Tài liệu Nghiên cứu tác động của all trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu egf và jak stat của tế bào gốc ung thư dạ dày

.. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– MAI VĂN LINH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ DẠ DÀY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN – 2019. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– MAI VĂN LINH NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ DẠ DÀY Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 84 20 201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng THÁI NGUYÊN – 2019. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Mai Văn Linh ii LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu tại Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, em đã nhận được sự giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức của các thầy cô trong khoa, các phòng ban trong nhà trường. Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy giáo - TS. Nguyễn Phú Hùng, Thầy đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em học tập, tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Em xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học và bộ phận Đào tạo sau đại học - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và giúp đỡ trong suốt quá trình em học tập tại trường. Đề tài luận văn đã nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ, mã số B2017 - TNA - 48. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị lớp Cao học K11 đã luôn cổ vũ, động viên em hoàn thành tốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019 Tác giả Mai Văn Linh iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ vi MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 1.1. Tổng quan về ung thư và ung thư dạ dày ................................................... 3 1.1.1. Khái quát về ung thư và tế bào gốc ung thư ........................................... 3 1.1.2. Tổng quan về ung thư dạ dày .................................................................. 7 1.2. All-trans retinoic acid (ATRA) ................................................................. 13 1.2.1. Retinoids và all-trans retinoic acid (ATRA) ......................................... 13 1.2.2. Thụ thể của ATRA ................................................................................. 16 1.2.3. Retinoids trong điều trị.......................................................................... 17 1.3. Con đường tín hiệu EGF .......................................................................... 19 1.4. Con đường tín hiệu JAK/STAT ............................................................... 22 1.5. Khái quát về apoptosis ............................................................................. 25 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 26 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 26 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 27 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D .......................................... 27 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào 3D và xử lí tế bào với ATRA................. 27 2.3.3. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ................... 28 iv 2.3.4. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu EGF bằng Realtime PCR ................................................................................ 28 2.3.5. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu JAK/STAT bằng Realtime PCR ..................................................................... 29 2.3.6. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường apoptosis bằng Realtime PCR ......................................................................................... 