Tài liệu NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT, KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE TẠO HƢƠNG AAT CỦA LAN VANDA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC DÂN LẬP VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT, KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE TẠO HƢƠNG AAT CỦA LAN VANDA Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Trần Hoàng Dũng Sinh viên thực tập: Đặng Thị Hồng Oanh (Trƣởng nhóm) Nguyễn Thị Kim Oanh Đặng Hoàng Nhi Nguyễn Văn Vạn Tháng 09/2013 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC DÂN LẬP VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT, KHUẾCH ĐẠI VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GENE TẠO HƢƠNG AAT CỦA LAN VANDA Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Trần Hoàng Dũng Sinh viên thực tập: Đặng Thị Hồng Oanh (Trƣởng nhóm) Nguyễn Thị Kim Oanh Đặng Hoàng Nhi Nguyễn Văn Vạn Tháng 09/2013 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABI Applied Biosystems Incorporated BLAST Basic Local Alignment Search TooL bp base pair cDNA complementary Acid Deoxyribo Nucleic CSDL CTAB Cetyltrimethylammonium bromide ddNTP dideoxynucleotide dNTP deoxynucleotide DNA Acid Deoxyribo Nucleic EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EST Expressed Sequence Tag F Forward GDPS gene genaryl diphosphate synthase ITS Internal transcribed spacer IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry MMDB Molecular Modeling Database NCBI National Center for Biotechnology Information ORF open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction R Reverse iv RNA Ribonucleic acid Taq Thermus aquaticus TBE Tris/Borate/EDTA Tm Melting Temperature VMPAAT Vada mini palmer alcohol acyltransfase UV Ultraviolet v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1. Một số loại lan Vanda .............................................................................. 7 Hình 2.2. Vanda có lá hình trụ tròn ......................................................................... 8 Hình 2.3. Vanda có lá dẹp phẳng ............................................................................. 8 Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt phƣơng pháp hóa học của Maxam và Gilbert ................... 15 Hình Error! No text of specified style in document..5. Hình ảnh mô tả cấu trúc của dNTP và ddNTP ....................................................................................................... 16 Hình 2.6. Nguyên lý của phƣơng pháp dideoxynucleotide ..................................... 17 Hình 2.7. Sơ đồ tóm tắt quy trình giải trình tự bằng máy tự động .......................... 18 Hình 3.1. Các mẫu lanVanda đƣợc thu thập trong nghiên cứu ............................... 23 Hình 4.1. Mẫu lá lanVanda sau khi xử lý ................................................................ 34 4.2. Vanda .............................. 36 4.3. - Vanda ................. 37 4.4. -AAT củ Vanda ................ 37 4.5. - Vanda ............................. 38 Hình 4.6. Trƣờng hợp trình tự DNA có thể hiệu chỉnh trên cả 2 mạch .................... 39 Hình 4.7. Trƣờng hợp trình tự DNA chỉ có thể hiệu chỉnh trên một mạch................ 40 Hình 4.8. Trƣờng hợp trình tự DNA không thể hiệu chỉnh trên cả hai mạch ........... 41 Hình 4.9. Kết quả gióng cột thẳng hàng trên SeaView ........................................... 42 Hình 4.10. Kết quả so sánh trình tự trên Genebank ................................................. 42 Hình 4.11. Kết quả dò tìm trình tự tƣơng đồng bằng công cụ Blast........................ 