) đổi thành AAG (Lysine). Đột biến tạo ra chuỗi globin E variant đồng thời tạo ra vị trí ghép nối bất thường với đầu 5’ của IVS-1. Kiểu gen dị hợp tử chỉ gây ra thiếu máu nhẹ. Kiểu gen đồng hợp tử là rối loạn lành tính. Dị hợp tử kép HbE và đột biến β-thalassemia gây thiếu máu nặng. Danh pháp HGVS: HBB:c.79G>A Đột biến ở codon 26 thuộc exon 1, GAG (Glutamate) đổi thành TAG (Stop), làm dừng dịch mã gen β tại codon 26. Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.79G>T. Đột biến ở intron 1 tại vị trí 1, G đổi thành T (AGGTTGGT>AGTTTGGT), làm thay đổi GT của vị trí ghép nối bình thường nên không tạo được mRNA. Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.92+1G>T. Đột biến ở codon 41 và 42 thuộc exon 2, mất đi TTC.TTT (phenyl.phenyl) và đổi thành ----TT, làm lệch khung dịch mã và tạo ra codon 59 mới (Stop). Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.126_129delCTTT. Đột biến ở codon 43 thuộc exon 2, AAG (Axít Glutamic) đổi thành TAG (Stop). Làm dừng dịch mã gen β tại codon 43. Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.130G>T. Đột biến chèn thêm A ở giữa codon 71 và 72 thuộc exon 2, làm lệch khung dịch mã và tạo ra codon 73 mới (TGA : Stop). Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.216_217insA. Đột biến chèn thêm A vào codon 95 thuộc exon 2, làm lệch khung dịch mã và dừng dịch mã ở codon 101 (TGA : Stop). Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.287_288insA. Đột biến ở intron 2 tại vị trí 654, C đổi thành T (AAGGCAATA>AAGGTAATA), tạo ra vị trí ghép nối mới. Loại đột biến: β+ nặng. Danh pháp HGVS: HBB:c.316-197C>T. Đột biến ở codon 119 thuộc exon 3, mất đi G làm lệch khung dịch mã. Danh pháp HGVS: HBB:c.360_361delG. Đột biến ở đuôi poly A, AATAAA đổi thành AACAAA làm quá trình tách và gắn đuôi poly(A) không hiệu quả. Loại đột biến: β+. Danh pháp HGVS: HBB:c.*+110T>C Xóa đoạn 9,6 kb của nhóm gen globin β, từ HBB 11982-L12805 đến 9.6 kb dw' HBB11980-L12803. Loại đột biến: β0. Xóa đoạn gen  dài 1393 nucleotide cách codon bắt đầu khoảng 500 pb đến phân nửa IVS 2. Loại đột biến: β0. Đột biến xóa đoạn DNA chứa gen  và gen , gây kiểu hình thalassemia với HbF tăng. vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Đặc điểm huyết học trên 171 bệnh nhi HbH tại Việt Nam. 9 2 Bảng 1.2. Đặc điểm các thông số huyết học theo kiểu gen αthalassemia. 10 3 Bảng 1.3. Các đột biến -thalassemia phổ biến ở một số quần thể trên thế giới. 11 4 Bảng 1.4. Chẩn đoán, kiểu gen và đặc điểm kiểu hình của thalassemia. 12 5 Bảng 1.5. Kiểu hình huyết học của kiểu gen HbE. 13 6 Bảng 1.6. Các phương pháp tầm soát thalassemia dựa trên MCV và MCH. 16 7 Bảng 1.7. Năng lực của NESTROFT trong các nghiên cứu. 16 8 Bảng 1.8. Các kỹ thuật phân tử chẩn đoán -thalassemia và thalassemia. 19 9 Bảng 1.9. Tỉ lệ các loại đột biến -thalassemia ở người Việt Nam. 29 10 Bảng 2.1. Tỉ lệ mang gen bệnh -thalassemia, -thalassemia và HbE của người Việt Nam trong một số nghiên cứu. 33 11 Bảng 2.2. Định nghĩa các biến số của nghiên cứu. 34 12 Bảng 2.3. Các biến số kết cục và biến số nền của nghiên cứu . 35 13 Bảng 2.4. Các thông số phản ứng giải trình tự gen globin 2 và 1. 46 14 Bảng 2.5. Các thông số phản ứng giải trình tự gen globin . 48 15 Bảng 2.6. Trình tự các mồi sử dụng trong giải trình tự gen 1, 2 và . 