30 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 31 3.1. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere ....... 31 3.1.1. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D .......................... 31 3.1.2. Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lí tumorsphere với ATRA ..... 31 3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số............................................................... 33 3.3. Tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu EGF ................................................................................................................. 34 3.3.1 ATRA ức chế sự biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và EGFR ......................................................................................................................... 34 3.3.2. Tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen CBL, EPS8, BCAR1, NCK2 và SHC1 ............................................................................................... 38 3.4. Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu JAK/STAT ...................................................................................................... 40 3.4.1. ATRA ức chế biểu hiện của các gen STAT1 và STAT3 ........................ 40 3.4.2. Ảnh hưởng của ATRA đến sự điều hòa biểu hiện của các gen GAB1, GAB2, SRC và PPP2CA ................................................................................. 41 3.5. Ảnh hưởng ATRA lên sự biểu hiện của các gen củ quá trình apoptosis . 43 3.5.1. ATRA tác động lên sự biểu hiện của các gen ức chế apoptosis ........... 44 3.5.2. ATRA ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen thúc đẩy apoptosis.. 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 48 1. Kết luận ....................................................................................................... 48 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ viết đầy đủ AML Acute myeloid leukemia ATRA All trans retinoic acid BMDCs Bone marrow derived Dendritic cells CSC Cancer stem cells EGF Epidermal growth factor EGFR Epidermal growth factor receptor ErbB Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog GSCs Gastric stem cells H. pylori Helicobacter pylori JAK Janus kinases RA Retinoic acid RAR Retinoic acid receptor RXR Retinoid X receptor STAT Signal transducer and activator of transcription (proteins) TNM Tumor – Node - Metastasis vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu EGF 29 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu JAK/STAT 29 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường apoptosis 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Ước tính số ca mắc mới ung thư năm 2018 6 Hình 1.2 Ước tính số lượng tử vong do ung thư năm 2018 6 Hình 1.3 Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren 9 Hình 1.4 Cấu tạo một tuyến dạ dày 11 Hình 1.5 Mô hình nhuộm Lgr5 trong mô ung thư dạ dày 12 Hình 1.6 Các thế hệ của retinoids 15 Hình 1.7 Sự chuyển hóa của Vitamin A trong cơ thể 15 Hình 1.8 Quá trình hoạt động của tín hiệu RA 16 Hình 1.9 Con đường tín hiệu của họ thụ thể EGFR 21 Hình 1.10 Con đường tín hiệu JAK/STAT 23 Hình 1.11 Một con đường JAK/STAT trong ung thư 24 Hình 3.1 Hình ảnh nuôi cấy tăng sinh tế bào sau 3 ngày nuôi cấy 31 Hình 3.2 Nuôi cấy tạo tumorsphere và xử lý với ATRA 32 Hình 3.3 Kết quả xác định hàm lượng RNA tổng số 34 Hình 3.4A Mức độ biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5, EGFR 35 Hình 3.4B Mức độ biểu hiện các gen EPS8, BCAR1, CBL, NCK2, SHC1 38 Hình 3.5A Mức độ biểu hiện các gen STAT3, STAT1 40 Hình 3.5B Mức độ biểu hiện các gen GAB1, SRC, GAB2, PPP2CA 42 Hình 3.6A Mức độ biểu hiện các gen ức chế apoptosis 44 Hình 