43 Hình 4.12. Cây phát sinh loài xây dựng bằng phần mềm MEGA 5.2.2 .................. 43 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 25 Bảng 3.2. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ..................................................... 26 Bảng 3.3. Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ................................................... 27 Bảng 3.4. Thông tin về mồi đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR ............................. 30 Bảng 3.5. Các thành phần trong phản ứng PCR ...................................................... 31 Bảng 3.6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR .......................................................... 31 Bảng 4.1. Thông tin về các mẫu lan đƣợc thu thập.................................................. 33 4.2. -AAT ....................... 37 4.3. -AAT ....................... 38 vii MỤC LỤC CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 1.2. Mục đích nghiên cứu ................................................................................................ 3 1.3. Yêu cầu ..................................................................................................................... 3 1.4. Giới hạn đề tài .......................................................................................................... 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 4 2.1. Giới thiệu chung về phong lan ................................................................................. 4 2.2. Vanda ........................................................................................................................ 4 2.3. Tổng quan về vùng VMP-AAT ................................................................................ 9 2.4. Kỹ thuật PCR. ......................................................................................................... 10 2.5. Kỹ thuật giải trình tự .............................................................................................. 14 2.6. Kỹ thuật hiệu chỉnh trình tự .................................................................................... 19 2.7. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................ 20 2.7.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc ................................................................................. 20 2.7.2. Các nghiên cứu trong nƣớc.................................................................................. 21 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 23 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 23 3.2. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................. 23 3.3. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất ...................................................................................... 25 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 28 3.4.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu lá lan ............................................................................. 28 viii 3.4.2. Tách chiết DNA tổng số ...................................................................................... 28 3.5. Định tính DNA ....................................................................................................... 29 3.6. Phản ứng khuếch đại............................................................................................... 30 3.7. Hiệu chỉnh trình tự .................................................................................................. 