Tài liệu Nghiên cứu tác dụng của một số loại thảo dược trong phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP Ở TÔM Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ 2. PGS.TS. Phan Thị Vân NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Huyền i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ và PGS.TS Phan Thị Vân. Chân thành cảm ơn Ban Đào tạo sau đại học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú Y và Phòng Nghiên cứu Bệnh Thủy sản - Viện Nghiên cứu Nuôi trông Thủy sản I đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Cuối cùng xin chân thành cảm ơn đơn vị tài trợ kinh phí để tôi có thể hoàn thiện nghiên cứu. Luận văn này được hoàn thành dưới sự hỗ trợ kinh phí thuộc đề tài Thủy sản do Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn phê duyệt thuộc chương trình công nghệ sinh học Thủy sản tầm nhìn 2020 (Mã số 04/HD-KHCN). Hà Nội, ngày tháng năm2017 Tác giả luận văn Phạm Thị Huyền ii MỤC LỤC Lời cam đoan ................................................................................................................ i Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii Mục lục ....................................................................................................................... iii Danh mục từ viết tắt ......................................................................................................v Danh mục bảng ........................................................................................................... vi Danh mục hình ........................................................................................................... vii Trích yếu luận văn ....................................................................................................... ix Thesis abstract ............................................................................................................. xi Phần 1. Đặt vấn đề.......................................................................................................1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ..........................................................................................2 Phần 2. Tổng quan tài liệu ..........................................................................................3 2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi .................................3 2.1.1. Trên thế giới .......................................................................................................3 2.1.2. Ở Việt Nam .......................................................................................................7 2.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong NTTS .................................. 10 2.2.1. Trên thế giới ..................................................................................................... 12 2.2.2. Tại Việt Nam .................................................................................................... 14 2.3. Một số loại thảo dược được lựa chọn nghiên cứu .............................................. 16 2.3.1. Ké hoa vàng ..................................................................................................... 16 2.3.2. Khổ sâm ........................................................................................................... 17 2.3.3. Nghệ ................................................................................................................18 2.3.4. Thồm lồm .........................................................................................................19 2.3.5. Thầu dầu .......................................................................................................... 20 2.3.6. Đơn buốt .......................................................................................................... 21 Phần 3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 23 3.1. Địa điểm nghiên cứu.........................................................................................23 3.2. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................23 3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 24 3.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 24 iii 3.4.1. Kiểm tra gen độc lực của vi khuẩn V. parahaemolyticus KC12.020 bằng kỹ thuật sinh học phân tử .................................................................................. 24 3.4.2. Thử nghiệm hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm ........................................ 25 3.4.3. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong điều kiện phòng thí nghiệm ....................................................... 26 3.4.4. Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của dịch chiết thô trong quy mô thực nghiệm (pilot) .......................................................29 3.4.5. Phương pháp xử lý và phân tích số liệu............................................................. 32 Phần 4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận .................................................................33 4.1. Xác nhận chủng vi khuẩn gây bệnh ahpnd bằng kỹ thuật sinh học phân tử ........33 4.2. Xác định hoạt tính của các mẫu dịch chiết thô thảo dược trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm .............................34 4.3. Xác định hoạt tính của dịch chiết thô thảo dược trong phòng trị bệnh ahpnd ở tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm .................................................36 4.3.1. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào thức ăn cho tôm ăn ..... 36 4.3.2. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào môi trường nước nuôi tôm ........................................................................................................... 38 4.4. Xác định hoạt tính của dịch chiết thô thồm lồm trong phòng trị bệnh ahpnd trên tôm ở quy mô thực nghiệm (PILOT) ......................................................... 41 4.4.1. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn .................................................................................................................... 41 4.4.2. Sử dụng biện pháp bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào môi trường nước nuôi tôm .......................................................................................................... 46 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ...................................................................................49 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 49 5.2. Kiến nghị.......................................................................................................... 50 Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 51 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt AHPND Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease BVTV Bảo vệ thực vật ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long DMSO Dimethyl sulfoxide HPV Hepatopancreas IMNV Infectious Myoneaosis Virus MHA Mueller Hinton Agar MPV Monoden Baculovirus NB Nutrient Broth NHP Necrotizing Heptopancrcatitis NTTS Nuôi trồng thủy sản TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts TSV Taura Syndrome Virus WSSV White spot syndrome virus YHV Yellow head virus v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Phân loại terpenoid dựa theo liên kết mắt xích........................................... 12 Bảng 3.1. Danh mục thảo dược được chiết xuất dạng thô sử dụng trong nghiên cứu.......... 23 Bảng 3.2. Nồng độ mỗi loại chiết phẩm thô trong khoanh giấy lập kháng sinh đồ.....25 Bảng 3.3. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả dịch chiết thô đối với bệnh AHPND ở tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm ....................................................... 27 Bảng 3.4. Thí nghiệm đánh giá hiệu quả dịch chiết thô thồm lồm đối với bệnh AHPND ở tôm quy mô thực nghiệm (pilot) ............................................... 30 Bảng 4.1. Tác dụng diệt vi khuẩn gây bệnh AHPND của dịch chiết thô .....................34 Bảng 4.2. Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào thức ăn cho tôm ăn trong điều kiện phòng thí nghiệm................................................... 36 Bảng 4.3. Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thảo dược vào môi trường nước nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm ....................................... 39 Bảng 4.4. Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND trong quá trình thí nghiệm (khi sử dụng dịch chiết thô thân lá cây thồm lồm) (%) .............40 Bảng 4.5. Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho tôm ăn ở quy mô thực nghiệm (pilot)......................................................... 42 Bảng 4.6. Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn 7 ngày liên tục trước khi công cường độc (%)...........................................................................................43 Bảng 4.7. Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn 7 ngày liên tục, công cường độc ngày thứ 8 và tiếp tục cho ăn thức ăn chứa dịch chiết thô 7 ngày tiếp theo (%) ............................................................................................................45 Bảng 4.8. Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND khi công cường độc và cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô thồm lồm cùng 1 thời điểm (%) ......46 Bảng 4.9. Kết quả thí nghiệm bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào môi trường nước nuôi tôm ở quy mô thực nghiệm (pilot)............................................. 46 Bảng 4.10. Tỷ lệ mẫu dương tính với tác nhân gây bệnh AHPND khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào nước ở 2 thời điểm (lần 1 ngay khi công cường độc, lần 2 cách lần 1 là 24h) (%) ..................................................... 48 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hiện tượng thoái hoá gan tuỵ cấp tính với mô gan tụy bị phá hủy .............4 Hình 2.2. Trường hợp bình thường với tế bào phân chia...........................................4 Hình 2.3. Trường hợp bất thường thiếu sự phân chia tế bào......................................4 Hình 2.4. Trường hợp bình thường có sự hiện diện của tế bào B, F ..........................4 Hình 2.5. Trường hợp bất thường không có sự hiện diện của tế bào B, F ..................5 Hình 2.6. Tế bào có nhân lớn bất thường ở giai đoạn đầu của AHPND ....................5 Hình 2.7. Nhiễm khuẩn thứ cấp ở giai đoạn sau .......................................................5 Hình 2.8. Tôm sú bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính có gan tụy teo nhỏ ......................7 Hình 2.9. Tôm sú bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính có gan tụy nhạt màu so với bình thường .......................................................................................................7 Hình 2.10. Ké hoa vàng ........................................................................................... 16 Hình 2.11. Khổ sâm ................................................................................................. 17 Hình 2.12. Củ nghệ .................................................................................................. 18 Hình 2.13. Cây thồm lồm ......................................................................................... 19 Hình 2.14. Thầu dầu ................................................................................................ 20 Hình 2.15. Cây đơn buốt .......................................................................................... 21 Hình 4.1. Kết quả xác định chủng vi khuẩn gây AHPND bằng kỹ thuật PCR ......... 33 Hình 4.2. Chuẩn bị pha dịch chiết thô lập kháng sinh đồ (A,B), vòng vô khuẩn của dịch chiết thô đối với vi khuẩn gây bệnh AHPND ở tôm (C,D và E) ...........................................................................................................35 Hình 4.3. Tỷ lệ tôm chết khi cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô M4 và M5 (%) ....... 37 Hình 4.4. Mẫu phân tích sau khi công cường độc vi khuẩn gây bệnh AHPND lên tôm thí nghiệm (1,2, và 3 là mẫu thu thuộc lô sử dụng thảo dược M4, 4,5 và 6 mẫu thu thuộc lô sử dụng thảo dược M5, 7 và 8 thuộc lô đối chứng âm) .................................................................................... 