3.6B Mức độ biểu hiện các gen thúc đẩy apoptosis 46 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ung thư dạ dày là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (http://gco.iarc.fr/), trong năm 2018 có 1.033.701 bệnh nhân ung thư dạ dày mới (chiếm 5,7%, trong tổng số các ca ung thư mới), 782.685 ca tử vong do ung thư dạ dày (chiếm 8,2%, trong tổng số các ca tử vong do ung thư). Ung thư dạ dày được thống kê là dạng ung thư phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 trong nhóm ung thư. Có 769.728 (74,5%) các ca ung thư dạ dày mới được phát hiện ở các nước châu Á. Tỉ lệ ung thư dạ dày cao nhất được thống kê là Hàn Quốc, Mông Cổ, Nhật Bản và Trung Quốc. Việt Nam xếp thứ 10 trong thống kê các nước có tỉ lệ ung thư dạ dày nhiều nhất thế giới với tỉ lệ 15,9 ca mắc ung thư dạ dày trong 100.000 dân số. Các tế bào gốc ung thư dạ dày là nguyên nhân gây ra các khối u dạ dày. Các tế bào gốc ung thư dạ dày, còn được gọi là các “tế bào khởi nguồn” của ung thư dạ dày, có nguồn gốc chủ yếu từ các tế bào gốc dạ dày hoặc các tế bào gốc định hướng dạ dày [4], [27]. Các tế bào gốc ung thư dạ dày cũng có thế có nguồn gốc từ các tế bào sinh dưỡng bị biến đổi [6]. Giống với các tế bào gốc thông thường, các tế bào gốc ung thư dạ dày cũng có chứa các marker sinh học đặc trưng như CD44, ALDH,… [4]. Đây là những chỉ thị phân tử quan trọng để xác định tế bào gốc ung thư dạ dày trong nghiên cứu và điều trị. All trans retinoic acid (ATRA) là một chất chuyển hóa từ vitamin A, thuộc nhóm retinoid, có tác dụng điều hoà sự tăng trưởng, biệt hóa và quá trình apoptosis của tế bào. ATRA được biết đến như một chất có khả năng ức chế tế bào gốc của nhiều dạng ung thư khác nhau [53]. Hiện nay, ATRA đã được sử dụng trong điều trị bệnh Lơ-xê-mi cấp dòng tủy (AML), cũng như sử dụng trong nhiều thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư. Tuy nhiên, ảnh hưởng 2 của ATRA lên tế bào gốc ung thư ở cấp độ phân tử vẫn chưa được hiểu rõ. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: ¨Nghiên cứu tác động của all trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày¨. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá tác động của ATRA lên sự phiên mã của các gen chính trong con đường tín hiệu phân tử EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày, cũng như ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen apoptosis. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nuôi cấy tế bào trong điều kiện 3D để hình thành nên các tumorsphere từ các tế bào gốc ung thư dạ dày. Nội dung 2: Phân tích tác động của ATRA lên sự hình thành và tăng trưởng của các tumorsphere. Nội dung 3: Phân tích sự biểu hiện của các gen trong con đường tín hiệu EGF bằng phương pháp Realtime PCR đối với các tế bào được xử lý hoặc không xử lý với ATRA. Nội dung 4: Phân tích ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen của con đường tín hiệu JAK/STAT bằng phương pháp Realtime PCR. Nội dung 5: Phân tích sự tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen apoptosis bằng phương pháp Realtime PCR. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về ung thư và ung thư dạ dày 1.1.1. Khái quát về ung thư và tế bào gốc ung thư 1.1.1.1. Lịch sử, khái niệm, phân loại ung thư Ung thư được miêu tả sớm nhất vào khoảng năm 1.600 TCN (thời Ai Cập cổ đại) trong các Edwin Smith Papy (một loại giấy cói ghi chép về văn bản y tế lâu đời nhất). Trong các Edwin Smith Papy có chứa mô tả về ung thư vú cũng như thủ thuật để loại bỏ các khối u vú. Hippocrates (khoảng năm 460 TCN- khoảng năm 370 TCN) đã mô tả một số loại ung thư, gọi chúng bằng thuật ngữ karkinos (carcinos) - tiếng Hy Lạp có nghĩa là ¨cua¨ hoặc ¨tôm càng¨, dựa trên đặc điểm quan sát được của khối u rắn. Celsus (khoảng năm 25 TCN - 50 SCN) đã dịch karkinos thành ¨cancer¨ - ung thư [1]. Hiện nay, khái niệm ung thư (cancer) được sử dụng để chỉ một nhóm bệnh liên quan đến sự phát triển bất thường của tế bào với khả năng xâm lấn hoặc lây lan (di căn) sang các bộ phận khác của cơ thể [34]. Các dấu hiệu của ung thư bao gồm: duy trì các tín hiệu tăng sinh, tránh khỏi sự ức chế sinh trưởng, chống lại quá trình chết của tế bào, nhân lên số lượng lớn tế bào, tăng cường hình thành mạch máu, xâm lấn và di căn, tái lập trình trao đổi chất và tránh sự phá hủy của hệ miễn dịch. Những thay đổi từ tế bào bình thường thành tế bào khối u chủ yếu do sự mất ổn định bộ gen, sự biểu hiện bất thường về chức năng của các gen ức chế khối u và gen gây ung thư [34]. Ung thư có thể xuất hiện ở tất cả các bộ phận khác nhau trong cơ thể. Ung thư được đặt tên theo cơ quan mà chúng bắt đầu và loại tế bào được tạo ra ngay cả khi chúng lây lan (di căn) sang các bộ phận khác của cơ thể. Hiện nay đã thống kê được hơn 100 loại ung thư ảnh hưởng đến con người [34]. Ngoài ra ung thư được phân loại theo loại mô, bao gồm: 4  Carcinomas: (ung thư biểu mô) là loại ung thư bắt nguồn từ da hoặc các mô lót hay phủ các cơ quan bên trong.  Sarcomas: (ung thư mô liên kết) là loại ung thư bắt nguồn từ xương, sụn, mỡ, cơ, mạch máu hay các mô liên kết khác.  Lymphomas và leukemias: hai loại ung thư này phát sinh từ các tế bào tạo máu và có xu hướng phát triển trong các hạch bạch huyết và máu.  Germ-cell tumor: là loại ung thư bắt nguồn từ các tế bào đa năng, thường gặp nhất là seminoma (ung thư tinh hoàn) và dysgerminoma (ung thư buồng trứng).  Blastoma: là loại ung thư có nguồn gốc từ các tế bào "tiền thân" (precursor) chưa trưởng thành hoặc phôi. Dạng ung thư này thường gặp ở trẻ nhỏ. Carcinomas (ung thư biểu mô) là loại ung thư thường gặp nhất. Ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư dạ dày là các bệnh ung thư có số lượng bệnh nhân mắc phải và tử vong nhiều nhất trong nhóm ung thư (WHO, 2018). Carcinomas và arcomas đa phần sẽ tạo thành các khối tế bào bất thường gọi là khối u (neoplasia), trong khi leukemias và lymphomas thường không tạo thành các khối u rắn. 1.1.1.2. Tế bào gốc ung thư Tế bào gốc (Stem cells) là đơn vị phát triển chức năng tái tạo các mô và cơ quan, đóng vai trò trong cân bằng nội môi và sửa chữa sau khi bị tổn thương. Các tế bào gốc nằm ở những vị trí đặc biệt bảo vệ chúng khỏi sự hoạt động quá mức [80]. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các khối u chứa các tế bào ung thư không đồng nhất về kiểu hình và chức năng [27]. Các khối u có thể bắt nguồn từ một quần thể nhỏ tế bào gốc ung thư (Cancer stem cell) có khả năng duy trì sự phát triển lâu dài của khối u, cũng như khả năng tái phát, kháng apoptosis, di căn, hóa trị và xạ trị [34]. 5 Tế bào gốc ung thư có các đặc điểm tương tự như các tế bào gốc thông thường bao gồm khả năng tự làm mới không giới hạn, tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng. Tế bào gốc ung thư chỉ chiếm một phần nhỏ, tồn tại ở một vùng trong khối u (CSCs occupy) và thường không hoạt động trong một thời gian dài. Các tế bào gốc ung thư có khả năng kháng lại các phương pháp điều trị ung thư thông thường như hóa trị và xạ trị vì chúng có khả năng kích hoạt các con đường liên quan đến sự phát triển, chống độc tế bào và tăng khả năng sửa chữa DNA. Hơn nữa, hóa trị và xạ trị còn có thể làm biến đổi các tế bào trong khối u, biến các tế bào không phải là tế bào gốc ung thư thành các tế bào gần giống như tế bào gốc ung thư. Các tế bào này có thể vẫn còn tồn tại sau khi điều trị hóa trị và xạ trị, chúng có thể là nguyên nhân tái phát khối u [11]. Sự tồn tại của tế bào gốc ung thư lần đầu tiên được Bonnet và Dick [10] chứng minh có ở bệnh Lơ-xê-mi cấp dòng tủy (AML) bằng cách sử dụng marker bề mặt tế bào CD34+/CD38-. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu đã cho thấy sự có mặt của tế bào gốc ung thư trong nhiều khối u rắn, trong đó có ung thư não, ung thư vú, ung thư đầu và cổ, ung thư thận, ung thư ruột kết, ung thư tuyến tụy, ung thư gan, khối u ác tính, ung thư phổi [11]. Những nghiên cứu in vivo gần đây đã chứng minh các khối u có nguồn gốc từ tế bào gốc ung thư. Hiện nay, các nghiên cứu đang hướng tới việc xác định các tế bào gốc ung thư bằng các marker sinh học, thông qua đó sử dụng các biện pháp điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư [34]. 1.1.1.3. Nguyên nhân gây ung thư và tình hình ung thư hiện nay Phần lớn các bệnh ung thư, khoảng 90% - 95% các trường hợp là do đột biến gen từ ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sống và lối sống, khoảng 5% - 10% còn lại là do yếu tố di truyền. Các yếu tố môi trường phổ biến gây tử vong do ung thư được thống kê bao gồm: thuốc lá (25%-30%), chế độ ăn 6 uống (30%-35%), nhiễm trùng (15%- 20%), phóng xạ (10%), stress, ít hoạt động và ô nhiễm [34]. Theo ước tính của WHO trong năm 2018, có 18.078.957 trường hợp mắc ung thư, trong đó có 7 loại ung thư phổ biến nhất (chiếm 54%), bao gồm: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư dạ dày, ung thư gan và ung thư thực quản (Hình 1.1). Hình 1.1. Ước tính số ca mắc mới ung thư năm 2018 (Nguồn WHO) Hình 1.2. Ước tính số lượng tử vong do ung thư năm 2018 (Nguồn WHO) 7 Ở các nước châu Á, trong năm 2018, ước tính có 8.750.932 trường hợp mắc mới ung thư và 5.477.064 ca tử vong do ung thư. Hơn 70% số lượng các các ca tử vong do ung thư tập trung ở các nước đang phát triển (Hình 1.2). 1.1.2. Tổng quan về ung thư dạ dày 1.1.2.1. Dịch tễ học của ung thư dạ dày Ung thư dạ dày (gastric cancer hay stomach cancer) là loại ung thư phát triển đầu tiên ở mô dạ dày và di căn sang các bộ phận khác của cơ thể. Tỉ lệ mắc ung thư dạ dày đang có xu hướng giảm ở cả hai giới trên phạm vi toàn cầu. Tuy nhiên, do sự già hóa dân số và sự gia tăng dăn số ở các nước đang phát triển nên số lượng ung thư dạ dày trên thế giới vẫn tiếp tục tăng [3]. Việt Nam có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày (tính trên 100.000 dân số) là 15,9 (đứng thứ 10 trên thế giới) với tỉ lệ mắc theo độ tuổi ở nam là 23,3 (đứng thứ 11 trên thế giới), ở nữ là 10,2 (đứng thứ 14 trên thế giới). Ung thư dạ dày là kết quả của các tác động phức tạp giữa vật chủ và các yếu tố môi trường, trong đó đáng chú ý nhất là nhiễm Helicobacter pylori (H. pylori). WHO xếp H. pylori vào tác nhân gây ung thư nhóm I. Ước tính H. pylori là nguyên nhân của khoảng 63% các trường hợp ung thư dạ dày không thuộc tâm vị trên toàn thế giới. Một số yếu tố đáng chú ý khác như chế độ ăn uống và hút thuốc lá cũng ảnh hưởng tới nguy cơ mắc ung thư dạ dày. Hoocmon nội tiết tố nữ (estrogen) là một yếu tố làm giảm nguy cơ mắc ung thư dạ dày ở nữ giới, tỉ lệ mắc mới ung thư dạ dày ở phụ nữ thấp hơn nhiều so với ở nam giới [3]. 1.1.2.2. Phân loại ung thư dạ dày và điều trị Tùy thuộc vào chỉ tiêu phân loại mà ung thư dạ dày có thể được chia thành nhiều loại khác nhau. Một số hệ thống phân loại đáng chú ý như hệ thống phân loại theo vị trí (ung thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị), phân loại 4 type của Borrmann [81] và Hiệp hội Ung thư Dạ dày Nhật Bản 8 [47], phân loại vi thể [56], phân loại theo mô bệnh học của Lauren [56] hay hệ thông phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Tổ chức Y tế Thế giới [31]. Hiện nay, ung thư dạ dày có xu hướng được chia làm 2 loại là ung thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị. Ung thư tâm vị là ung thư trong khoảng 1cm trên đến 2 cm dưới