Tài liệu Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro và ứng dụng điều trị bệnh viêm tử cung bò của nano bạc và dịch chiết cây bồ công anh lactuca indica l.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THÚY “NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN IN VITRO VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM TỬ CUNG BÒ CỦA NANO BẠC VÀ DỊCH CHIẾT CÂY BỒ CÔNG ANH LACTUCA INDICA L.” Ngành: Thú Y Mã số: 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải PGS.TS. Nguyễn Văn Thanh NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đều được chỉ rõ nguồn gốc trong danh mục tài liệu tham khảo của luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thúy i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực thực sự của bản thân, tôi đã luôn nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo trong Khoa Thú y, Khoa Công nghệ Sinh học, Ban quản lý đào tạo - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Văn Thanh và PGS.TS. Ngyễn Thanh Hải đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban lãnh đạo, các thầy cô giáo trong bộ môn Ngoại Sản - Khoa Thú y, bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học; tập thể cán bộ, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thúy ii MỤC LỤC Lời cam đoan ............................................................................................................................i Lời cảm ơn.............................................................................................................................. ii Danh mục chữ viết tắt.............................................................................................................vi Danh mục bảng..................................................................................................................... vii Danh mục hình ảnh ............................................................................................................. viii Trích yếu luận văn ..................................................................................................................ix Thesis abstract ........................................................................................................................xi Phần 1. Mở đầu .................................................................................................................... 1 1. 1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................... 1 1.2. Mục đích của đề tài ..................................................................................................2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................................3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ..................................................................................................4 2.1. Bệnh viêm tử cung ở trâu bò cái và chẩn đoán bệnh ...............................................4 2.1.1. Viêm tử cung ...........................................................................................................4 2.1.1.1. Viêm nội mạc tử cung (Endometritis) ..................................................................... 4 2.1.1.2. Viêm cơ tử cung (Myomestritis Puerperalis)...........................................................6 2.1.1.3. Viêm tương mạc tử cung (Perimestritis Puerperalis)............................................... 6 2.1.2. Viêm cổ tử cung (Cervitis) ...................................................................................... 7 2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm tử cung ở bò sữa ..................................... 7 2.2.1. Mùa vụ .....................................................................................................................7 2.2.2. Vệ sinh thú y ............................................................................................................8 2.2.3. Phương pháp phối giống .......................................................................................... 8 2.2.4. Quá trình đẻ ............................................................................................................. 8 2.3. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi ........................................................................................................8 2.3.1. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn .....................................................................8 2.3.2. Tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi .......................................................11 2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm tử cung trên thế giới và tại Việt Nam ...............13 2.4.1. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm tử cung trên thế giới ..........................................13 2.4.2. Tình hình nghiên cứu bệnh viêm tử cung tại Việt Nam ........................................14 iii 2.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới và Việt Nam........................................................................................................................15 2.5.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược trên thế giới .....................15 2.5.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng sản phẩm thảo dược ở Việt Nam .....................16 2.5.3. Một số nghiên cứu ứng dụng thảo dược điều trị bệnh viêm tử cung .....................19 2.6. Dược liệu Bồ Công Anh ........................................................................................21 2.6.1. Nguồn gốc phân loại ..............................................................................................21 2.6.2. Mô tả thực vật ........................................................................................................22 2.6.3. Phân bố, thu hái và bào chế ...................................................................................22 2.6.4. Thành phần hóa học ...............................................................................................23 2.6.5. Tác dụng dược lý ...................................................................................................23 2.7. Nano bạc và các ứng dụng trong nhân y và thú y ..................................................24 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................30 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..........................................................................30 3.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................30 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................30 3.2.2. Cao khô dược liệu Bồ công anh.............................................................................30 3.2.3. Vi khuẩn nghiên cứu ..............................................................................................30 3.2.4. Nano bạc ................................................................................................................30 3.2.5. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ...............................................................31 3.2.5.1. Thiết bị, dụng cụ ....................................................................................................31 3.2.5.2. Hóa chất - môi trường ............................................................................................31 3.3. Nội dung nghiên cứu..............................................................................................31 3.3.1. Định tính flavonoid ................................................................................................33 3.3.2. Định tính tanin .......................................................................................................33 3.3.3. Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung...............................................................33 3.3.4. Định tính carotenoid ..............................................................................................34 3.3.5. Định tính polyphenol .............................................................................................34 3.3.6. Định tính đường khử ..............................................................................................34 3.3.7. Định tính chất nhầy ................................................................................................34 3.3.8. Định tính coumarin ................................................................................................34 3.4. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn invitro của nano bạc.....................34 3.