49 16 Bảng 3.1. Đối tượng tham gia và loại mẫu xét nghiệm chẩn đoán đột biến gen. 52 17 Bảng 3.2. Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu. 53 18 Bảng 3.3. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen đột biến thalassemia được phát hiện. 55 viii STT Tên bảng Trang 19 Bảng 3.4. Tỉ lệ đột biến thalassemia trong 44.439 thai phụ khám thai tại BVTD. 55 20 Bảng 3.5. Số lượng và tỉ lệ các alen đột biến được phát hiện. 56 21 Bảng 3.6. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen thalassemia. 62 22 Bảng 3.7. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai phụ và chồng. 63 23 Bảng 3.8. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai. 64 24 Bảng 3.9. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai phụ và chồng. 65 25 Bảng 3.10. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai. 66 26 Bảng 3.11. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia kèm thalassemia ở thai phụ và chồng. 67 27 Bảng 3.12. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia kèm thalassemia ở thai. 68 28 Bảng 3.13. So sánh phân bố đột biến gen -thalassemia và thalassemia ở thai phụ và chồng. 69 29 Bảng 3.14. So sánh phân bố đột biến gen -thalassemia và thalassemia ở thai. 69 30 Bảng 3.15. Tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ dương tính giả của các công thức tầm soát đối với thai phụ và chồng được xét nghiệm tìm đột biến thalassemia. 70 31 Bảng 3.16. Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát theo kiểu gen -thalassemia. 71 32 Bảng 3.17. Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát theo kiểu gen -thalassemia. 72 33 Bảng 3.18. Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát theo kiểu gen -thalassemia kèm -thalassemia. 74 34 Bảng 3.19. Đặc điểm các chỉ số huyết đồ và ferritin của thai phụ và chồng được chẩn đoán tìm đột biến gen. 75 35 Bảng 3.20. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ. 76 36 Bảng 3.21. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở chồng. 77 ix STT Tên bảng Trang 37 Bảng 3.22. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ. 78 38 Bảng 3.23. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở chồng. 79 39 Bảng 3.24. Tỉ lệ các trường hợp chỉ bị đột biến -thalassemia có HbA2 > 3,5%. 80 40 Bảng 3.25. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ. 81 41 Bảng 3.26. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở chồng. 82 42 Bảng 3.27. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ. 83 43 Bảng 3.28. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở chồng. 84 44 Bảng 3.29. Tỉ lệ các trường hợp đột biến -thalassemia và HbE có HbA2  3,5%. 85 45 Bảng 3.30. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ và chồng đột biến -thalassemia kèm dị hợp tử -thalassemia hoặc HbE. 86 46 Bảng 3.31. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ và chồng đột biến -thalassemia kèm dị hợp tử -thalassemia hoặc HbE. 87 47 Bảng 3.32. Đặc điểm tỉ lệ HbE theo kiểu gen -thalassemia ở thai phụ và chồng đột biến -thalassemia kèm dị hợp tử HbE. 88 x DANH MỤC BIỂU ĐỒ STT 1 Tên biểu đồ Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ âm tính giả của các tiêu chuẩn tầm soát ở người đột biến E/. Trang 73 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Tên sơ đồ Trang 1 Sơ đồ 1.1. Quy trình xét nghiệm tầm soát thalassemia tại Hy Lạp. 24 2 Sơ đồ 1.2. Quy trình tầm soát và chẩn đoán thalassemia tại Canada. 