đường nối thực quản dạ dày. Ung thư dạ dày không thuộc tâm vị gồm ung thư ở phình vị, thân vị, bờ cong lớn, bờ cong nhỏ, hang vị và môn vị. Có sự khác nhau rất rõ trong dịch tễ, nguyên nhân gây bệnh, mô bệnh học, điều trị và tiên lượng giữa ung thư dạ dày tâm vị và ung thư dạ dày không thuộc tâm vị [61]. Ung thư dạ dày không thuộc tâm vị thường gặp hơn ở những khu vực có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày cao, ung thư tâm vị thường gặp ở khu vực có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày thấp. Ung thư tâm vị đã tăng đáng kể trong vòng 50 năm qua ở các nước phát triển và cả một số nước điều kiện kinh tế phát triển. Ung thư tâm vị thường là hậu quả của trào ngược dạ dày thực quản mạn tính, trong khi đó ung thư dạ dày không thuộc tâm vị có liên quan chặt chẽ tới tình trạng nhiễm H. pylori mãn tính. Tiên lượng ung thư tâm vị thường xấu hơn ung thư dạ dày không thuộc tâm vị [61]. Lauren phân loại ung thư dạ dày thành 2 thể mô bệnh học riêng biệt là thể ruột (intestinal type) và thể lan tỏa (diffuse type) (Hình 1.3) [56]. Thể ruột gồm những tế bào u kết dính tạo ra cấu trúc ống tuyến tương tự như tuyến ruột, đi kèm với thâm nhập tế bào viêm lan tỏa. U này thường xuất phát từ phần xa dạ dày cùng với nhiễm H. pylori, có đặc điểm teo niêm mạc dạ dày diện rộng, dị sản ruột và thường được đi trước bằng một giai đoạn tiền ung thư. Thể lan tỏa gồm những mảng tế bào rải rác trong mô đệm, không tạo tuyến, không có tính kết dính. Ung thư thể lan tỏa có thể gồm các tế bào hình nhẫn, lan rộng theo lớp dưới niêm mạc, ít thâm nhập tế bào viêm, thường có mức độ biệt hóa kém. Có xấp xỉ 5-10% các khối u vẫn không thể phân loại 9 được xếp vào thể “không xác định” hoặc có đặc điểm của cả hai thể ruột và lan tỏa được xếp vào thể “hỗn hợp” (mixed type). Trong đánh giá bệnh học lâm sàng, các khối u thể này thường được xem như là thể lan tỏa [56]. Phân loại mô bệnh học của Lauren khá đơn giản và được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Hai thể mô học này có sự khác nhau rõ rệt về dịch tễ, nguyên nhân gây bệnh và đặc biệt là tiên lượng. Sự khác nhau về hình thái được cho là do vai trò của các phân tử kết dính liên bào, các phân tử này được bảo toàn ở thể ruột và khiếm khuyết ở thể lan tỏa [56]. A. Intestinal type B. Diffuse type C. Mixed type Hình 1.3. Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren [56] Để đánh giá giai đoạn của ung thư dạ dày, có hai hệ thống đánh giá được sử dụng rộng rãi là hệ thống đánh giá của AJCC/UICC [87] và hệ thống đánh giá của Nhật Bản [47]. Cả hai hệ thống này đều đánh giá giai đoạn của ung thư dạ dày dựa trên đánh giá mức độ xâm lấn của khối u (Tumor), tình trạng di căn vùng hạch (Node) và di căn xa (Metastasis) nên còn được gọi là cách đánh giá giai đoạn TNM (Khối u - Hạch - Di căn). Khối u (Tumor) được đánh giá dựa vào độ xâm nhập sâu của khối u, giai đoạn hạch bạch huyết (Node) được đánh giá dựa trên số lượng bạch huyết vùng bị di căn. Phẫu thuật cắt bỏ là phương pháp điều trị chính và có thể chữa khỏi cho bệnh nhân bị ung thư dạ dày ở giai đoạn đầu. Tuy nhiên, tỉ lệ sống sót của bệnh nhân vẫn còn thấp. Phương pháp xạ trị sử dụng trong điều trị ung thư dạ dày đem lại hiệu quả thấp [56] do tính kháng xạ trị của các tế bào ung thư dạ 10 dày. Hóa trị liệu là phương pháp điều trị quan trọng nhằm giảm tỉ lệ tái phát sau phẫu thuật và kéo dài thời gian sống thêm của bệnh nhân. Thời gian sống thêm của bệnh nhân sử dụng hóa trị có thể kéo dài thêm 9-36 tháng. Độc tính cao, thời gian đáp ứng ngắn, tỷ lệ đáp ứng thấp là những hạn chế của hóa trị liệu [70]. Điều trị nhắm đích là phương pháp mới, sử dụng các loại thuốc điều trị có tác dụng chọn lọc lên tế bào gốc ung thư ở mức độ phân tử mà không hoặc ít làm ảnh hưởng đến các tế bào bình thường, đang được nghiên cứu và thử nghiệm trong điều trị ung thư dạ dày [70]. 1.1.2.3. Tế bào gốc ung thư dạ dày Tế bào gốc dạ dày (Gastric stem cells) là các tế bào gốc ở dạ dày, được tìm thấy ở vùng eo của tuyến dạ dày, gồm nhiều loại tế bào gốc khác nhau (Hình 1.4). Tế bào gốc dạ dày được bao quanh bởi một lớp myofibroblasts (SMFs) hoạt động như một hốc chứa và tiết ra các yếu tố tăng trưởng và biệt hóa khác nhau. Tế bào gốc dạ dày giữ vai trò thiết yếu trong việc tự làm mới và căn bằng nội môi của tuyến dạ dày; chúng giữ vai trò đặc biệt quan trọng trong việc sửa chữa biểu mô dạ dày sau chấn thương. Các tế bào gốc tủy xương (BMDCs) có vai trò quan trọng trong sự tái tạo, phục hồi lại các phần niêm mạc bị tổn thương do H. pylori. Quá trình tự tái tạo và biệt hóa ở niêm mạc dạ dày được điều chỉnh bởi một số con đường tín hiệu như Wnt, Notch, Hedgekey và yếu tố phiên mã liên quan đến Runt 3 (Runx3) [40]. Tế bào gốc ung thư dạ dày được Yang và cộng sự mô tả lần đầu tiền vào năm 2007 [92]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ung thư dạ dày có thể bắt nguồn từ tế bào gốc dạ dày bình thường hoặc các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương [6], [40]. McDonand và cộng sự đã đưa ra bằng chứng về quá trình loạn sản ở các đơn vị dạ dày do sự biến chất đường ruột và nhận thấy rằng chứng loạn sản đường ruột là vô tính, chứa nhiều tế bào gốc và lây lan qua sự phân hạch [62]. Tuy nhiên, Barker và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu truy tìm nguồn gốc của tế bào gốc gây ra ung thư dạ dày [6]. Trong thí nghiệm, 11 Barker đã nhận thấy các tế bào gốc môn vị Lgr5+ có khả năng gây khối u khi bị tác động [6]. Simon và cộng sự tiếp tục kiểm tra mức độ phổ biến, phân bố và ý nghĩa sinh học khối u của các tế bào Lgr5 trong dạ dày bằng cách nghiên cứu biểu hiện khác biệt của Lgr5 ở mức độ phiên mã và dịch mã [79]. Nghiên cứu đã chỉ ra các mô ác tính có sự biểu hiện Lgr5+ cao hơn các mô không ác tính và có sự di chuyển của các tế bào Lgr5+ ở các giai đoạn khác nhau của ung thư dạ dày. Nghiên cứu cũng chỉ ra ở trong niêm mạc dạ dày bình thường các tế bào Lgr5+ nằm chủ yếu ở vùng cổ niêm mạc, trong khi ở ung thư dạ dày các tế bào Lgr5+ xuất hiện ở vùng eo, trung tâm khối u và mặt trước xâm lấn (Hình 1.5). Các bệnh nhân dương tính với Lgr5+ cũng có tỉ lệ sống trung bình ngắn hơn các bệnh nhân âm tính với Lgr5+ [79]. Các tế bào gốc ung thư dạ dày ngoài nguồn gốc từ tế bào gốc dạ dày [6] còn có thể có nguồn gốc từ các tế bào gốc tủy xương [85]. Sự viêm nhiễm, tổn thương mãn tính biểu mô dạ dày do H. pylori dẫn đến mất tế bào gốc dạ dày thường trú và gây ra sự tái lập tế bào gốc tủy xương trong dạ dày, sau đó là tăng sản, biến chất, loạn sản và cuối cùng là tăng sản ung thư dạ dày [85]. Hình 1.4. Cấu tạo tuyến dạ dày (Nguồn: Giải phẫu học - Nguyễn Quang Quyền) 12 Hình 1.5. Mô hình nhuộm Lgr5 trong mô ung thư dạ dày [79] (A, E) Niêm mạc dạ dày bình thường (B, F) Mô dạ dày dị sản ruột (C, G) Ung thư dạ dày trước xâm lấn Tế bào gốc ung thư dạ dày được xác định chủ yếu nhờ các marker bề mặt tế bào. Việc sử dụng các marker bề mặt thuận lợi hơn so với sử dụng các yếu tố nội sinh trong việc xác định tế bào cũng như nhắm đích trong nghiên cứu điều trị ung thư dạ dày. Hiện nay, các nghiên cứu sử dụng liệu pháp điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư dạ dày đang được nghiên cứu và phát triển. Trong nhiều năm qua, các liệu pháp thông thường như hóa trị, xạ trị và miễn dịch đã được sử dụng trong điều trị ung thư dạ dày. Tuy nhiên, các phương pháp này chỉ tiêu diệt được các tế bào khối u đã biệt hóa, do đó, sau một thời gian các khối u lại tái phát do hoạt động của các tế bào gốc ung thư dạ dày. Ở