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật khi phối trộn với nano bạc ...............................................................................35 iv Phần 4. Kết quả và thảo luận...........................................................................................36 4.1. Tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung trên bò sữa ở một cố địa phương thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội ............................................................................36 4.2. Kết quả phân lập và giám định thành phần vi khuẩn trong dịch tử cung của bò sữa .....................................................................................................................37 4.2.1. Kết quả xác định sự biến đổi về tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò sữa .....................................................................................................38 4.2.2. Kết quả xác định sự biến đổi về thành phần vi khuẩn hiếu khí có trong dịch viêm tử cung của bò sữa ........................................................................................39 4.3. Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau.........................................41 4.3.1. Hiệu suất tách chiết cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau .......................................................................................41 4.3.2. Định tính xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong cao khô dịch chiết lá Bồ Công Anh .....................................................................................................44 4.4. Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò .............48 4.4.1. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng các dung môi khác nhau trên vi khuẩn Staphylococcus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò............48 4.4.2. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng các dung môi khác nhau trên vi khuẩn Streptococcus spp phân lập từ dịch viêm tử cung bò ...........................................................................................................................51 4.4.3. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethyl acetate trên vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung bò khi pha loãng..................54 4.5. Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Streptococcus spp. và Staphylococcus spp. của nano bạc ...................................................................................................57 4.6. Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro khi phối hợp nano bạc và cao dịch chiết Bồ Công Anh ........................................................................................59 Phần 5. Kết luận và kiến nghị...........................................................................................65 5.1. Kết luận ..................................................................................................................65 5.2. Kiến nghị................................................................................................................66 Tài liệu tham khảo .................................................................................................................67 Tài liệu tiếng Việt ..................................................................................................................67 Tài liệu tiếng Anh ..................................................................................................................70 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt CFU Colony Forming Units DC Dịch chiết DNA Deoxyribonucleic acid (gen sợi kép) DMSO Dimethyl sulphoxit ĐV Động vật NSP Non structural protein (Protein phi cấu trúc) LB Luria–Bertani PƯ Phản ứng VTC Viêm tử cung VHHK Vi khuẩn hiếu khí VK Vi khuẩn NSP Nanosilver pratices HIV Human Immuno-deficiency Virus vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh VTC tại một số xã thuộc huyện Ba Vì, HN .................36 Bảng 4.2. Tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong dịch tử cung của bò ..................................38 Bảng 4.3. Tần suất xuất hiện của một số VKHK trong dịch tử cung ................................39 Vi khuẩn ............................................................................................................39 Bảng 4.4. Hiệu suất tách chiết Bồ công anh trong các loại dung môi khác nhau..............42 Bảng 4.5. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học của cao khô dịch chiết Bồ công anh sử dụng dung môi khác nhau .............................................................44 Bảng 4.6. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết Bồ công anh sử dụng các dung môi khác nhau với vi khuẩn Staphylococcus spp. .............................48 Bảng 4.7. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết Bồ công anh sử dụng các dung môi khác nhau với vi khuẩn Streptococcus spp. ................................52 Bảng 4.8. Khả năng ức chế vi khuẩn khi pha loãng cao khô dịch chiết dược liệu Bồ công anh ......................................................................................................55 Bảng 4.9. Kết quả khảo sát hoạt tính diệt khuẩn in vitro của dung dịch nano bạc đối với vi khuẩn Streptococcus spp. và Staphylococcus spp. ...........................58 Bảng 4.10. Khả năng ức chế VK khi pha loãng cao khô dịch chiết dược liệu Bồ công anh (sử dụng dung môi ethanol 70%) phối hợp với nano bạc ............................60 Bảng 4.11. Kết quả thử nghiệm điều trị bò mắc bệnh viêm tử cung ...................................62 vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 4.1. Tỷ lệ bò sữa mắc bệnh VTC ở một số xã thuộc huyện Ba Vì, Hà Nội ......... 37 Hình 4.2. Dược liệu Bồ công anh và bột ............................................................................41 Hình 4.3. Hiệu suất tách chiết Bồ công anh trong các loại dung môi khác nhau ...............42 Hình 4.4. Phản ứng định tính xác định các nhóm hoạt chất có trong cao dịch chiết Bồ công anh ........................................................................................................47 Hình 4.5. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết sử dụng các dung môi khác nhau với vi khuẩn Staphylococcus spp. .....................................................49 Hình 4.6. Khả năng ức chế vi khuẩn Staphylococcus spp. in vitro của các cao khô dịch chiết Bồ công anh .......................................................................................51 Hình 4.7. Khả năng ức chế in vitro của cao khô dịch chiết Bồ công anh sử dụng các dung môi khác nhau với vi khuẩn Streptococcus spp ..................................52 Hình 4.8. Khả năng ức chế VK Streptococcus spp in vitro của cao khô dịch chiết Bồ công anh ........................................................................................................54 Hình 4.9. Khả năng ức chế vi khuẩn in vitro khi pha loãng của cao khô dịch chiết Bồ công anh ........................................................................................................56 Hình 4.10. Tác dụng ức chế VK in vitro của Nano bạc khi pha loãng .................................58 Hình 4.11. So sánh khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết Bồ công anh, có và không bổ sung nano bạc ....................................................................60 Hình 4.12. Kết quả điều trị thử nghiệm trên bò mắc bệnh VTC ..........................................63 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Thúy Tên luận văn: “Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro và ứng dụng điều trị bệnh viêm tử cung bò bằng nano bạc và dịch chiết cây Bồ Công Anh Lactuca indica L.”. Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Phân lập và đánh giá tỷ lệ các loài vi khuẩn có trong dịch tử cung bò. Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết cây Bồ Công Anh sử dụng các dung môi khác nhau và nano bạc đối với vi khuẩn Staphylococus spp. và Streptococus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò. Thử nghiệm hiệu quả điều trị của cao khô dịch chiết Bồ Công Anh và nano bạc. Phương pháp nghiên cứu Lấy mẫu dịch viêm tử cung bò. Sau đó xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung bò bằng phương pháp phân lập vi khuẩn. Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết bằng phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer. Pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml. Phối trộn dịch chiết với nano bạc ở các nồng độ pha loãng khác nhau cho vào các ống nghiệm. Hút 100µl hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc nhỏ lên các lỗ thạch trong đĩa môi trường đã được chang khuẩn. Sau đó nuôi ủ ở điều kiện 370C, sau 24h lấy ra đo đường kính vòng vô khuẩn, đánh giá khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc dựa vào đường kính vòng vô khuẩn. Kết quả chính và kết luận Nghiên cứu này được tiến hành nhằm đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết dược liệu Bồ Công Anh đối với 02 chủng vi khuẩn (Staphylococcus spp., và Streptococcus spp.) phân lập từ dịch Viêm tử cung bò. Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu suất tách chiết dược liệu Bồ Công Anh sử dụng 05 dung môi khác nhau dao động lớn từ 7,2 % (dung môi methanol) đến 12,34% (dung môi n-hexan). Cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng dung môi ethyl acetate có hoạt tính ức chế vi khuẩn tốt nhất trên cả hai chủng vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung. Nồng độ ức chế tối thiểu của cao khô dịch chiết sử dụng dung môi ethyl acetate đối với vi khuẩn Streptococcus spp. là 0,20 mg/ml, với vi khuẩn Staphylococcus spp. là 0,78 mg/ml. ix Nano bạc có khả năng ức chế in vitro đối với cả 02 chủng vi khuẩn nghiên cứu. Bổ sung nano bạc vào cao khô dịch chiết Bồ Công Anh làm tăng khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết. Có thể sử dụng cao dịch chiết Bồ Công Anh kết hợp với nano bạc trong điều trị bệnh viêm tử cung trên bò cho tỷ lệ khỏi bệnh đạt 88,89% và thời gian điều trị trung bình là 04 ngày. Từ khóa: dịch chiết lá dược liệu, ức chế vi khuẩn, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. Viêm tử cung bò. x THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Thi Thuy Thesis title: “Study on In vitro antibacterial effect and application to treatment of metritis in dairy cows by silver nanoparticles and extracts of Lactuca indica L.” Major: Veterinary Code: 60 64 01 01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives Bacterial species in cow metritis succus were isolated and evaluated their ratio. The present study aimed to examine the effect of herbsextract Lactuca indica L, extracted by several different solvents, and evaluating the anti-bacterial effect of the extracts on Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. which were isolated from cow metritis. Effect of the treatment using dry Lactuca indica L. extracts and silver nanoparticles were tested. Materials and Methods Took succus samples from cow metritis. The bacteria causing cow metritis inflammation then were identified by method of bacterial isolation. The bactericidal effect of the extracts was examined by Kirby-Bauer disc diffusion test on agar. The herbsextracts were prepared with the concentration of 100 mg/ml. The herbsextracts were mixed with silver nanoparticles at different dilution concentrations into the test tubes. The mixture of plant herbsextracts and silver nanoparticles were sucked out 100μl and dropped onto holes of agar plates cultured bacteria. Then, incubation was carried out at 370C. After 24 hours, diameters of the sterile rings were measured to evaluate the antibacterial effect of the mixture of plant extracts and silver nanoparticles. Main findings and conclusions This study was conducted to evaluate in vitro bacterial inhibition of dry Lactuca indica L extracts for two strains of bacteria (Staphylococcus spp. and Streptococcus spp.) isolated from cow metritis. The results showed that Lactuca indica L extraction efficiencies using 05 different solvents varied in a large range from 7.2% (methanol solvent) to 12.34% (n-hexane solvent). The dry Lactuca indica L extract using ethyl acetate solvent had the best antibacterial activity against both strains isolated from cow xi metritis. Minimum inhibitory concentration of the dry extract using ethyl acetate solvent for Streptococcus spp. was 0.20 mg/ml, for Staphylococcus spp. was 0.78 mg/ml. Silver nanoparticles had in vitro inhibitory effect on both strains. Addition of nano silver to dry Lactuca indica L extract increased in vitro antibacterial ability of the extract. Treatment of cow metritis using dry Lactuca indica L extracts combined with silver nanoparticles can recover cows up to the ratio of 88.89% and average treatment time was 04 days. Key words: Extract of herbs, Anti-bacterial effect, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., cow metritis. xii PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1. 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Việt Nam là một đất nước vốn không có lịch sử phát triển chăn nuôi bò sữa mà xu hướng này mới chỉ xuất hiện ở Việt Nam vào đầu thế kỷ 20. Chăn nuôi bò sữa cần vốn và công nghệ cao, tuy nhiên Việt Nam hiện nay hoạt động chăn nuôi chủ yếu thực hiện tại các hộ gia đình cá thể với quy mô nhỏ (dưới 20 con), người nông dân thiếu các kiến thức về chăn nuôi và phòng chống bệnh tật cho bò từ đó dẫn đến năng suất thấp, chi phí sản xuất cao và chất lượng sữa không đồng đều. Việt Nam có chi phí sản xuất ở mức trung bình do chăn nuôi không tập trung và quy mô nhỏ (không đạt được lợi ích kinh tế theo quy mô), sản lượng thấp (12-15 lít/con/ngày), giá thức ăn chăn nuôi và thú y ở mức cao, gặp nhiều khó khăn theo Báo cáo chuyên sâu ngành Sữa Việt Nam Quý 2/2016 (2017). Để giảm bớt những khó khăn trong chăn nuôi bò sữa, nhà nước đã có những chính sách khuyến khích, hỗ trợ kỹ thuật, tài chính, song hoạt động chăn nuôi bò sữa vẫn chưa phát triển để tận dụng tối đa điều kiện nhân lực và nguyên liệu thức ăn như ở nước ta. Chính do tập quán và truyền thống chăn nuôi, cùng với sự hiểu biết chưa tốt về kỹ thuật chăm sóc, khai thác và phòng chữa bệnh cho đàn bò sữa, là một trong những nguyên nhân khiến chúng mắc các bệnh, đặc biệt là bệnh về sinh sản như viêm tử cung. Viêm tử cung là bệnh hay xảy ra trên đàn bò sữa và hậu quả của nó thường dẫn tới hiện tượng rối loạn sinh sản, chậm sinh, vô sinh, viêm vú, mất sữa… làm tổn thất lớn đến phát triển chăn nuôi bò sữa và kinh tế gia đình. Kháng sinh là một hướng mà người chăn nuôi sẽ nghĩ đến đầu tiên khi vật nuôi bị bệnh. Trong chăn nuôi, kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong phòng trị bệnh, kích thích tăng trưởng, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn cho gia súc gia cầm. Tuy nhiên, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi đang là mối quan tâm lớn của người tiêu dùng và cơ quan an toàn thực phẩm. Kháng sinh tích lũy trong sản phẩm chăn nuôi không những gây độc mà có thể gây dị ứng cho người tiêu dùng, dư lượng kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi còn là rào cản xuất khẩu của doanh nghiệp Việt Nam. Điều đáng lo ngại là việc sử dụng kháng sinh phổ biến và không đúng cách trong chăn nuôi thú y đã dẫn đến sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn, và nguy hiểm hơn là khả năng truyền gen đề kháng kháng sinh cho 1 vi khuẩn gây bệnh ở người cũng như vi khuẩn trong môi trường, ảnh hưởng đến việc sử dụng thuốc điều trị cho người và vật nuôi. Người tiêu dùng luôn quan tâm đến tác dụng phụ của kháng sinh đối với thực phẩm có nguồn gốc động vật. Kháng sinh không phải lúc nào cũng tốt đối với sức khỏe của vật nuôi cũng như người. Thuốc có thể gây ra tác dụng phụ. Vì lý do này, kháng sinh hiện bị hạn chế hoặc không được phép (cấm cho vào thức ăn gia súc) dùng để điều trị trong chăn nuôi ở một số quốc gia, ví dụ như ở Bỉ cấm sử dụng kháng sinh điều trị cho gia cầm bệnh. Do đó, hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, đã và đang tìm cách giảm sử dụng kháng sinh trên gia súc gia cầm và dần dần thay thế bằng thảo dược thân thiện với môi trường, phát triển sản xuất theo hướng an toàn. Một số loại thảo dược, gia vị và chiết xuất có thể kích thích khẩu và dịch vị hay có chức năng kháng khuẩn, kháng cầu trùng hoặc tẩy giun (Wenk, 2002). Bên cạnh đó, công nghệ nano đang làm một cuộc cách mạng trong nhiều ngành công nghiệp. Đối với ngành nông nghiệp, công nghệ nano, đặc biệt là nano bạc cũng đang được áp dụng để tăng sản lượng và chất lượng sản phẩm của cây lương thực, tăng thời gian dự trữ rau quả, tăng hiệu quả phân bón và thuốc bảo vệ thực vật. Đối với ngành chăn nuôi, thú y, công nghệ nano bạc đang được áp dụng để cải thiện khả năng miễn dịch, giảm sử dụng kháng sinh, ngăn ngừa bệnh, giảm mùi hôi của chất thải, tăng năng suất chăn nuôi và chất lượng sản phẩm. Xuất phát từ tình hình thực tế, nhằm giảm thiệt hại, giảm chi phí điều trị và khắc phục hiện tượng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm, hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro và ứng dụng điều trị bệnh viêm tử cung bò bằng nano bạc và dịch chiết cây Bồ Công Anh Lactuca indica L”. 1.2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết cây Bồ Công Anh sử dụng các dung môi khác nhau và nano bạc đối với vi khuẩn Staphylococus spp. và Streptococus spp. phân lập từ dịch viêm tử cung bò. Đánh giá hiệu quả điều trị thử nghiệm của cao khô dịch chiết Bồ Công Anh và nano bạc. 2 1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Kết quả ngh ên cứu của đề tà nhằm bổ sung cơ sở lý luận về tác dụng dược lý và khả năng ứng dụng điều trị của dược l ệu Bồ Công Anh và nano bạc. Sự thành công của đề tài sẽ là nền tảng để bước đầu xây dựng phương pháp điều trị bệnh viêm tử cung cho bò hạn chế tối đa sử dụng thuốc kháng sinh, góp phần hạn chế sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng. - Kết quả nghiên cứu là một phần quan trọng để tổng hợp và khuyến cáo tình hình bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa và biện pháp phòng trị. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. BỆNH VIÊM TỬ CUNG Ở TRÂU BÒ CÁI VÀ CHẨN ĐOÁN BỆNH Trong số các bệnh ở đường sinh dục trâu bò cái, bệnh thường gặp và gây thiệt hại về kinh tế lớn nhất là bệnh ở tử cung. Chúng bao gồm: viêm tử cung và viêm cổ tử cung. 2.1.1. Viêm tử cung Tử cung là bộ phận quan trọng của cơ quan sinh dục, là nơi làm tổ của thai đảm bảo mọi điều kiện để thai phát triển. Bệnh viêm tử cung đã được nhiều tác giả tập trung nghiên cứu. S.J. Roberts (1980) đã khảo sát các trạng thái bất thường của tử cung bò; Dawson. F.L.M (1983) nghiên cứu về hệ vi khuẩn trong tử cung bò; Kopecky. K.E., B. Larsen (1977) đã theo dõi các hiện tượng nhiễm trùng tử cung do bệnh lao bò gây ra. Mọi quá trình bệnh lý ở tử cung đều ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh sản. Theo Đặng Đình Tín (1985) viêm tử cung có thể chia ra ba thể: viêm nội mạc tử cung, viêm cơ tử cung, viêm tương mạc tử cung. 2.1.1.1. Viêm nội mạc tử cung (Endometritis) Theo Black .W.G (1983) viêm nội mạc tử cung là viêm lớp niêm mạc của tử cung. Đây là một trong những nguyên nhân chủ yếu làm suy giảm khả năng sinh sản của gia súc cái. Viêm nội mạc tử cung phổ biến và chiếm tỷ lệ cao nhất trong các thể viêm ở tử cung. Samad. A., C.S. Ali (1987) theo dõi 17.2293 trâu mắc bệnh đường sinh dục, rối loạn sinh sản cho biết: tỷ lệ trâu bị viêm nội mạc tử cung là cao nhất và chiếm 35,9%. Bệnh viêm nội mạc tử cung thường xảy ra sau khi gia súc sinh đẻ, nhất là trong những trường hợp đẻ khó phải can thiệp bằng tay hoặc dụng cụ làm niêm mạc tử cung bị xây sát, tổn thương. Sau đó là do sự tác động của các vi khuẩn Streptococcus, Staphylococcus, E.coli, Salmonella, Brucella, roi trùng gây viêm nội mạc tử cung (Athur G.H, 1964 ; Settergreen, 1986). Căn cứ vào tính chất, trạng thái của quá trình bệnh lý, viêm nội mạc tử cung có thể chia ra làm hai loại: viêm nội mạc tử cung thể cata cấp tính có mủ và viêm nội mạc tử cung có màng giả. 4 * Viêm nội mạc tử cung thể Cata cấp tính có mủ (Endometritis Catarrhalis Purulenta) Bệnh này gặp nhiều ở bò sau sinh đẻ, niêm mạc cổ tử cung và âm đạo bị tổn thương, sây sát dẫn đến nhiễm khuẩn nhất là khi gia súc bị sát nhau, đẻ khó phải can thiệp. Khi bị bệnh, gia súc biểu hiện một số triệu chứng chủ yếu: thân nhiệt tăng nhẹ, ăn uống giảm, lượng sữa giảm. Con vật có trạng thái đau đớn nhẹ, đôi khi cong lưng rặn, tỏ vẻ không yên tĩnh. Từ cơ quan sinh dục thải ra ngoài hỗn dịch, niêm dịch lẫn với dịch viêm, mủ, lợn cợn những mảnh tổ chức chết. Khi con vật nằm, dịch viêm thải ra càng nhiều, xung quanh âm môn, gốc đuôi, hai bên mông dính nhiều dịch viêm có khi nó khô lại hình thành từng đám vẩy, màu trắng xám. Kiểm tra qua âm đạo, niêm dịch và dịch viêm thải ra nhiều. Cổ tử cung hơi mở và có mủ chảy qua cổ tử cung. Niêm mạc âm đạo bình thường, kiểm tra qua trực tràng có thể phát hiện được một hay cả hai sừng tử cung sưng to, hai sừng tử cung không cân xứng nhau, thành tử cung dày và mềm hơn bình thường. Khi kích thích nhẹ lên sừng tử cung thì mức độ phản ứng co lại của chúng yếu ớt. Trường hợp trong tử cung tích lại nhiều dịch viêm, nhiều mủ thì có thể phát hiện được trạng thái chuyển động sóng. * Viêm nội mạc tử cung màng giả Thể viêm này, niêm mạc tử cung thường bị hoại tử. Vết thương đã ăn sâu vào tầng cơ của tử cung và chuyển thành hoại tử, lúc này con vật xuất hiện triệu chứng toàn thân rõ: Thân nhiệt lên cao, lượng sữa giảm có khi hoàn toàn mất sữa, kế phát viêm vú, con vật ăn uống kém và không nhai lại, biểu hiện trạng thái đau đớn, luôn rặn, lưng và đuôi cong lên. Từ cơ quan sinh dục luôn thải ra ngoài hỗn dịch: Dịch viêm, máu, mủ, lợn cợn những mảnh tổ chức hoại tử, niêm dịch. Chẩn đoán chủ yếu dựa vào khám âm đạo. Nếu có thể thì lấy dịch làm sinh thiết tử cung. Quan sát dưới kính hiển vi những phần lắng lại lấy từ dịch cổ tử cung hay trong tử cung sau khi ly tâm và nhuộm Giemsa để đếm bạch cầu và kiểm tra vi khuẩn. Kết quả xét nhiệm vi khuẩn sẽ cho chúng ta hướng điều trị và kháng sinh cần sử dụng. Qua sinh thiết tiêu bản tử cung xem xét hình thái tổ chức mô cơ nội mạc tử cung sẽ cho chúng ta tiên lượng của bệnh. Tuy nhiên, trong điều kiện sản xuất hiện nay thì khám lâm sàng vẫn là ưu tiên số một. Đồng thời phải kiểm tra cẩn thận những rối loạn có thể có trên buồng trứng như u nang, thể vàng tồn lưu. 5 2.1.1.2. Viêm cơ tử cung (Myomestritis Puerperalis) Theo Settergreen. I (1986) viêm cơ tử cung thường kế phát từ viêm nội mạc tử cung, niêm mạc tử cung bị thấm dịch thẩm xuất, vi khuẩn xâm nhập và phát triển sâu vào tử cung làm niêm mạc bị phân giải, thối rữa gây tổn thương mạch quản và lâm ba quản. Từ đó làm cho các lớp cơ và một ít lớp tương mạc tử cung bị hoại tử. Trường hợp này có thể dẫn đến hiện tượng nhiễm trùng toàn thân, huyết nhiễm trùng hoặc huyết nhiễm mủ. Có khi vì lớp cơ và lớp tương mạc tử cung bị phân giải, bị hoại tử mà tử cung bị thủng hay bị hoại tử từng đám. Ở thể viêm này, gia súc biểu hiện triệu chứng toàn thân rõ: thân nhiệt tăng cao, mệt mỏi, ủ rũ, ăn uống giảm, sản lượng sữa giảm hay mất hẳn. Con vật kế phát chướng bụng đầy hơi, viêm vú, có khi viêm phúc mạc. Gia súc biểu hiện trạng thái đau đớn, rặn liên tục. Từ cơ quan sinh dục luôn thải ra ngoài hỗn dịch màu đỏ nâu, lợn cợn mủ và những mảnh tổ chức thối rữa nên có mùi tanh thối. Kiểm tra qua âm đạo bằng mỏ vịt thấy cổ tử cung mở, hỗn dịch càng chảy ra ngoài âm đạo nhiều hơn, phản xạ đau của con vật càng rõ hơn. Khám qua trực tràng thì tử cung to hơn bình thường, hai sừng tử cung to nhỏ không đều nhau, thành tử cung dày và cứng. Khi kích thích lên tử cung, con vật rất mẫn cảm, đau nên càng rặn mạnh hơn, từ tử cung thải ra nhiều hỗn dịch bẩn. 2.1.1.3. Viêm tương mạc tử cung (Perimestritis Puerperalis) Theo Athur G.H (1964); Đặng Đình Tín (1985) viêm tương mạc tử cung thường kế phát từ thể viêm cơ tử cung. Thể viêm này thường cấp tính cục bộ, toàn thân xuất hiện những triệu chứng điển hình và nặng. Lúc đầu lớp tương mạc tử cung có màu hồng, sau chuyển thành màu đỏ sẫm rồi trở nên sần sùi mất tính trơn bóng. Sau đó các tế bào bị hoại tử và bong ra, dịch thẩm xuất tăng tiết. Trường hợp viêm nặng, lớp tương mạc ở một số vùng có thể dính với các tổ chức xung quanh, gây nên tình trạng viêm mô tử cung (Parametritis) và dẫn đến viêm phúc mạc. Thân nhiệt tăng cao, mạch đập nhanh, con vật ủ rũ, uể oải, đại tiểu tiện khó khăn, ăn uống kém hoặc bỏ ăn, hiện tượng nhai lại giảm hay ngừng. Lượng sữa còn rất ít hay mất hẳn, thường kế phát viêm vú. Con vật luôn biểu hiện trạng thái đau đớn, khó chịu, lưng và đuôi cong, rặn liên tục. Từ âm hộ thải ra ngoài rất nhiều hỗn dịch lẫn mủ và tổ chức hoại tử, có màu nâu và mùi thối khắm. Kiểm tra qua trực tràng thấy thành tử cung dày, cứng, hai sừng tử cung mất cân đối, khi kích thích con vật biểu hiện đau đớn càng rõ và càng rặn mạnh 6 hơn. Trường hợp một số vùng của tương mạc đã dính với các bộ phận xung quanh thì có thể phát hiện được trạng thái thay đổi về vị trí và hình dáng của tử cung, có khi không tìm thấy một hoặc cả hai buồng trứng. Thể viêm này thường dẫn đến kế phát bệnh viêm phúc mạc, bại huyết, huyết nhiễm mủ. 2.1.2. Viêm cổ tử cung (Cervitis) Cổ tử cung được cấu tạo bởi các lớp cơ rắn chắc và lớp niêm mạc có nhiều gấp nếp. Nó là hàng rào bảo vệ tử cung. Cổ tử cung luôn đóng, chỉ hé mở khi động dục và mở hoàn toàn khi sinh đẻ (Nguyễn Văn Thanh và Trần Tiến Dũng, 2002). Bệnh viêm cổ tử cung ở gia súc thường là hậu quả của những sai sót về kỹ thuật thụ tinh nhân tạo, do thao tác đỡ đẻ nhất là các trường hợp đẻ khó phải can thiệp bằng tay hay sử dụng dụng cụ không phù hợp làm cổ tử cung bị sây sát. Viêm cổ tử cung còn do kế phát từ viêm âm đạo, (Nguyễn Văn Thanh và Trần Tiến Dũng, 2002). Hậu quả của viêm cổ tử cung làm cổ tử cung bị tắc, khi gia súc động dục niêm dịch không thoát ra ngoài được. Dùng mỏ vịt và đèn soi khám qua âm đạo: cổ tử cung mở đường kính 1– 2 cm thấy niêm mạc xung huyết hoặc phù rõ, cá biệt có vết loét, dính mủ (Nguyễn Văn Thanh,1999). Kiểm tra qua trực tràng: cổ tử cung sưng to và cứng do tổ chức tăng sinh theo Đặng Đình Tín (1985). 2.2. MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN BỆNH VIÊM TỬ CUNG Ở BÒ SỮA 2.2.1. Mùa vụ Khí hậu Việt Nam bao gồm bốn mùa với các đặc tính thời tiết khác nhau: xuân, hạ, thu, đông. Song thể hiện sự phân hoá rõ hơn là xuân - hạ và thu - đông. Trong mùa xuân hạ thời tiết mưa nhiều, nhiệt độ cao, độ ẩm trong không khí cao là điều kiện thuận lợi để các vi sinh vật gây bệnh phát triển. Nhiệt độ cao làm cho khả năng thu nhận thức ăn giảm, sức khoẻ, sức đề kháng của con vật giảm nên tỷ lệ mắc bệnh của bò sữa rất cao, đặc biệt là bệnh ở đường sinh dục. Ngược lại, thời tiết trong giai đoạn thu đông thì nhiệt độ mát mẻ làm sức đề kháng của con vật được nâng cao. Mặt khác có những thời điểm nhiệt độ hạ thấp xuống rất thấp gây sự bất lợi cho các vi khuẩn gây bệnh phát triển. Vì thế mà các bệnh xảy ra trên đàn bò sữa cũng giảm. Điều đó cho thấy tỷ lệ bệnh viêm tử cung ở hai thời điểm khác nhau có sự khác nhau rõ rệt. 7