38 Hình 4.5. Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung chế phẩm M4 và M5 vào nước (%)...............39 Hình 4.6. Thử nghiệm hiệu quả hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh AHPND trong phòng thí nghiệm ướt .................................................................... 40 Hình 4.7. Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn 7 ngày liên tục trước khi công cường độc (%) .................................... 43 vii Hình 4.8. Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào thức ăn cho ăn 7 ngày liên tục, công cường độc ngày thứ 8 và tiếp tục cho ăn thức ăn chứa dịch chiết thô 7 ngày tiếp theo (%) ..................................... 44 Hình 4.9. Tỷ lệ tôm chết khi công cường độc và cho tôm ăn thức ăn chứa dịch chiết thô thồm lồm cùng 1 thời điểm (%) ................................................ 45 Hình 4.10. Tỷ lệ tôm chết khi bổ sung dịch chiết thô thồm lồm vào nước ở 2 thời điểm (lần 1 ngay khi công cường độc, lần 2 cách lần 1 là 24h) (%) ......................................................................................................... 47 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Phạm Thị Huyền Tên Luận văn: Nghiên cứu tác dụng của một số loại thảo dược trong phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm. Ngành: Thú Y Mã số: 60.64.01.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1. Mục đích nghiên cứu Xác định được loại thảo dược có hiệu quả phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi. 2. Đối tượng nghiên cứu Tôm nuôi nước lợ, vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp và sáu loại thảo dược bao gồm: Thồm lồm, Ké hoa vàng, Nghệ, Khổ sâm, Thầu dầu và Đơn buốt. 3. Phương pháp nghiên cứu - Kiểm tra gen độc lực của vi khuẩn V. parahaemolyticus KC12.020 bằng kỹ thuật sinh học phân tử. - Thử nghiệm hoạt tính của các mẫu dịch thô trong điều kiện invitro đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm. - Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của chế phẩm trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Thử nghiệm hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm của chế phẩm ở quy mô thực nghiệm (pilot). 4. Một số kết quả chính và kết luận Hoàn thành đề tài chúng tôi có một số kết quả chính và kết luận sau:  Trong điều kiện invitro - Sản phẩm dịch chiết thô từ thầu dầu và thồm lồm có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn V. parahaemolyticus KC12.020 gây bệnh AHPND trên tôm nuôi nước lợ. - Dịch chiết thô ethanol thu được từ thân lá cây thồm lồm có hiệu quả diệt vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh AHPND với đường kính vòng vô khuẩn đạt 19,820,6 mm khi sử dụng nồng độ 66,7-200 µg/khoanh/20 µl.  Ở quy mô phòng thí nghiệm: - Sản phẩm dịch chiết thô thầu dầu và thồm lồm không có hiệu quả phòng bệnh AHPND qua đường ăn với nồng độ lần lượt tương ứng 25-30g dịch thô/100kg tôm và 35 -40g dịch thô/100kg tôm. ix - Sản phẩm dịch chiết thô thồm lồm có hiệu quả diệt khuẩn V.parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng phương thức bổ sung vào môi trường nước với nồng độ 30g/m3. - Sản phẩm dịch chiết thô thồm lồm sử dụng liều ngâm 30 g/m 3, bổ sung vào 2 thời điểm (lần 1, bắt đầu công cường độc vi khuẩn với mật độ 105-106 cfu/ml và lần 2 cách lần 1 là 24 h) có hiệu quả nâng cao tỷ lệ sống 60% so với lô đối chứng dương 0%. Trong khi đó, phương pháp trộn dịch chiết thô vào thức ăn không có hiệu quả do tôm nuôi không ăn mồi.  