25 3 Sơ đồ 1.3. Quy trình tầm soát thalassemia dựa trên OF/DCIP tại Thái Lan. 27 4 Sơ đồ 2.1. Quy trình chọn mẫu nghiên cứu. 37 5 Sơ đồ 2.2. Xác định thể thalassemia dựa trên huyết đồ, ferritin, điện di Hb. 37 6 Sơ đồ 2.3. Tiến trình thực hiện chẩn đoán đột biến thalassemia. 45 7 Sơ đồ 2.4. Tiến trình thực hiện chẩn đoán đột biến thalassemia. 47 xi DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình 1 Hình 1.1. Nhóm gen globin α và β và sự tổng hợp globin, hemoglobin ở các giai đoạn phát triển. Hình 1.2. Sơ đồ đột biến xóa đoạn +-thalassemia. Hình 1.3. Sơ đồ đột biến xóa đoạn 0-thalassemia (a) và xóa đoạn HS-40 (b). Hình 1.4. Đặc điểm hồng cầu và đại thể thai chết lưu của bệnh Hb Bart’s. Hình 1.5. Kết quả xét nghiệm DCIP mẫu E/ và mẫu bình thường. Hình 1.6. Sơ đồ minh họa tầm soát HbE bằng DEAE. Hình 1.7. Nguyên lý của kỹ thuật ARMS. Hình 1.8. Nguyên lý của kỹ thuật gap-PCR. Hình 1.9. Nguyên lý của kỹ thuật MLPA. Hình 1.10. Kết quả điện di mao quản xác định trình tự DNA gen globin . Hình 2.1. Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Hình 3.1. Kết quả dò tìm đột biến --SEA, -4.2, -3.7 bằng Multiplex Gap-PCR. Hình 3.2. Kết quả xác định đột biến --SEA bằng Gap-PCR. Hình 3.3. Kết quả dò tìm đột biến điểm CS bằng enzyme cắt giới hạn Mse I. Hình 3.4. Kết quả dò tìm đột biến xóa đoạn -thalassemia bằng MLPA Hình 3.5. Kết quả dò tìm đột biến trên gen globin 2 bằng giải trình tự. Hình 3.6. Kết quả dò tìm đột biến codon 17 AAG>TAG bằng ARMS. Hình 3.7. Kết quả xác định đột biến codon 17 AAG>TAG bằng giải trình tự. Hình 3.8. Kết quả dò tìm đột biến trên gen globin  bằng giải trình tự. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Trang 3 6 7 8 17 18 20 21 22 23 39 58 58 59 59 60 60 61 61 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh thalassemia gây thiếu máu tan máu là bệnh thường gặp trẻ em Việt Nam và cũng là bệnh đơn gen phổ biến nhất trên thế giới, tạo gánh nặng lớn cho gia đình và xã hội. Nguyên nhân của thalassemia là do đột biến gen globin làm giảm tổng hợp một hoặc nhiều các tiểu đơn vị globin để tạo hemoglobin bình thường. Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là một trong những ưu tiên về di truyền người. Vấn đề quản lý bệnh thalassemia bao gồm việc phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị và quản lý lâu dài bệnh nhân đã có. Tuy nhiên, cải thiện kết quả điều trị và quản lý lâu dài đòi hỏi rất nhiều nguồn lực. Ngoài ra, tầm soát toàn bộ quần thể là việc khó khả thi. Vì thế, chương trình kiểm soát thalassemia thường được tiến hành ở mức độ phòng ngừa cấp hai với trọng tâm là tầm soát và chẩn đoán trước sinh nhằm phòng ngừa các trường hợp bệnh mới và giảm tần suất hiện mắc của bệnh. Các quốc gia có tần suất bệnh thalassemia cao như Síp, Ý, Hy Lạp, Thái Lan, Hồng Kông đã xây dựng các chương trình phòng chống bệnh rất thành công thông qua việc tầm soát và chẩn đoán trước sinh. Đến nay, các phương thức tầm soát đơn giản và hiệu quả chủ yếu dựa trên các chỉ số của xét nghiệm huyết đồ như thể tích trung bình của hồng cầu (MCV) và Hb trung bình của hồng cầu (MCH). Việc xác định các loại alen đột biến thalassemia phổ biến trong quần thể cũng giúp cho công tác chẩn đoán xác định được hiệu quả, nhanh chóng và chính