31 3.8. So sánh với cơ sở dữ liệu GeneBank ...................................................................... 32 .................................................................. 33 4.1. 4.2. Kết quả ............................................................................................ 33 ế ............................................................................. 35 4.3. ................................................... 36 4.3.1. - Vanda, 1 ...................................................................................................................................... .36 4.3.2. - Vanda 2. ....................................................................................................................................... 38 4.4. Kết quả giải trình tự .................................................................................................... 4.5. Phân tích kết quả ........................................................................................................ 4.5.1. So sánh trình tự của mẫu nghiên cứu với ngân hàng GenBank .............................. 4.5.2. Trình tự đoạn gene có hƣơng................................................................................... CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 5.1. Kết luận....................................................................................................................... 5.2. Kiến nghị .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây kinh tế nƣớc ta dần dần đi lên để hội nhập vào nền kinh tế trong khu vực và thế giới. Hiện nay với nhiều mặt hàng nông nghiệp xuất khẩu nhƣ: cà phê, tiêu, điều, cao su, gạo… sản xuất nông nghiệp đã đóng góp một phần quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, cùng với những thành tựu to lớn đạt đƣợc trong sản xuất nông nghiệp, ngành sản xuất hoa lan cũng có những bƣớc tiến đáng kể. Ở một số nƣớc trên thế giới ngành trồng hoa cây cảnh nói chung và hoa lan nói riêng đƣợc sản xuất quy mô công nghiệp đã đem lại hiệu quả kinh tế cao. Hoa lan thực sự trở thành sản phẩm nông nghiệp có giá trị kinh tế cao, nó thúc đẩy ngành sản xuất kinh doanh phát triển mạnh mẽ ở một số nƣớc nhƣ: Thái Lan, Singapore, Malaysia, Indonesia… trong đó Thái Lan có kim ngạch xuất khẩu hoa lan cắt cành năm 1987 là 21 triệu USD, năm 1990 26 triệu USD, năm 1991 là 30 triệu USD, Singapore thu lợi nhuận từ hoa cắt cành mỗi năm là 10 triệu USD. Việt Nam trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển nhanh chóng của nền kinh tế, xã hội… Nhu cầu sử dụng hoa nói chung và hoa lan nói riêng cũng tăng nhanh, không chỉ dùng trong những dịp lễ tết nhƣ trƣớc đây mà nhu cầu về hoa trong cuộc sống thƣờng ngày của ngƣời dân cũng rất lớn, bên cạnh nhu cầu về số lƣợng, chất lƣợng cành hoa cũng đòi hỏi ngày càng cao, số liệu thống kê cho thấy các loài hoa có chất lƣợng cao xuất hiện trên thị trƣờng chủ yếu nhập từ Đài Loan, Thái Lan, Trung Quốc và chủ yếu đƣợc tiêu thụ nhiều nhất ở các đô thị, thành phố lớn. Điều này cho thấy sản xuất hoa ở Việt Nam chƣa đáp ứng đƣợc nhu cầu thị hiếu của ngƣời dân.Trong những năm gần đây, một số loài lan lai đƣợc nhập nội ngày càng nhiều vào nƣớc ta (Catteya, Phalaenopis, Dendrobium, Vanda…) với chất lƣợng ngày càng cao, màu sắc đa dạng đang đƣợc tiêu thụ mạnh. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của nền kinh tế, nhu cầu hoa lan của ngƣời thƣởng thức không chỉ phải đẹp về vẻ bên ngoài nữa mà hiện nay ngƣời ta còn chú ý đến mùi hƣơng và sự đa dạng của hƣơng hoa. 2 Thực tế việc đánh giá hoa lan cho mùi hƣơng của nó đã đƣợc thực hiện trong năm 1989 tại Liên hoan hoa lan quốc tế Grand Prix, Nhật Bản. Kể từ đó, các lễ hội hoa lan khác ở châu Âu, New Zealand, và Bắc Mỹ đã tiến hành theo hƣớng đánh giá bao gồm cả hƣơng thơm vào trong lĩnh vực của họ trong đánh giá phong lan. Thông qua các hội nghị và lễ hội, ngƣời ta tìm kiếm để chọn các giống hoa lan cho mùi hƣơng hấp dẫn đi cùng với vẻ đẹp hình ảnh của chúng. Vì thế trong những năm trở lại đây, có sự quan tâm trở lại về việc tìm những loài hoa lan toàn mĩ: nhìn phải đẹp và ngửi cũng thơm. Vấn đề này đã thu hút sự chú ý của các nhà sản xuất nƣớc hoa và những ngƣời yêu hoa lan - trong việc tìm kiếm những mùi hƣơng mới. Ở những loài lan có hƣơng, hoa của chúng thƣờng có nhƣợc điểm là đƣờng kính hoa nhỏ và mau tàn. Hiện nay, các giống lan thƣơng phẩm hầu hết đã đƣợc lai tạo nên cho kích thƣớc hoa to và màu sắc rực rỡ khi nở. Khi vẻ đẹp của những cánh hoa lan ngày càng trở nên hấp dẫn ngƣời thƣởng thức thì mùi hƣơng nguyên thủy của chúng lại dần biến mất. Ở nơi hoang dã, tinh dầu của những loài hoa lan có hƣơng đƣợc lƣu trữ trên các cánh và đài của hoa. Tinh dầu này sẽ đƣợc giải phóng ra môi trƣờng khi nó tiếp xúc với không khí. Mùi hƣơng này đƣợc chúng sử dụng để thu hút những côn trùng thụ phấn. Một điều đáng tiếc là trong quá trình lai giống các nhà trồng lan thƣơng mại chỉ chú trọng mục đích muốn tăng kích thƣớc của hoa và để giữ cho lâu tàn nên chúng đƣợc đƣa vào trồng và chăm sóc trong nhà kính, chính vì thế chúng dần dần mất đi mùi hƣơng thiên nhiên đặc trƣng mặc dù vẫn giữ đƣợc đầy đủ màu sắc. Điều đáng lƣu ý là ở các loài lan có hƣơng, phần lớn chúng chỉ tỏa hƣơng ở hoa nhƣng lại không biểu hiện ở những bộ phận khác.Vậy trong bộ gen của những loài lan này, đoạn gen nào quy định sự biểu hiện mùi hƣơng của chúng? Với đề tài: “Nghiên cứu tầm soát, khuếch đại và giải trình tự vùng gene tạo hương AAT của lan Vanda”. Chúng tôi tin rằng đề tài này sẽ là một bƣớc đột phá rất lớn của lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật,từ đó tạo tiền đề cho các hƣớng nghiên cứu mới, khai thác ứng dụng các đặc tính quý của các loài thực vật nói chung và ở lan nói riêng để áp dụng vào các lĩnh vực khác của đời sống.Chẳng hạn nhƣ việc cung cấp cơ sở dữ liệu cho ngƣời chơi lan về đặc tính tạo hƣơng của lan… 3 1.2. Mục đích nghiên cứu: “Nghiên cứu tầm soát, khuếch đại và giải trình tự vùng gene tạo hương AAT của lan Vanda”. 1.3. Yêu cầu: Phƣơng pháp thu thập mẫu Ly trích DNA tổng số. Kỹ thuật điện di. Nắm vững kỹ thuật PCR, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện. Biết cách hiệu chỉnh trình tự DNA và kiểm tra kết quả cơ sở dữ liệu nucleotide trên Genbank bằng công cụ BLAST. 1.4. Giới hạn đề tài: Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 23-7-2013 đến 31-9-2013 tại phòng Genome & Bioformatic – Viện kỹ thuật công nghệ cao NTT – ĐH Nguyễn Tất Thành. Thời gian tiến hành tƣơng đối ngắn nên phạm vi nghiên cứu chƣa bao quát hết mà chỉ tập trung ở một số loài lan Vanda. 