Ở quy mô thực nghiệm - Sử dụng sản phẩm dịch chiết thô thồm lồm (25g/100kg tôm) trộn vào thức ăn cho tôm ăn liên tục trong 7 ngày có hiệu quả phòng bệnh trong trường hợp xuất hiện tác nhân (V. parahaemolyticus) gây bệnh AHPND ngay sau khi được ăn chế phẩm. Sử dụng chế phẩm cho tôm ăn trong 14 ngày hoặc ăn ngay thời điểm xuất hiện tác nhân gây bệnh AHPND (mật độ vi khuẩn cao 105-106cfu/mL) không có hiệu quả phòng trị bệnh. - Dịch chiết thô thồm lồm có khả năng diệt tác nhân gây bệnh AHPND trong môi trường nước tốt, tỷ lệ tôm sống đạt 74% khi sử dụng chế phẩm nồng độ 30g/m3, 64% khi sử dụng chế phẩm 25g/m3 và 0% khi không sử dụng chế phẩm. 5. Kiến nghị - Cần lựa chọn thêm thảo dược đưa vào thử nghiệm, nhằm bổ sung thêm loài thảo dược có hoạt tính kháng khuẩn cao. - Ứng dụng chế phẩm từ dịch chiết thô thảo dược thồm lồm vào mô hình ao nuôi ở thực địa bằng 2 phương thức bổ sung vào thức ăn để phòng bệnh và bổ sung vào nước khi xác định sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh trong nước nuôi. x THESIS ABSTRACT Master candidate: Pham Thi Huyen Thesis title: Research on effects of some herbs in prevention and treatment acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in brackish shrimps. Major: Veterinary medicine Code: 60.64.01.01 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture 1. Research Objectives: Identify effective herbs for the prevention and treatment of acute hepatic necrotizing hepatopancreas in cultured shrimp. 2. Materials Brackish Shrimp, acute hepatopancreatic necrosis disease bacteria and six kinds of herbs as follow: Sida alnifolia Lour, Cronton tonkinensis Gagnep, Curcuma domestica Lour, Polygonum sinense L, Ricinus communis L and Bidens pilosa L. 3. Research methods - Inspect the virulence genes of bacteria V. parahaemolyticus KC12.020 by molecular biology technique. - Test the effect of crude extract of herbs in vitro condition for acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimps. - Test the effectiveness of prevention and treatment of acute hepatic necrotizing hepatopancreas in shrimp by crude extract of herbs in laboratory conditions. - Experiment on effectiveness of prevention and treatment of acute hepatic necrotizing hepatopancreas in shrimp by crude extract of herbs in pilot scale. 4. Main findings and conclusions After finished the thesis. We had some main results and the conclusions as follow:  Invitro condition - The crude extracted of Ricinus communis L and Polygonum sinense L had antibacterial effects on V. parahaemolyticus KC12.020 causing AHPND on brackish shrimp. - The crude ethanol extracts from trunk anf leaf of Polygonum sinense L had antibacterial effects on V. parahaemolyticus causing AHPND with the inhibition zone diameter of 19.8-20.6 mm at the concentration of 66.7-200 μg/disc/ 20 μl.  In vivo condition - The crude extracted of Ricinus communis L and Polygonum sinense L had not anti-bacterial effects on V. parahaemolyticus KC12.020 causing AHPND on brackish xi shrimp when supplements to foods respectively (25-30 g/100 kg of shrimps and 35-40 g/100 kg of shrimps). - The crude extracts of Polygonum sinense L had anti-bacterial effects on V. parahaemolyticus causing AHPND when added to water at the concentration of 30 g/m3. - Using crude extracts of Polygonum sinense L added to water at the ratio of 30 3 g/m at 2 times (The first, the pathogenesis at the V. Parahaemolyticus bacteria density of 105-106 cfu/ml and the second, after 24h) the survival rate was 60% compared with the control group 0%, while the method of herbal supplements to foods as not effective because shrimps could not catch bait.  At the experimental scale - Using crude extracts of Polygonum sinense L (25-30 g/100 kg of shrimps ) added to food and feeding for shrimp for 7 days had anti-bacterial effects on V. parahaemolyticus causing AHPND after eating crude extracts product. Using crude extracts for feeding for 14 days or eating at the time of occurrence of AHPND (high bacterial density 105-106 cfu / mL) is not effective in preventing disease. - The crude extracts of Polygonum sinense L ability to kill the AHPND in water well, the survival rate of shrimp is 74% when using 30g / m3, 64% when using 25g / m3 and 0 % When did not use the crude extracts. 5. Reconmendation - Need to select other herbs to inspect and find more herbs which has high antibacterial activity. - Apply the crude extracts of Polygonum sinense L to the pond culture model by two methods supplement to food to prevent disease and add to water when known the presence of pathogenic bacteria in water. xii PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Nuôi trồng thủy sản (NTTS) là ngành công nghiệp phát triển nhanh nhất trên thế giới với tổng số khoảng 80 triệu tấn thủy sản được sản xuất hàng năm.