xác. Do có tỉ lệ thalassemia lưu hành cao, Việt Nam rất cần một chương trình phòng chống thalassemia. Đến nay, các nghiên cứu về tầm soát và chẩn đoán trước sinh còn rất ít và quy mô nghiên cứu nhỏ. Một số nghiên cứu đã xác lập 2 được các kỹ thuật dò tìm, phát hiện đột biến gen, bước đầu đã khảo sát một số đột biến và đặc điểm huyết học và đề nghị sử dụng chỉ số MCV và MCH để tầm soát thalassemia như khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới và một số quốc gia khác. Tuy nhiên, nhiều câu hỏi về tầm soát, chẩn đoán trước sinh vẫn chưa được làm rõ như: khả năng sử dụng chỉ số MCV, MCH vào tầm soát thalassemia đạt hiệu quả ra sao? Tỉ lệ đột biến -thalassemia, -thalassemia là bao nhiêu, loại nào thường gặp hơn? Đặc điểm kiểu hình của các đột biến thalassemia phổ biến này ra sao? Nếu triển khai áp dụng vào tầm soát và chẩn đoán trước sinh -thalassemia và -thalassemia sẽ có hiệu quả như thế nào? Vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài ‘Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh -thalassemia và -thalassemia’. CÂU HỎI NGHIÊN CỨU Khả năng tầm soát phát hiện -thalassemia, -thalassemia ở phụ nữ mang thai và chồng của chỉ số MCV, MCH như thế nào; đặc điểm kiểu hình huyết học của các đột biến thalassemia ra sao? MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1. Xác định tỉ lệ đột biến thalassemia và tỉ lệ các loại alen đột biến thalassemia và -thalassemia ở phụ nữ mang thai và chồng. 2. Xác định tỉ lệ phát hiện đột biến -thalassemia và -thalassemia và tỉ lệ dương tính giả của tiêu chuẩn MCV < 80 fL và tiêu chuẩn MCH < 27 pg ở phụ nữ mang thai và chồng. 3. Xác định kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia, thalassemia, -thalassemia kèm -thalassemia ở phụ nữ mang thai và chồng. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÁC GEN GLOBIN VÀ SINH TỔNG HỢP HEMOGLOBIN 1.1.1. Đặc điểm chung của các gen globin Các gen globin nằm trong 2 nhóm gen (gene cluster) globin  và globin  (hình 1.1). tuần Hình 1.1. Nhóm gen globin α và β và sự tổng hợp globin, hemoglobin ở các giai đoạn phát triển. “Nguồn: Nguyen Khac Hoan, 2005” [76] Đặc điểm chung của các gen globin là có 3 exon mã hóa trình tự chuỗi protein, 2 intron chứa chuỗi xen không mã hóa và vùng khởi động (promoter) 4 đầu 5’ của gen. Các exon mã hóa cho 141 axít amin của chuỗi giống  và 146 axít amin của chuỗi giống . Các intron dài từ 117 đến 1264 nucleotid. Đặc biệt, intron 2 ở gen  có vai trò quan trọng trong quá trình gắn đuôi poly(A), giải phóng mRNA khỏi khuôn mẫu và vận chuyển ra bào tương [104]. 1.1.2. Nhóm gen globin α Nhóm gen globin  dài gần 28 kb, nằm cách 170 – 430 kb đến đầu tận cánh ngắn nhiễm sắc thể 16 (16pter-p13.3; MIM ID: HBA1,+141880 và HBA2, +141850). Tính từ thượng nguồn (5’) đến hạ nguồn (3’), nhóm gen globin  bao gồm: gen , vùng HVR (hypervariation region) , gen  giả, 1 cặp gen  giả, 1 cặp gen  chức năng, gen  không biểu hiện và cuối cùng là một vùng HVR khác [104]. Người bình thường có 4 gen  globin (/) và 2 gen  globin (/). Gen 1 và 2 chỉ khác nhau 2 vị trí ở intron 2 và vùng 3’ không mã hóa. Tuy mã hóa cùng 1 loại protein nhưng gen 2 tổng hợp lượng globin  cao gấp 3 lần gen 1, nên đột biến (ĐB) gen 2 cho kiểu hình thiếu máu nghiêm trọng hơn [104]. Nằm ở thượng nguồn cách nhóm gen globin  40 kb – 50 kb là vùng điều khiển nhóm gen chứa các trình tự MCS-R1 đến MCS-R4 tương ứng với các vị trí rất nhạy với DNAse 1 đặc hiệu hồng cầu là HS-48, HS-40, HS-33 và HS-10. Trong số này, HS-40 (MCS-R2) nằm cách vị trí mũ chụp mRNA của gen ζ 40 kb đóng vai trò thiết yếu trong kiểm soát biểu hiện nhóm gen α [90]. 1.1.3. Nhóm gen globin β Nhóm gen globin  nằm trên nhiễm sắc thể 11 (11p15.4; MIM ID: HBB, +141900) dài gần 50kb, gồm 1 gen  phôi thai, 2 gen  thai, 2 gen  và  người lớn, 1 gen giả , và sắp xếp theo thứ tự 5’ -  - G - A -  -  -  3’. Kiểu gen của người bình thường là /, /, / và GA/GA [104]. 5 Cách gen  khoảng 5 – 25 kb về phía thượng nguồn là LCR (locus control region) điều hòa nhóm gen . LCR chứa các HS được đánh số từ 5’HS1 đến 5’HS5, chứa các motif gắn các yếu tố hoạt hóa phiên mã giúp điều khiển mở các domain của nhóm gen  và tăng cường biểu hiện gen [90]. 1.1.4. Sinh tổng hợp globin Ở người, sự tổng hợp các chuỗi globin thay đổi theo các giai đoạn phát triển, loại chuỗi globin ở giai đoạn sau thay thế cho loại chuỗi globin ở giai đoạn trước (hình 1.1) [76],[97]. Giai đoạn phôi sớm, túi noãn hoàng sản xuất chuỗi globin  và  để tạo thành các hemoglobin (Hb) chính của phôi là Hb Gower 1 (22), Hb Gower 2 (22), Hb Portland 1 (22) và Hb Portland 2 (22). Khi thai khoảng 4 tháng, sự sản xuất globin  bị ngừng lại [104]. Từ tuần thai thứ 6, globin  và  bắt đầu được sản xuất, HbF (22) tăng trở thành Hb chính. HbA (22) bắt đầu được sản xuất khi thai 28 tuần. Đến khi sinh, tỉ lệ HbA chiếm khoảng 15% tổng số Hb, HbA2 (22) chiếm tỉ lệ rất nhỏ, phần lớn còn lại là HbF. Tuy nhiên, chuỗi  và HbF giảm nhanh sau sinh, thường ổn định khoảng 1 tuổi nhưng đôi khi kéo dài đến 2 tuổi [104]. Ở người lớn bình thường, HbA chiếm đa số với tỉ lệ khoảng 96%, HbA2 có tỉ lệ 2,5% - 3%, HbF ít hơn 1%. Tỉ số HbA2 : HbA ở mức 1:40 [17]. 1.2. PHÂN LOẠI BỆNH THALASSEMIA Thalassemia là một nhóm bệnh do ĐB gen globin làm giảm sản xuất một hoặc nhiều các tiểu đơn vị globin để tổng hợp các Hb bình thường. Dựa trên loại globin bị ảnh hưởng mà bệnh được phân thành 2 loại chính là thalassemia và -thalassemia. Ngoài ra còn có các loại thalassemia hiếm như 6 -, -, - và -thalassemia, và hội chứng tồn lưu HbF di truyền (HPFH) có HbF cao kéo dài suốt đời do bất thường quá trình chuyển đổi từ HbF sang HbA. [104]. Ở nhiều quần thể, thalassemia cùng tồn tại với các Hb variant tạo ra kiểu hình bệnh rất đa dạng [8],[45]. 1.2.1. Bệnh -thalassemia Sự giảm tổng hợp globin  là do ĐB ở gen  làm mất chức năng gen hoặc xóa một đoạn DNA chứa 1 hoặc 2 gen α. Tùy vào số gen bị ảnh hưởng mà ĐB được phân loại thành α0-thalassemia (ĐB 2 gen, ký hiệu --) hoặc α+thalassemia (ký hiệu -α nếu xóa 1 gen, αTα nếu là ĐB điểm gen α2 hoặc ααT nếu là ĐB gen α1). Đến nay đã có 128 ĐB gây -thalassemia với hơn 40 ĐB xóa đoạn. Loại xóa đoạn rất phổ biến và thường phân bố theo địa lý [55]. Trong nhóm các ĐB gây α+-thalassemia (hình 1.2), -3.7 và -4.2 là 2 ĐB thường gặp nhất [56] hiện diện ở mọi quần thể, đặc biệt tần suất cao 60% 80% ở Saudi Arabia, Ấn Độ, Thái Lan, Papua New Guinea, Melanesia [104]. Hình 1.2. Sơ đồ đột biến xóa đoạn +-thalassemia. “Nguồn: Harteveld, 2010”[56] Trong nhóm ĐB gây α0-thalassemia (hình 1.3), có 3 kiểu phổ biến nhất là --SEA ở vùng Đông Nam Á, --MED và --20.5 ở vùng Địa Trung Hải. Một số