4 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về phong lan: Trên khắp trái đất, hầu nhƣ nơi nào có thực vật, nơi đó có lan. Số lƣợng nhiều hay ít phụ thuộc khá nhiều về điều kiện khí hậu, độ cao,… của mỗi khu vực. Mỗi loài đều có cách phân bố và cách phát triển rất riêng biệt về kiểu dáng, màu sắc, hƣơng thơm,… Họ Phong lan chiếm vị trí thứ 2 sau họ Cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm với 750 chi và 20000 -25000 loài. Hoa lan mọc khắp nơi trên thế giới trừ Châu Nam Cực, chúng ta có thể tìm thấy chúng tại các vùng có khí hậu nhiệt đới nhƣ rừng già Brazil đến các vùng có tuyết phủ trong mùa đông nhƣ ở Canada (Trần Hợp, 1998). Hoa lan đƣợc ngƣời tiêu dùng ƣa chuộng vì vẻ đẹp đặc sắc và các hình thức đa dạng của chúng. Hình dáng thực có khác nhau, dù rằng phần lớn chỉ là 5 cánh hoa bao bọc chung quanh một cái môi nhƣng mỗi thứ hoa lại có những dị biệt khác thƣờng. Hoa lan có những hoa nhỏ nhƣ đầu chiếc kim gút nhƣng cũng có bụi lan Grammatophylum speciosum. Tại Thái lan có một loại Vanda đƣợc giấu tên và đƣợc bảo vệ rất nghiêm ngặt, hƣơng thơm dành riêng dùng cung cấp cho một nhà sản xuất nƣớc hoa danh tiếng. Hoa lan nếu đƣợc giữ đúng nhiệt độ và ẩm độ có thể còn giữ nguyên hƣơng, nguyên sắc. Đa số các loại hoa lan đƣợc bán rộng rãi trên thị trƣờng thƣờng không có hƣơng thơm nhƣng trong tự nhiên có rất nhiều loại hoa lan có mùi thơm đặc trƣng. Vanilla là một loại hoa lan mà hƣơng thơm đƣợc dùng trong các loại ẩm thực của thế giới và có nguồn gốc từ Mexico, trong khi đó có các loại hoa lan tỏa ra mùi nhƣ thịt bị hỏng để hấp dẫn các côn trùng. 2.2. Vanda Tên “Vanda” do W.Jones đặt tên vào năm 1795, và đƣợc Robert Brown bổ sung, có nguồn gốc từ chữ Phạn là Vệ Đà. Vì vậy, Vanda hay còn gọi là Vân Lan là cái tên 5 có nguồn gốc từ Ấn Độ gồm khoảng 60 -70 loài nguyên thủy, mọc ở Đông Nam châu Á, Trung Quốc, Hymalaya,... cho đến bắc Úc châu. Giống này mọc ở nhiều độ cao khác nhau cho nên điều kiện trồng có khác nhau: các loài ở đồng bằng thích khí hậu nóng trong khi các loài ở núi cao chỉ ƣa nhiệt độ lạnh. Lan Vanda rất đẹp, đa dạng về hình dáng, có loại có hƣơng thơm nhẹ nên đƣợc nhiều ngƣời ƣa thích trồng và thƣởng thức. Hoa Vanda thƣờng tƣơi lâu từ 30 - 45 ngày, tuỳ theo cách trồng, giống, khí hậu. Lan Vanda có thể ra hoa 2 hoặc 3 lần trong một năm với điều kiện chăm sóc tốt. Cùng chung một nhóm với Vanda là Ascocentrum, Ascocenda lai giống giữa Asocentrum và Vanda. Nhiều nhà sinh vật học chuyên về hoa lan trên thế giới (có khoảng 21 ngƣời) đã chia Vanda làm 4 loại khác: 1 - Euanthe căn cứ vào cây Vanda sanderina của Philippines. 2 - Trudelia căn cứ vào những cây mọc ở Himalaya. 3 - Holcoglossum thuộc loại semi teres mọc tại Trung Quốc và Đông Dƣơng. 4 - Papilionathe cho những cây thuộc dạng Teres. Đây là một giống có sự phân bổ rất rộng từ Trung Quốc đến Hilm . Vanda gồm hơn 45 loài đƣợc biết và trên 1.000 loài cây lai tạo thành bộ sƣu tập về lan khá quan trọng. Ở Việt Nam có 5 loài Vanda rừng đƣợc biết là: Vanda concolor, Vanda liouvillei, Vanda lilacina, Vanda denisonaliana và Vanda pumila, tuy nhiên chỉ có một loài cho hoa đẹp bền là loài Vanda denisonaliana. Vanda có sự biến đồi rất lớn về tính chất thực vật và sự xuất hiện của hoa, nhƣng hầu hết chúng đều là những cây lan có giá trị vì có chồi loa dài mang nhiều hoa to. Về phƣơng diện thƣơng mại, Vanda là một giống tƣơng đối đồng nhất về dạng hoa, dạng cây và cả về điều kiện sinh thái. Hầu hết các loài thuộc giống Vanda lại là cây cây lan ƣa nóng. Vanda Vanda với bất cứ một giống lan nào khác. Các cánh hoa của các loài thuộc giống này rất mỏng nhƣng rất bền. Đây là điều đặc biệt khác thƣờng vì độ bền của hoa vốn đã . 