“Tính đến năm 2015, tốc độ tăng trưởng trung bình hàng năm không ít hơn 7% năm và có thể có tiềm năng hơn nữa” (State One Stockbroking Ltd, 2007). Song như một quy luật tất yếu, khi hoạt động NTTS tăng nhanh cả về quy mô, hình thức và nuôi với mật độ cao thì nguy cơ và tỷ lệ bùng phát dịch bệnh lại càng cao. Các bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi sinh vật gây ra, đặc biệt bệnh do tác nhân virus và vi khuẩn là những nhân tố chính kìm hãm sự phát triển của nghề NTTS trên thế giới. Ở nước ta, NTTS đóng vai trò quan trọng đến sự phát triển kinh tế xã hội. Năm 2015 giá trị xuất khẩu từ NTTS mang lại 6,57 tỷ USD cùng với việc giải quyết công ăn việc làm cho hàng triệu người lao động. Tuy nhiên, thiệt hại được ước tính đến hàng triệu USD mỗi năm do sự bùng phát của dịch bệnh. Trong số đó, không loại trừ các bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi khuẩn và virus đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề NTTS ở Việt Nam. Đối với tôm bệnh Vibriosis, đặc biệt bệnh phát sáng ở giai đoạn ấu trùng do V. harveyi, V. parahaemolyticus và bệnh do virus (WSSV, YHV) đã xuất hiện và gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm từ những năm 1990 (Đỗ Thị Hòa và cs., 2004). Gần đây là hội chứng hoại tử gan tụy cấp (AHPND) mới xác định được tác nhân là do vi khuẩn chứa phage. Theo báo cáo tổng kết bệnh tôm của Tổng cục thủy sản, trong năm 2012 cả nước có khoảng 100,776ha diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại do dịch bệnh, bao gồm AHPND chiếm khoảng 46,093ha còn lại dịch bệnh đốm trắng, đầu vàng. Để ngăn ngừa dịch bệnh do vi sinh vật gây ra, nhiều loại kháng sinh đã được sử dụng trong NTTS. Tuy nhiên, việc sử dụng bừa bãi và thiếu hiểu biết về kháng sinh đã gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe động vật nuôi, môi trường sinh thái và đặc biệt là gây ra hiện tượng kháng thuốc tạo ra các chủng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh làm giảm hiệu quả trong điều trị bệnh và tăng nguy cơ nhiễm khuẩn có khả năng kháng thuốc cho động vật thủy sản và con người (Nguyễn Văn Kính và cs., 2010; Phan Thị Vân, 2005). Với những điểm bất lợi như vậy việc sử dụng vắc xin lại càng không phù hợp với quy mô NTTS nhỏ lẻ (small-scale) như ở Việt Nam. Theo đó, thuốc kháng sinh có nguồn gốc thảo 1 dược ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản đã và đang được quan tâm phát triển nhằm tạo sản phẩm thay thế thuốc kháng sinh, đồng thời tạo sản phẩm an toàn vệ sinh thực phẩm. Hơn nữa, thảo dược là những nguồn nguyên liệu phong phú, dễ tìm kiếm do có mặt tự nhiên ở rất nhiều nơi trên thế giới. Sở dĩ các chiết xuất thảo dược có các hoạt tính sinh học do trong thành phần cấu trúc của chúng có chứa nhiều loại hóa chất có nguồn gốc thực vật như phenolics, polyphenols, alkaloids, quinones, terpenoids, lectines, tannins, flavonoids, steroids, resins và polypeptides.Trong khi phenolics, polysaccharides, proteoflycans, alkaloids và saponins có vai trò quan trọng trong việc phòng và trị bệnh kháng khuẩn (Kolkovski, 2011; Velmurugan et al., 2012a) thì coumarin, phenols,quione, alkaloids và tanins lại có vai trò thiên về hoạt động kháng virus (Velmurugan et al., 2012a). Chính vì vậy, chiết xuất thảo dược đã được sử dụng như một nguồn thuốc cho con người và động vật từ bao lâu nay (Kolkovski, 2011) và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong NTTS trên thế giới, đặc biệt ở khu vực châu Á (Direkbusarakom, 2004; Citarasu, 2010). Do đó, chúng tôi triển khai thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu tác dụng của một số loại thảo dược trong phòng và trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm”. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định được loại thảo dược có hiệu quả phòng trị bệnh hoại tử gan tụy cấp ở tôm nuôi. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP Ở TÔM NUÔI 2.1.1. Trên thế giới Ở Trung Quốc AHPND xuất hiện đầu tiên vào năm 2009 nhưng chưa được người nuôi chú ý đến. Đến năm 2011 bệnh trở nên trầm trọng hơn ở những trang trại nuôi trên 5 năm và gần biển (Panakorn, 2012). Các trang trại nuôi tôm ở Hainan, Guangdong, Fujian và Guangxi bị thiệt hại trong 6 tháng đầu năm 2011 với khoảng 80%. Ở Malaysia, Hội chứng hoại tử gan tuỵ cấp tính được báo cáo đầu tiên vào cuối năm 2010 tại 2 bang Pahang và Joho sau đó lan rộng sang các vùng khác, làm giảm sản lượng tôm thẻ chân trắng từ 87.000 tấn trong năm 2010 xuống 67.000 tấn trong năm 2011. Sản lượng đến tháng 5/2012 chỉ còn 25.000 tấn. Gần đây, ở Thái Lan, bệnh xuất hiện ở 2 tỉnh phía đông vịnh Thái Lan. Bệnh được ghi nhận và gây thiệt hại nặng trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Bệnh hoại tử gan tuỵ cấp tính gây chết tôm sú và tôm thẻ chân trắng với tỷ lệ chết cao. Tôm có thể bị nhiễm bệnh trong suốt quá trình nuôi, tập trung nhiều ở giai đoạn 10-45 ngày thả nuôi (Flegel et al., 2012; Lightner, 2012; Lê Hữu Tài và cs., 2012; Lê Hồng Phước và cs., 2011; Prachumwat et al., 2012; Tổng cục thủy sản, 2012a; Loc et al., 2013a). Tôm bệnh có dấu hiệu giảm ăn. Dấu hiệu bệnh lý ở giai đoạn đầu thường không rõ hoặc biểu hiện sưng, nhũn hay nhạt màu gan tuỵ. Giai đoạn sau biểu hiện rõ bằng sự teo, dai gan tuỵ, màu sắc nhợt nhạt, dấu hiệu khác cũng được ghi nhận bao gồm mềm vỏ, sậm màu. Tỷ lệ tôm chết có thể lên đến 100% trong vài ngày hoặc kéo dài hơn. Theo Lightner (2012), quan sát trên tiêu bản mô học các mẫu tôm bệnh thu tại tỉnh Sóc Trăng cho thấy AHPND có một số đặc điểm như: (1)diễn biến của quá trình thoái hoá gan tuỵ cấp tính từ trong ra ngoài, (2) thiếu hoạt động phân bào đẳng nhiễm của tế bào có nguồn gốc từ mô phôi (tế bào E, Embyonalzellen), (3) rối loạn chức năng các tế bào trung tâm tổ chức gan tuỵ: Tế bào tiết: B (Basenzellen) cell, tế bào xơ: F (Fibrillenzellen) cell, tế bào dự trữ: R (Restzellen) cell, (4) dễ nhận diện các tế bào có nhân lớn bất thường và sự bong tróc tế bào, (5) giai đoạn cuối bao gồm sự tập hợp các tế bào máu ở khoảng gian giữa các ống gan và nhiễm khuẩn thứ cấp. Kết quả mô học tương tự được tìm thấy bởi Prachumwat et al., 3 (2012), khi nghiên cứu trên tôm thẻ chân trắng ở Thái Lan được thu từ hai tỉnh Chantaburi và Rayong vào cuối năm 2011 đầu năm 2012. Hình 2.1. Hiện tượng thoái hoá gan tuỵ cấp tính với mô gan tụy bị phá hủy Hình 2.2. Trường hợp bình thường với tế bào phân chia Nguồn: https://www.google.com.vn/ Nguồn: https://www.google.com.vn/ search?hl=vi search?hl=vi Hình 2.3. Trường hợp bất thường thiếu sự phân chia tế bào Hình 2.4. Trường hợp bình thường có sự hiện diện của tế bào B, F Nguồn: https://www.google.com.vn/ Nguồn: https://www.google.com.vn/ search?hl=vi search?hl=vi 4 Hình 2.5. Trường hợp bất thường không có sự hiện diện của tế bào B, F Hình 2.6. Tế bào có nhân lớn bất thường ở giai đoạn đầu của AHPND Nguồn: https://www.google.com.vn/ Nguồn: https://www.google.com.vn/ search?hl=vi&site=imghp&tbm search?hl=vi&site=imghp&tbm Hình 2.7. Nhiễm khuẩn thứ cấp ở giai đoạn sau Nguồn: https://tepbac.com/tin-tuc/full/2-tren-tom-nuoi-dien-bien-cu-the-qua-kinh-hien-vi6776.html Kết quả nghiên cứu trong năm 2010, 2011 chưa thấy bằng chứng của tác nhân hữu sinh gây bệnh. Giả thuyết nguyên nhân gây chết được nghi ngờ là do ảnh hưởng độc tố và nhiễm thứ phát vi khuẩn gây bệnh. Độc tố có thể đến từ tảo, từ thức ăn hoặc do vi sinh vật tiết ra. Dấu hiệu hoại tử gan cơ quan gan tuỵ tương tự cũng được ghi nhận khi tôm tiếp xúc với độc tố aflatoxin B1 và cũng có hiện tượng ức chế phân bào. 5 Theo Flegel (2012), nghiên cứu trên tôm bệnh thu từ các vùng khác nhau đã phát hiện vi khuẩn thuộc 2 giống Delftia và Ralstonia. Ngoài ra tác giả còn phát hiện sự hiện diện của bacteriophage trên mẫu tôm bị hội chứng gan tuỵ cấp tính. Tuy nhiên vẫn chưa có kết luận cuối cùng vì cần phải có kết quả từ các thí nghiệm kiểm chứng. Theo Othman (2012) nghiên cứu bệnh tại Malaysia cho rằng bệnh hoại tử gan tuỵ ở tôm có thể liên quan đến sự lột xác, sự thiếu hụt các khoáng chất trong ao nuôi và sự lạm dụng của hoá chất và chế phẩm vi sinh trong quá trình nuôi. Các nghiên cứu trước đây cho thấy các mầm bệnh vi khuẩn, virus gây chết tôm nuôi như WSSV (White Spot Syndrome Virus), YHV (Yellow Head Virus), IMNV (Infectious Myonecrosis Virus), TSV (Taura Syndrome Virus), HPV (Hepatopancreas Parvoirus), NHP (Necrotizing Hepatopancreatitis), MBV (Monodon Baculovirus), Vibrio sp.. Tuy nhiên, những mầm bệnh này đều không phải là tác nhân chính gây nên bệnh hoại tử gan tuỵ cấp tính trên tôm nuôi. Theo Lightner et al. (2013) bệnh hoại tử gan tụy cấp tính do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, vi khuẩn này đã bị nhiễm bởi một loại thể thực khuẩn (bacteriophage). Kết quả nghiên cứu định hướng bước đầu cho thấy chỉ có phương pháp gây nhiễm bằng cách ngâm hay nuôi chung tôm bệnh và tôm khỏe mới thấy được sự lây nhiễm của AHPND. Hơn nữa, chỉ có Vibrio parahaemolyticus được phân lập từ dạ dày của tôm bệnh khi gây bệnh thực nghiệm mới cho tỷ lệ chết và các dấu hiệu bệnh lý như AHPND xuất hiện ngoài tự nhiên. Từ hỗn hợp vi khuẩn được phân lập từ dạ dày của tôm bệnh AHPND nhóm tác giả này đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho kết quả với dấu hiệu đặc trưng của AHPND. Từ hỗn hợp này, ba chủng vi khuẩn riêng lẻ được phân lập và gây bệnh thực nghiệm trên tôm. Kết quả cho thấy 1 trong 3 chủng này là Vibrio parahaemolyticus gây tỷ lệ chết, các dấu hiệu lâm sàng trên gan tụy và các dấu hiệu biến đổi cấu trúc mô học giống như tôm bệnh ngoài tự nhiên. Cũng từ thí nghiệm này, nhóm tác giả đã tái phân lập V. parahaemolyticus từ dạ dày tôm được gây nhiễm để gây bệnh thực nghiệm cho kết quả biểu hiện đặc trưng của AHPND. Sử dụng V. parahaemolyticus từ nước của bể nuôi tôm được gây nhiễm với hỗn hợp vi khuẩn nêu trên gây bệnh lần nữa trên tôm cũng cho kết quả đặc trưng của AHPND. Một nghiệm thức nữa được bố trí bằng cách tăng sinh V. parahaemolyticus trong môi trường canh dinh dưỡng sau đó cho qua lọc 0,2 µm thu được dịch lọc đã loại bỏ vi khuẩn dùng cho thí nghiệm gây nhiễm cho thấy vẫn có khả năng gây AHPND trong điều kiện phòng thí nghiệm. Điều này chứng tỏ độc tố từ vi khuẩn tiết ra trong dịch lọc gây AHPND. 6 Bằng phương pháp nghiên cứu mô bệnh học cho thấy ở giai đoạn sớm của bệnh chỉ có gan tụy bị ảnh hưởng nhưng vi khuẩn phân lập từ gan tụy không có khả năng gây bệnh như ngoài tự nhiên. Nhóm tác giả này cho rằng dạ dày của tôm bệnh là nguồn chứa tác nhân gây bệnh (V. parahaemolyticus). 2.1.2. Ở Việt Nam Năm 2010, điều kiện thời tiết có sự biến đổi bất thường, trời nắng nóng kéo dài từ sau tết âm lịch đến tháng 06/2010, lượng mưa không đáng kể, nhiệt độ cao, độ mặn trong ao nuôi tôm cao. Sau đợt nắng nóng kéo dài và độ mặn tăng cao, hiện tượng tôm chết hàng loạt được ghi nhận ở tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu trên tôm sú, tôm thẻ chân trắng vào tháng 07/2010. Tôm chết với các biểu hiện bất thường chủ yếu trên gan tụy. Trong năm 2010, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã bố trí nhiều chuyến khảo sát và thu mẫu tôm bệnh vào tháng 07, 09 và 12 nhưng vẫn chưa đi đến kết luận nguyên nhân và tác nhân gây bệnh. Bệnh gây chết trên tôm nuôi chủ yếu ở giai đoạn 20-30 ngày sau khi thả nuôi. Tuy nhiên, trên thực tế vẫn có thể tìm thấy hội chứng này trên tôm lớn hơn kể cả đến 70 ngày tuổi. Dấu hiệu lâm sàng của tôm bệnh bao gồm hiện tượng teo và nhạt màu gan tuỵ kết hợp với hiện tượng mềm vỏ, thân tôm nhạt màu, tôm yếu và chết tập trung nhiều ở đáy ao. Đốm đen hoặc những tia mảnh màu đen thỉnh thoảng được tìm thấy ở gan tuỵ do hiện tượng melanin hoá của ống gan. Dùng 2 ngón tay ép sát gan thường không cho cảm giác có độ dai. Bằng phương pháp mô bệnh học phát hiện trên tôm với hội chứng hoại tử gan tuỵ cấp tính có hiện tượng hoại tử gan tuỵ nặng. Hình 2.8. Tôm sú bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính có gan tụy teo nhỏ Hình 2.9. Tôm sú bị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính có gan tụy nhạt màu so với bình thường Nguồn:https://www.google.com.vn/s=Tôm+sú+bệnh+hoại+tử+gan+tụy+cấp+tính 7