6 Tên khoa học và vị trí của Vanda trong hệ thống phân loại Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Bộ : Orchidales Họ : Orchidaceae Chi : Vanda Vanda có các loài: Vanda bidupensis, Vanda concolor, Vanda denisoniana, Vanda fuscoviridisb, Vanda lilacina, Vanda liouvillei, Vanda micholitzii, Vanda pumila… Một số loài có hƣơng nhƣ: Vanda tricolor, Vanda tricolor var suavis, Vanda amesiana, Vanda dearie, Vanda insignis, Vanda lamellate, Vanda luzonica, Vanda merrillii… Đặc điểm hình thái của Vanda Vanda là loại lan đơn thân. Thân hình trụ dài với các lóng khá dài, không có giả hành, lá hình trụ tròn hay dẹp thẳng. Lá dẹp phẳng ở tận cùng thƣờng có 2 thùy không bằng nhau và có răng nhọn không đều. Phát hoa đứng thẳng và không phân nhánh, hoa khá lớn và khá bền. Lá đài và cánh hoa gần nhƣ nhau, bờ mép hơi co vào. Môi gắn chắc vào trụ ngắn, có cựa ngắn và hơi dẹp, trong cựa không có phụ bộ hay có vách hoặc cục u. Môi có 3 thùy, thùy giữa có sọc dọc và 2 cục u ở đáy ngay nơi miệng cựa. Trụ ngắn và mập, trên đầu trụ có nắp che 2 phấn khối với vỉ phấn ngắn mà to và gót dĩa lớn. 7 A B C D E F Hình 2.1. Một số loại lanVanda (http://www.vuonhoalan.net) 8 (a) - Vanda roeblingiana, (b) - Vanda Mini Palmer, (c) – Vanda Robert's Delight 'Garnet Beauty' FCC AOS, (d) - Vanda merrillii (Vanda caerulea), (e) - Vanda 'Wild Cherry', (f) - Vanda Chindawat. Thƣờng ngƣời ta chia Vanda ra 2 nhóm dựa vào đặc điểm của lá: Hình 2.2. Vanda có lá hình trụ tròn. (http://www.vuonhoalan.net) Nhóm có lá hình trụ tròn thƣờng là cây leo bò, lá trụ tròn ngắn thƣa trên thân cũng hình trụ tròn, đòi hỏi ánh sáng nhiều nên phải trồng nơi có sáng hoàn toàn, không che chắn, thuận tiện cho vùng nóng. Hình 2.3. Vanda có lá dẹp phẳng. (http://www.vuonhoalan.net) 9 Nhóm có lá dẹp phẳng, thƣờng là cây phụ sinh trên gỗ, bám trên cành cây cao, lá trải ra, xếp khít nhau che kín thân, đòi hỏi ít ánh sáng hơn nên có thể trồng ở các vùng khác và phải làm giàn che. Cây lai giữa 2 dạng này cho ra dạng lá thay đổi ở khoảng giữa lá hình lòng máng đến hình trụ tròn, gọi là Vanda nửa-trụ tròn (semi-terete Vanda) cần ánh sáng cao hơn dạng lá hẹp phẳng nhƣng thấp hơn dạng lá hình trụ tròn. Cây lai giữa Vanda lá dẹp phẳng với Vanda nữa trụ tròn cho ra nhóm thứ tƣ gọi là Vanda phần tƣ trụ tròn, chúng có “máu” 3 phần lá dẹp phẳng, 1 phần lá trụ tròn. Điều kiện sinh thái: Vanda ất ít mọc trên đá hay trên đất. Phần lớn Vanda đều thích sống trên thân gỗ mục vì điều này giúp rễ của cây hút đƣợc hơi ẩm trong không khí tốt hơn. Trong vƣờn nhà, nên trồng Vanda trong giỏ có nhiều lỗ thoáng khi lớn, treo cao và thả rễ thòng xuống bên dƣới. 2.3. Tổng quan vùng VMPAAT Nghiên cứu vùng gene VMPAAT là một ORF có khoảng 1343bp để mã hóa một polypeptide có 448 acid amin có khối lƣợng phân tử là 48,8kDa và điểm đẳng điện là 8,64. Các nghiên cứu sự biểu hiện của vùng VMPAAT cho thấy mùi hƣơng đƣợc ƣu tiên biểu hiện trong các mô thực vật nhƣ cánh hoa, đài hoa và thân nhƣng tƣơng đối thấp trong các mô thực vật (rễ và lá). Biểu hiện của VMPAAT ở các giai đoạn phát triển của hoa cũng khác nhau nhƣng nó biểu hiện cao nhất trong giai đoạn nở hoa, tiếp theo là hoa nở hoàn toàn và nụ hoa. Ngoài ra, nó cũng biểu hiện khác biệt ở các thời điểm khác nhau trong vòng 24h: xu hƣớng tăng bắt đầu từ rất sớm vào buổi sáng và giảm về sau vào buổi chiều và đến đêm lại tăng dần. 2.4. Kỹ thuật PCR Phản ứng PCR 10 PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, đƣợc dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen". PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống nhƣ E.coli hay nấm men. PCR đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, nhƣ phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống. PCR đƣợc dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định đƣợc một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó đƣợc đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base. Một vài phƣơng pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ nhƣ tế bào ngƣời chứa hơn 3 tỉ cặp base. Nhƣ đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần đó là: - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại. - Cặp mồi (primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi). - DNA - polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA - polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trƣờng hóa học cho DNA - polymerase. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Nguyên tắc và mục đích thiết kế mồi Mồi là gì 11 Mồi là một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với một mạch của DNA khuôn mẫu và có mang một đầu 3’- OH tự do giúp DNA – polymerase bắt đầu tổng hợp một chuỗi DNA mới. Mồi trong phản ứng sao chép DNA là những trình tự RNA ngắn đƣợc tổng hợp bởi enzyme Primase. Mồi trong sinh học phân tử là những đoạn oligonucleotide ngắn đƣợc tổng hợp hóa học Primer ở bên trái tác động trên sợi DNA 3’- 5’ đƣợc gọi là primer thuận (forward - primer, kí hiệu là F). Primer ở bên phải tác động trên sợi DNA 5’- 3’ đƣợc gọi là primer ngƣợc (reverse - primer, kí hiệu là R). Ứng dụng: phản ứng PCR, lai phân tử,… Đặc điểm của mồi Tính duy nhất: Mỗi primer chỉ có duy nhất một trình tự trên sợi DNA đích và không bắt cặp trên các trình tự DNA khác. Chiều dài mồi: Chiều dài của mồi ảnh hƣởng tới tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy cũng nhƣ nhiệt độ bắt cặp của nó. Nói cách khác, primer càng dài thì tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy cũng nhƣ nhiệt độ bắt cặp của nó càng cao. Chiều dài của mồi không đƣợc thấp hơn 14 bases để đảm bảo tính duy nhất của mồi thích hợp. Chiều dài phù hợp là từ 18 – 28 bases. Thành phần base: Ảnh hƣởng đến tính đặc hiệu của quá trình bắt cặp, nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp và sự ổn định cấu trúc phân tử của primer. Các trình tự đƣợc sắp xếp ngẫu nhiên sẽ tốt hơn trình tự chứa những vùng giàu (A + T) hoặc (G + C) đảm bảo cho việc bắt cặp đặc hiệu Tỷ lệ trung bình (G + C) là 50 - 60% sẽ cho nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ bắt cặp phù hợp cho phản ứng PCR thông thƣờng. 12 Nhiệt độ nóng chảy, Tm là nhiệt độ mà tại đó một nửa sợi DNA là sợi đơn và một nữa còn lại là sợi đôi. Tm tùy thuộc vào thành phần base. Tỷ lệ (G + C) cao trong sợi DNA sẽ dẫn tới nhiệt độ nóng chảy cao vì chứa nhiều liên kết hydro. Tính toán nhiệt độ nóng chảy Tm = [59.9 + 0.41*(%GC) - 600]/chiều dài Với những primer ≤ 20 bases, Tm = 2(A + T) + 4(G + C) Ngoài ra còn có những phƣơng pháp tính toán khác với độ chính xác cao hơn. Nhiệt độ bắt cặp, Ta là nhiệt độ mà tại đó primer bắt cặp với DNA mục tiêu. Ta có thể đƣợc tính toán từ Tm Ta = Tm - primer – 40C Để đảm bảo primer bắt cặp vào DNA mạch khuôn trƣớc khi hai sợi của DNA mạch khuôn hồi tính, cần đảm bảo yêu cầu Tm - sản phẩm – Ta ≥ 300C Tính ổn định: Mồi với đầu 5’ ổn định sẽ cho kết quả khuếch đại tốt nhất: giảm thiểu sự bắt cặp sai trên các đoạn đích chƣa đƣợc biết đến. Tính ổn định thấp của đầu 3’ khó hình thành sợi đôi, không khởi đầu sự tổng hợp DNA. Trong khi đó, đầu 5’ phải có khả năng hình thành sợi đôi bền vững. Nguyên tắc Trình tự của mồi đƣợc thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc, kể cả cấu trúc kẹp tóc. Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngƣợc không đƣợc chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhau thƣờng tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30% < (G + C) < 70%). Không nên nhiều bắt cặp sai với DNA khuôn. Các mồi đƣợc chọn phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA.