Tài liệu Nghiên cứu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐẶNG THANH PHONG NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CƠ QUAN LYMPHO CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus TỪ 1 ĐẾN 30 NGÀY TUỔI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN ĐẶNG THANH PHONG NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CƠ QUAN LYMPHO CỦA CÁ TRA Pangasianodon hypophthalmus TỪ 1 ĐẾN 30 NGÀY TUỔI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TỪ THANH DUNG 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Từ Thanh Dung đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn và đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô khoa Thủy Sản trường Đại Học Cần Thơ đã tạo môi trường tốt trong học tập, trao dồi đạo đức, truyền đạt kiến thức và nhiều kinh nghiệm thực tế trong suốt quá trình rèn luyện ở nhà trường. Tác giả xin chân thành cảm ơn gia đình Bác 2 Nắm (Hồng Mỹ) – Thị Trấn Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp đã giúp đỡ tôi chỗ ăn, ở, phương tiện và điều kiện nghiên cứu thuận tiện trong suốt thời gian thu mẫu ở địa phương thuộc thị trấn Hồng Ngự. Xin gởi lời cảm tạ đến anh Huỳnh Chí Thanh khuyến ngư huyện Hồng Ngự, tất cả các bạn lớp Bệnh học thủy sản K.31 và cùng các anh em P2C12, ký túc xá trường Đại Học Cần Thơ đã quan tâm, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là đối tượng nuôi quan trọng ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Tuy nhiên các thông tin khoa học về hệ miễn dịch chưa có tác giả nào công bố để làm cơ sở cho việc phòng bệnh cho cá. Việc nghiên cứu đề tài này nhằm mục tiêu là tìm hiểu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra Pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi sau khi nở. Thu mẫu cá từ 1 đến 30 ngày tuổi trực tiếp ở ao ương, mỗi ngày tuổi thu từ 6 – 30 con cá. Bên cạnh đó, cũng theo dõi quá trình hoạt động của cá, các chế độ quản lý và chăm sóc ao, hàng tuần kiểm tra các yếu tố môi trường và nhiệt độ đo mỗi ngày. Nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp mô học (Haematoxylin & Eosin) trên cơ quan lympho thận,tuyến ức và tỳ tạng. Kết quả nghiên cứu được tìm thấy thận xuất hiện đầu tiên ở cá 6 ngày tuổi sau khi nở; tuyến ức được quan sát ở cá 9 ngày tuổi và cuối cùng là tỳ tạng được tìm thấy ở cá 21 ngày tuổi. Trong suốt thời gian ương nuôi thì các yếu tố môi trường đều nằm trong khoảng cho phép và thích hợp cá phát triển. Kết quả này góp phần làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu hệ thống miễn dịch trên cá tra nhằm tìm ra giải pháp phòng các bệnh truyền nhiễm một cách tích cực và có hiệu quả hơn.. ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................... TÓM TẮT........................................................................................................... MỤC LỤC ......................................................................................................... DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................... Chương I: GIỚI THIỆU .................................................................................. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ Nội dung nghiên cứu........................................................................................ Chương II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................ 2.1 Sơ lược đặc điểm về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) .................. 2.2 Lịch sử tiến hóa của các cơ quan lymphoid.............................................. 2.3 Sự tiến hoá và phát triển của tế bào lympho.............................................. 2.4 Các cơ quan lymphoid ............................................................................... 2.4.1 Tỳ tạng (spleen)................................................................................... 2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức) .................................................................. 2.4.3 Thận (kidney) ....................................................................................... 2.5 Sự hình thành cơ quan lymphoid ............................................................... i ii iii iv 1 2 2 3 3 3 4 5 5 6 7 7 2.6 Một số thành tựu về phương pháp mô học ............................................. Chương III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 3.2 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 3.2.1 Dụng cụ .............................................................................................. 3.2.2 Hoá chất ............................................................................................. 3.3 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 3.3.2 Phương pháp cắt mẫu ......................................................................... 3.3.3 Phương pháp cố định mẫu.................................................................. 3.3.4 Phương pháp làm tiêu bản mô ........................................................... 3.4 Đọc kết quả .............................................................................................. Chương IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 4.1 Thông tin chung về hộ nuôi ..................................................................... 4.2 Các chỉ tiêu môi trường trong ao ương .................................................... 4.3 Sự phát triển của các cơ quan Lympho.................................................... 10 13 13 13 13 13 13 13 13 14 14 17 18 18 19 20 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 4.3.1 Thận................................................................................................... 4.3.2 Tuyến ức (thymus) ............................................................................. 4.3.3 Tỳ tạng ............................................................................................... Chương V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................ 5.1 Kết luận ................................................................................................. 5.2 Đề xuất .................................................................................................. TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. PHỤ LỤC I ....................................................................................................... PHỤ LỤC II...................................................................................................... PHỤ LỤC III .................................................................................................... iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 20 24 26 28 28 28 29 32 33 34 DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1 Khối paraffin trước khi cắt ............................................................... 16 Hình 3.2 Vị trí của tuyến ức ............................................................................. 18 Hình 4.1 Công tác cải tạo ao và các giai đoạn của cá hương ........................... 19 Hình 4.2 Thận của cá tra qua các giai đoạn...................................................... 22 Hình 4.3 Cấu trúc của thận qua các giai đoạn của cá ....................................... 23 Hình 4.4 Tuyến ức cá của tra qua các giai đoạn............................................... 25 Hình 4.5 Cấu trúc tỳ tạng cá 21 ngày tuổi ........................................................ 28 v PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Ngành nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) Việt Nam (VN) nói chung và Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) nói riêng đã và đang phát triển mạnh mẽ. Trong đó, đối tượng nuôi nước ngọt được nuôi nhiều nhất là cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), không chỉ cung cấp thực phẩm trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (NN&PTNT), năm 2008 lượng cá tra xuất khẩu của VN đạt 657.000 tấn, đạt kim ngạch 1,48 tỉ USD, chiếm đến 32,1% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước. Cá tra, ba sa là điểm sáng của bức tranh xuất khẩu thủy sản Việt Nam (htt://antg.cand.com.vn). Nhưng trong quá trình mở rộng diện tích nuôi do thiếu sự quy hoạch và không đồng bộ đã kéo theo nhiều vấn đề xảy ra đặc biệt là tình hình dịch bệnh. Ở cá nuôi, nhiều loại bệnh truyền nhiễm xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá tra. Điển hình, bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra đã làm thiệt hại lớn cho người nuôi ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, tỷ lệ cá chết khi bị bệnh này có thể lên đến 90% (http://www.anova.com.vn). Theo nghiên cứu của Ferguson et al., 2001 và Dung et al., 2004 cho rằng đây là loài vi khuẩn đặc thù gây bệnh chủ yếu trên cá da trơn nuôi công nghiệp, còn theo Mitchell (1997) xác định E. ictaluri là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu (Enteric septicaemia of catfish: ESC) ở cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus), gây hao hụt trên 60% và hằng năm thiệt hại trên 50 triệu USD. Việc dùng kháng sinh trị bệnh mang lại hiệu quả khi dùng thuốc đúng liều và chẩn đoán đúng tác nhân gây bệnh, nhưng trong thực tế do người nuôi sử dụng bừa bãi, không đúng liều lượng cũng như loại kháng sinh nên gây ra hiện trạng kháng thuốc và tình hình dịch bệnh trở nên trầm trọng hơn (Dung và ctv, 2008). Do đó, việc phòng bệnh như quản lý tốt môi trường nuôi, giống tốt, chế độ dinh dưỡng hợp lý…, và đặc biệt hơn là việc nghiên cứu hệ miễn dịch. Đây cũng là biện pháp phòng bệnh hữu hiệu nhất. Việc nghiên cứu có hiệu quả hay không phụ thuộc vào sự sản xuất các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch và độ tuổi của cá. Ở cá xương, các tế bào lympho (tế bào B, T) tạo ra các kháng thể (IgM, IgH,…) tham gia vào hệ thống đáp ứng miễn dịch được sản xuất ra từ những cơ quan lympho như thymus, tỳ tạng, thận trước (Nadia et al., 2002; Magnadottir et al ., 2005). Theo Merete et al., 1998, cho rằng các cơ quan lympho ở cá phát triển hoàn chỉnh sau khi cá hoàn thành quá trình biến thái. Các cơ quan lymphoid như thận trước, thymus và tỳ tạng phát triển trong suốt 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ở giai đoạn ấu trùng (Padros et al., 1996) và sự hình thành cơ quan lympho của các loài cá nước ngọt sớm hơn so với các loài cá nước mặn (Doggett et al., 1987; Chantanachookhin et al., 1991). Mãi đến năm 2001, Lora et al ., đã nghiên cứu sự hình thành cơ quan lymphoid của cá nheo Mỹ cho thấy các tế bào có chức năng miễn dịch ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus xuất hiện lúc nở, còn tỳ tạng là 3 ngày sau khi nở. Gần đây, Sonal et al., 2008 nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus hippoglossus L.) cũng cho kết quả là thận xuất hiện ở cá 1 ngày tuổi, nhưng cơ quan thymus là 33 ngày tuổi và tỳ tạng là 49 ngày tuổi. Cho đến nay, vẫn chưa có tác giả nào công bố những nghiên cứu về sự phát triển cơ quan lymphoid ở cá tra. Vì thế, đề tài “Nghiên cứu sự phát triển cơ quan lymphoid ở giai đoạn giống của cá tra Pangasianodon hypophthalmus” được thực hiện nhằm mục tiêu: Tìm hiểu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra từ 1 đến 30 ngày tuổi từ đó làm cơ sở khoa học để nghiên cứu sự hình thành hệ miễn dịch góp phần vào việc sử dụng hệ miễn dịch có hiệu quả hơn trong phòng bệnh cho cá. Nội dung nghiên cứu - Theo dõi, thu mẫu và ghi nhận sự phát triển và thay đổi về hình thái của cá tra từ 1 đến 30 ngày tuổi ở Thị Trấn Hồng Ngự, tỉnh Đồng Tháp. - Xác định sự phát triển cơ quan lympho của cá tra bằng phương pháp nhuộm mô học (Haematoxylin & Eosin) 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược đặc điểm về cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Cá tra phân bố nhiều ở lưu vực sông Mê Kông ở cả 4 nước Lào, Campuchia, Việt Nam và Thái Lan. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa có cá sinh sản nhân tạo, cá bột được vớt trên sông Tiền và sông Hậu. Khảo sát chu kỳ di cư của cá tra ở địa phận Campuchia cho thấy cá ngược dòng từ tháng 10 đến tháng 5 và di cư vào hạ lưu tháng 5 đến tháng 9 hàng năm (Phạm Văn Khánh, 2006). Cá tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước nhạt lợ (nồng độ muối từ 0,7 đến 1%), có thể chịu đựng được nước phèn có 0 0 pH >5, dễ chết ở nhiệt độ 15 C nhưng chịu nóng tới 39 C (Phạm Văn Khánh, 1996). Cá tra khi hết noãn hoàng thích ăn mồi tươi sống, chúng có thể ăn lẫn nhau. Dạ dày to và ngắn là đặc điểm của cá có tập tính ăn tạp nhưng thiêng về động vật. Khi cá lớn, trong điều kiện thiếu thức ăn cá bắt buộc ăn thức ăn khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật. Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, cá còn nhỏ tăng nhanh về chiều dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng đã đạt chiều dài từ 10-12 cm (trọng lượng 14-15 g). Cá khi lớn đạt cỡ 2,5 kg trở lên, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với chiều dài cơ thể. Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm (trích dẫn từ Trần Thanh Xuân, 1994). 2.2 Lịch sử tiến hóa của cơ quan lymphoid Vài ngàn năm trở về trước đây cơ quan lymphoid đã được các nhà giải phẩu học khám phá. Bước ngoặc khám phá đầu tiên là tỳ tạng tìm thấy trong Edwin Smith Papyrus, từ khoa y ở nước Ai Cập; thymus được mô tả đầu tiên bởi the Italian Jacopo Berengario da Carpi vào thế kỷ 15; và hệ bạch huyết được phát hiện bởi Dane Thomas Bartholin và the Swede Olaus Rudbeck vào th ế kỷ 17. Nhưng giải thích chức năng của các cơ quan lymphoid trong hệ thống miễn dịch chỉ mới nghiên cứu gần đây và thymus được công nhận là cơ quan quan trọng trong hệ miễn dịch cho đến nay (trích dẫn từ George Iwama, 1996). Ở lớp chim, tế bào B được sinh ra ở cơ quan lymphoid sơ cấp là túi Fabricius (là nơi tạo ra các tế bào biểu mô của ruột sau); sự hình thành tế bào B cũng có liên quan đến tổ chức lymphoid sơ cấp ở ruột của động vật có vú và đặc biệt là ở nhóm động vật nhai lại (như cừu, thỏ và bò). Ngược lại, những cơ quan thứ cấp (và tam cấp) hoặc những cơ quan lymphoid ngoại biên như hạch lympho, 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com cơ bản là không cần thiết trong miễn dịch. Trong khi đó, ở nhóm cá xương nói chung cơ quan lymphoid sơ cấp gồm có tuỷ xương và thymus (tuyến ức), cơ quan lymphoid thứ cấp gồm có tỳ tạng và một tổ chức lymphoid có liên quan đến ruột và hệ thống màng nhầy. Bên cạnh đó thì ở động vật hữu nhũ, cơ quan thymus là nơi tế bào T phát triển, trong khi đó tế bào B được sinh ra ở tuỷ xương. Những cơ quan Lymphoid chẳng hạn như thymus, tỳ tạng và những bạch huyết ở đốt mắt là trung tâm cấu thành hệ thống miễn dịch ở động vật hữu nhũ (George Iwama, 1996). Cơ quan lymphoid nguyên thuỷ (cũng được gọi là cơ quan lymphoid trung tâm), như thymus và tuỷ xương ở hầu hết các động vật hữu nhũ, phụ thuộc vào sự phát triển và sinh sôi của những tế bào lympho sơ cấp. Vì vậy nó giữ 1 chức năng khá quan trọng trong hệ miễn dịch. Cơ quan Lymphoid quan trọng trong điều chỉnh của sự phát triển tế bào lympho và những đáp ứng miễn dịch. Trong suốt quá trình tiến hóa của động vật có xương sống, những cơ quan lymphoid sơ cấp xuất hiện sớm hơn những cơ quan lymphoid thứ cấp (George Iwama, 1996). Từ vài điểm tiến hoá trên cho thấy, những cơ quan lymphoid sơ cấp có tầm quan trọng đặc biệt vì nó có liên quan đến việc tạo ra các thụ thể của kháng nguyên thông qua các tế bào lympho. 2.3 Sự tiến hoá và phát triển của tế bào lympho Ở tất cả các động vật có xương sống, các thụ thể kháng nguyên được sản xuất từ các tế bào lympho. Tất cả các tế bào tạo máu, tế bào lympho bắt nguồn từ chính cơ quan tạo máu của tế bào tuỷ xương. Ở chuột, tế bào B bắt đầu phát triển trong bào thai sống (xuyên suốt sự phát sinh phôi) hoặc ở tuỷ xương (thời kỳ sau khi sinh) và thành thục trong tỳ tạng. Trái lại, tế bào T chỉ phát triển ở thymus. Hầu hết những sinh vật đại diện tổ tiên thuộc động vật có xương sống có thể nhận biết rõ ràng tế bào T và tế bào B ở cá sụn như cá mập và cá đuối. Ở cá, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan, sau đó đến thận và cuối cùng là tỳ tạng. Ở cá xương như cá chép và cá ngựa, thận trước là vị trí chiếm lĩnh của tế bào B. Ở động vật lưỡng thê và bò sát, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan và tỳ tạng, sau đó thì gián đoạn ở gan nhưng ở tỳ tạng vẫn được duy trì và cuối cùng nó xuất hiện ở tuỷ xương. Ở chim, tế bào B phát triển trong túi của Fabricius (là nơi tạo ra các tế bào biểu mô của ruột sau). Và ở động vật hữu nhũ, tế bào B phát triển chủ yếu ở tuỷ xương. Tuy nhiên, ở 1 vài loài động vật hữu nhũ, như thỏ và bò, tổ chức lymphoid ở ruột là nơi quan trọng để tạo ra các tế bào B nguyên thuỷ. Vì vậy, có thể cho rằng tế bào B có thể được sinh ra ở nhiều vị 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com trí khác nhau của động vật xương sống có hàm. Trái ngược lại, tế bào T chỉ phát triển ở một số vị trí nhất định (Trích dẫn từ Thomas et al., 2007). 2.4 Các cơ quan lymphoid 2.4.1 Tỳ tạng (Spleen) Tỳ tạng của cá da trơn là một cơ quan lymphoid thuộc vùng ruột được bao quanh bằng màng treo ruột. Nó có màu đỏ thẩm, hình thoi dài hoặc hình trứng có bề mặt phẳng. Nó được bao bọc bởi 1 lớp biểu bì và lớp mô liên kết. Nhiều tế bào nằm ở dưới mô liên kết. Thành phần chính của tỳ tạng gồm dạng thể bầu dục, phần tủy trắng, phần tủy đỏ và trung tâm đại thực bào. Thận của cá chưa trưởng thành không có phần cơ mở rộng đến nhu mô như ở trường hợp của cá trưởng thành. Mặc dù ở tỳ tạng của cá trưởng thành có phần cơ mở rộng đến nhu mô nhưng không rõ ràng như ở động vật hữu nhủ. Tủy trắng và tủy đỏ của cá bột không tách ra riêng biệt như ở cá trưởng thành. Phần tủy đỏ bao gồm nhiều tế bào máu hình sine với những hồng cầu trưởng thành, một số nguyên hồng cầu, đại thực bào, những tế bào lưới và trung tâm đại thực bào sắc tố (melanin). Những sợi mạng lưới được tìm thấy ở vách dạng đường sine, được sắp xếp ở dạng vòng bao quanh vi thể tỳ tạng. Phần tủy trắng có nhiều tế bào bạch cầu kiềm tính hơn phần tủy đỏ, ngoài ra ở tủy trắng còn có tế bào lympho, ít tế bào hồng cầu, đại thực bào và một số trung tâm đại thực bào. Những tế bào hồng cầu chưa trưởng thành hoặc trưởng thành, đại thực bào, với một số ít tế bào hồng cầu trong tế bào chất đã được tìm thấy ở tỳ tạng, bắt màu đậm với dung dịch Wright và Giemsa. Nhìn chung ở tỳ tạng có nhiều đại thực bào hơn ở tiền thận, đều này cho thấy tỳ tạng là cơ quan chính loại bỏ những tế bào hồng cầu già và tạo ra nhiều tế bào mới (Trích dẫn từ Supranee et al., 1991). Theo Nguyễn Quốc Thịnh, 2002 ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỳ tạng có màu đỏ thẩm, dạng dẹp, vị trí của tỳ tạng nằm ở màng treo ruột. Chức năng của tỳ tạng là tiêu hủy những tế bào hồng cầu già, tái hấp thu sắt, Hemoglobin và các thành phần cấu tạo hồng cầu khác để sản xuất hồng cầu mới. Ngoài ra tỳ tạng còn có nhiệm vụ sản xuất ra các loại tế bào limpho giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh. 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức) Thymus là 1 đôi cơ quan được tìm thấy giữa lớp biểu bì và vỏ ở rìa trên của nắp mang thuộc hốc mang cá . Nó là 1 cơ quan nhỏ. Thymus được bao quanh bởi những sợi mô liên kết. Nó không được tách biệt trong 1 vùng để nhận biết giữa vỏ và lỗi, vì vậy có sự khác nhau với thymus của động vật hữu nhũ. Thymus có thể thay đổi hình dạng và phát triển tốt ở cá hương và cá giống. Nó nằm gần thận trước ở cá hương và cá giống nhưng vị trí đó lại khác so với cá trưởng thành bởi vì là cơ quan rất nhỏ và kích thước tương tự như thymus ở cá giống. Các tế bào thymus bắt màu xanh đen với thuốc nhuộm haematoxylin & eosin đó là loại tế bào chiếm ưu thế được tìm thấy trong Thymus. Thymus là cơ quan quan trọng của cá con và có một nhận định nó là cơ quan nội tiết nhưng chức năng quan trọng phổ biến được nhận biết là nó giữ vai trò trong tạo miễn dịch (Trích dẫn từ Supranee et al., 1991). Ở cá nheo mỹ (channel catfish), thymus nằm ở phía trong mặt lưng của hốc mang. Nó thường được bao bọc bằng lớp biểu bì mỏng.. Ở một số loài, lớp võ của thymus chủ yếu là các tế bào thymus và phần lõi là các tế bào biểu mô chiếm đa số. Các tế bào biểu mô giống với các huyết cầu của 1 số cá có vú. Ở một vài loài cá, thymus có thể được phát hiện ở 1 vài ngày đầu sau khi nở, ngược lại ở 1 vài loài cá bơn sao, dường như chỉ tìm thấy ở cá sau giai đoạn biến thái của ấu trùng. Sự thành thục của thymus ở tất cả các loài cá không phát sinh giống như ở động vật hữu nhủ. Thymus có khả năng thay đổi về kích thước với sự thay đổi của mùa hoặc theo chu kỳ của hormone được nhận dạng nhờ phương pháp mô học. Chức năng thymus của cá cũng giống như ở động vật hữu nhũ, tạo ra các tế bào lympho trong miễn dịch qua trung gian tế bào, trước khi di dời ra cơ quan lymphoid ngoại biên. Ở cá nhỏ, khi vi khuẩn tiếp xúc với hốc mang, phủ lên thymus gây hoại tử biểu bì là phổ biến, sau đó xâm nhập và phá huỷ nhu mô của thymus. Sự thay đổi về hình dạng ngoài của thymus đặc biệt là sự xuất huyết của thymus ở một số loài cá được cho là có liên quan đến điều kiện gây sốc của môi trường (Trích dẫn từ Grizzle et al., 1976). 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.4.3 Thận (Kidney) Thận của cá (nheo Mỹ) thì trải dài và đối xứng hai bên nhưng được chia ra thành từng phần riêng biệt, đó là phần thận trước và phần thận sau. Tiền thận và thân thận của cá trưởng thành và tiền trưởng thành trên 4 cm chiều dài tổng không được liên kết bởi một số biểu mô thận hoặc ống thận. Tĩnh mạch chính của phần thận trước kéo dài từ phần thân thận đến tiền thận. Tiền thận nằm ở phía trước bong bóng hơi của cá gồm tuyến nội tiết, biểu mô và cơ quan tạo máu. Quản cầu thận Malpighi và ống cuộn có ở tiền thận của những cá nhỏ hơn 4 cm chiều dài tổng. Nhưng cấu tạo và những ống này thì kéo dài từ phần tiền thận đã tiêu biến ra phía sau của thận (Trích dẫn từ Grizzle et al., 1976). Ở cá tra thận có màu nâu đỏ nằm dọc theo cột sống. Chức năng chính của thận là bài tiết các sản phẩm của quá trình biến dưỡng như NH3, Ure, các muối hóa trị 2; ổn định môi trường pH; điều hòa áp suất thẩm thấu,… Đồng thời thận còn có chức năng tạo máu và tham gia vào hệ thống miễn dịch bằng mô kẽ. Ngoài ra, thận còn tham gia vào hệ thống nội tiết (tiết kích thích tố và điều hòa quá trình sinh lý của cơ thể bằng hormone Adrenalin và Noradrenalin) (Bùi Châu Trúc Đan, 2003). 2.5 Sự hình thành cơ quan lympho Ở người hệ miễn dịch bao gồm nhiều cơ quan như tuyến ức (thymus), các hoạch bạch huyết, tuỷ xương, tuỵ tạng và ruột thừa. Tất cả các tế bào miễn dịch xuất phát từ các nguyên bào trong phôi, sau đó di chuyển đến các mô và cơ quan chuyên biệt, tại đây chúng sản sinh ra các hồng cầu và bạch cầu. Những tế bào bạch cầu nhất là các đại thực bào, tế bào B, T, NK và tế bào mast giữ vai trò quan trọng trong đáp ứng niễm dịch. Có 2 hệ thống đáp ứng miễn dịch là miễn dịch qua thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào. Cả 2 hệ thống này hoạt động chung để phá huỷ các kháng nguyên. Hệ thống miễn dịch thể dịch bảo vệ cơ thể chống lại các kháng nguyên thông qua sự tiết các prôtêin chuyên biệt là kháng thể, làm bất hoạt hoặc phá huỷ kháng nguyên trên bề mặt của vi khuẩn, nấm, virus nằm bên ngoài tế bào cũng như các chất độc tự do trong máu và huyết tương. Còn hệ miễn dịch qua trung gian tế bào trực tiếp phá huỷ các vi khuẩn qua việc sản xuất những tế bào chuyên biệt tấn công vào các chất xâm nhập (Bùi Tấn Anh và ctv, 2004). Theo Breuil.G, et al., 1997 nghiên cứu sự phát sinh kháng thể IgM trong tế bào và sự thay đổi trong miễn dịch golobulin (IgM) xuyên suốt ở giai đoạn ấu trùng của cá chẽm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (FITC) và phép phân 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com tích FACS để phát hiện những tế bào dương tính với IgM bằng mẫu dò kháng kháng thể. Còn sự phát triển của cơ quan lympho được nghiên cứu bằng phương pháp mô học. Kết quả nghiên cứu cho thấy, một lượng nhỏ IgM được phát hiện bằng phương pháp ELISA ở trứng cá, nhưng giảm dần cho đến ngày thứ 5 sau khi nở, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 15 không tìm thấy IgM trong tế bào. Sau đó IgM được phát hiện lại từ ngày 15 đến ngày thứ 30. Xuyên suốt giai đoạn này cơ quan thymus và thận trước được hình thành. Từ ngày 30 đến ngày 95, mật độ IgM tăng lên tương quan với trọng lượng cơ thể của ấu trùng. Kết quả này cho thấy rằng IgM được phát hiện từ ngày thứ 0 đến ngày thứ 5 xuất phát từ cá mẹ, trong khi đó IgM được phát hiện từ ngày 15 là các IgM mới được tổng hợp. Hơn thế nửa, tế bào B thành thục và sự tổng hơp IgM tương đối hoàn chỉnh ở ấu trùng cá chẽm 50 ngày tuổi khi cơ quan lympho phát triển đầy đủ. Trong khi đó, Merete et al., 1998 nghiên cứu về sự hình thành cơ lympho và sự sản xuất miễn dịch globulin ở cá tuyết đại dương (Gadus morhua L.), thuộc loài cá nước mặn. Kết quả cho thấy, ở cá tuyết (Gadus morhua L) thận trước và lá lách là cơ quan lympho xuất hiện trước tiên trong khoảng thời gian lúc nở, còn thymus được quan sát ở ấu trùng có kích thước 9 mm. Tế bào IgH mRNA được phát hiện trong lát cắt paraffin của ấu trùng cá, còn cá ở giai đoạn tiền trưởng thành dùng phương pháp lai phân tử. Những tế bào dương tính không phát hiện được ở cá nhỏ hơn 33 mm (58 ngày sau khi nở). IgH mRNA có sự giống nhau với các động vật khác và sự xuất hiện đầu tiên của các tế bào miễn dịch globulin dương tính được tìm thấy bằng phương pháp hoá mô miễn dịch. Tiếp theo đó, vào năm 2001, Lora et al., nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho của cá nheo mỹ, để đánh giá sự thay đổi có liên quan đến sự phát triển về chức năng đáp ứng miễn dịch dịch thể, nghiên cứu đánh giá về thời gian và không gian phân bố của tế bào miễn dịch phát triển ở cá da trơn. Kết quả cho thấy những tế bào có chức năng trong miễn dịch không đặc hiệu nó hiện diện ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus lúc nở và ở tỳ tạng là 3 ngày tuổi. Tế bào lympho dương tính với IgM được phát hiện đầu tiên ở ngày thứ 7, 10 và thứ 14 tương ứng với các cơ quan tạo máu thuộc thận, thymus và tỳ tạng. Sự thành thục của cơ quan thymus được phát hiện đầu tiên ở cá 10 ngày tuổi. Cơ quan thymus xuất hiện rõ ràng và tổ chức lympho thuộc tỳ tạng không quan sát được cho đến ngày thứ 21 sau khi nở. Nghiên cứu còn cho thấy, tổ chức lympho thứ cấp nghèo nàn là do kháng thể được sản xuất ra ít cho đến khi ấu trùng cá được 21 ngày tuổi. 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Một năm sau, Nadia et al., 2002 đã nghiên cứu sự phát triển của tế bào B trong tỳ tạng của cá ngựa. Ở cá ngựa trước đây được cho rằng tế bào T có thể phân biệt được ở thymus của cá 4 ngày tuổi nhưng tế bào B chỉ phân biệt được ở cá 3 tuần tuổi. Nhưng ở cá 4 ngày tuổi, phát hiện gen thụ thể của tế bào B trong ADN ly trích từ toàn bộ con cá. Cũng thời gian 4 ngày, bản sao Rag-1 được thấy ở tỳ tạng (là cơ quan trước đây cho rằng không liên quan đến tổ chức lymphoid của cá ngựa); ở cá 10 ngày tuổi, bản sao Ig cũng được phát hiện ở tỳ tạng. Vì vậy, ở cá ngựa tỳ tạng cũng được thừa nhận là cơ quan có chức năng quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Và cũng năm này, Lora et al., 2002, nghiên cứu hệ thống đáp ứng miễn dịch thể dịch của cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus) ở giai đoạn cá b ột và cá giống khi tiếp xúc với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Nghiên cứu thực hiện với cá không có mầm bệnh được thuần hoá phù hơp với điều kiện môi trường. Cá ở tuổi 1, 2, 3 và 4 tuần và 2, 3, 4, 5, và 6 tháng sau khi nở, Cá được tiêm liều sơ cấp với vi khuẩn E. ictaluri 4 (ở liều 6,4×10 cfu/ ml cho 1 bể) và sau đó 4 tuần tiêm tiếp liều thứ 2. còn nhóm đối chứng thì được tiếp xúc với môi trường nuôi cấy đã tiệt trùng. Kết quả cho thấy kháng thể đặc hiệu được phát hiện đầu tiên ở cá 4 tuần tuổi sau khi nở có trọng lượng trung bình 85 mg. Đáp ứng thứ cấp được chứng minh ở cá hương 4 tuần tuổi khi nhúng liều sơ cấp và 8 tuần tuổi khi nhúng liều thứ cấp. Tuy nhiên, hiệu quả tăng khả năng đáp ứng là đúng được chứng minh ở cá 2 tháng tuổi nhận liều sơ cấp. Cá nhận liều sơ cấp ở trước 4 tuần tuổi và 1 liều thứ cấp nhẹ kết quả đáp ứng kháng thể có ý nghĩa, thậm chí chúng đồng tuổi nhau ở liều tiếp xúc thứ 2 việc tạo ra đáp ứng kháng thể tốt được kéo dài nhờ vào liều tiếp xúc ban đầu. Từ kết quả trên người ta cho rằng cá nheo không có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch thể dịch trước 4 tuần tuổi. Tiếp tục, nghiên cứu mô học về cơ quan lympho của cá đĩa Xiphophorus maculatus L. ở giai đoạn ấu trùng cho thấy thymus là cơ quan lớn và chứa đầy các tế bào lympho. Trong khi tổ chức lympho có ở lá lách và ống thận phát triển chậm hơn (Leknes, 2003). Cho đến hai năm sau, Zapata et al, 2005, nghiên cứu sự phát sinh hệ miễn dịch ở một số loài cá có giá trị từ cách nguồn báo cáo đã có trước đây. Kết quả cho thấy rằng ở một vài loài cá xương (chẳng hạn như cá angelfish) tế bào máu đầu tiên được hình thành từ khối noãn hoàng. Ở vài loài cá khác như cá ngựa, vị trí cơ quan tạo máu đầu tiên là ở trong phôi, đa số là các tế bào trung gian (ICM), trong khi đó ở cả cá mùi và cá hồi các tế bào máu đầu tiên chỉ xuất hiện 1 thời gian ngắn ở noãn hoàng nhưng sau đó ICM phát triển chủ yếu ở cơ quan tạo máu. Hồng cầu và các đại thực bào là những tế bào máu đầu tiên 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com được nhận định ở phôi của cá ngựa. Những tế bào này sinh ra từ tế bào ICM, ống Cuvier và những tế bào ngoại biên. Trong khoảng 24 - 30 giờ sau khi thụ tinh ở nhiệt độ 28°C một ít nguyên bào tuỷ và tế bào tuỷ xuất hiện giữa khối noãn hoàng và vách cơ thể, ở vùng bụng gần phần đuôi ở cá ngựa 1 - 2 ngày tuổi cũng có các tế bào máu phát triển. Cơ quan thymus, thận và lá lách là những cơ quan lympho thiết yếu của lớp cá xương. Thymus là cơ quan lympho được hình thành đầu tiên, mặc dù thận trước có thể xuất hiện trước nhưng chưa xuất hiện các tế bào lympho. Ở cá nước ngọt, lá lách của cá xương là cơ quan lympho phát triển sau cùng. Bên cạnh đó, sự xuất hiện sớm của Rag-1 ở Thymus của cá ngựa có mối tương quan với hình thái của tế bào lympho. Chức năng và hình dạng của tế bào lympho rõ ràng hơn khi cá có được hệ miễn dịch hoàn chỉnh. Gần đây, Sonal et al., 2008 nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho và phát triển của tế bào sinh kháng thể IgM ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus hippoglossus L.). Kết quả mô học cho thấy thận xuất hiện ở cá 1 ngày tuổi sau khi nở, cơ quan thymus xuất hiện ở cá 33 ngày sau khi nở, trong khi đó lá lách là cơ quan sau cùng xuất hiện ở 49 ngày tuổi sau khi nở. Tất cả các cơ quan lympho này có hình thái tương đối hoàn chỉnh sau giai đoạn biến thái. Với phương pháp RT - PCR cho thấy IgM mRCT xuất hiện ở cá 66 ngày tuổi sau khi nở và có thể chậm hơn, tương ứng với thời gian này ở kỹ thuật lai phân tử cũng cho thấy có 1 ít tế bào dương tính với IgM có thể được phát hiện ở giai đoạn đầu của thận và lá lách. Còn phương pháp hoá mô miễn dịch dùng kháng thể đơn dòng phát hiện được IgM ở thận trước và lá lách của cá 94 ngày tuổi, nhưng IgM mRCT được phát hiện chậm hơn. Nhiều tế bào xuất hiện rõ ràng cả IgM mRCT và prôtein có thể được phát hiện ở tỳ tạng, thận trước, và thymus cũng có xuất hiện nhưng ở giai đoạn cá bơn lớn. 2.6 Một số thành tựu về phương pháp mô học Nghiên cứu mô học bắt đầu từ cuối thế kỉ 17 nhưng mãi đến cuối thế kỉ 19 mô học mới được coi là ngành khoa học (trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). Mô học bắt đầu từ khi kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhoek (1632-1723) người Hà Lan, đến cuối thế kỉ 18 Robert Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Quan sát miếng nút chai dưới kính hiển vi đã đưa ra kết luận “miếng nút chai được tạo thành từ những túi nhỏ hay tế bào độc lập với nhau và chứa đầy không khí” (R.Hooke, 1665, trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Sau khi thuyết tế bào ra đời (1893), đặc biệt là lĩnh vực mô học mô tả ra đời thì những thành phần cấu tạo khác nhau của cơ quan và các mô được nghiên cứu cẩn thận, tỉ mỉ hơn. Thành tựu lớn nhất của giai đoạn này là chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtom) cho phép nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hiển vi thể của tế bào và mô (Phạm Phan Địch, 1998), từ đó đến nay mô học ngày càng được chú ý phát triển mạnh mẽ và chuyên sâu hơn. Robert (1989) đã hệ thống lại tất cả các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cá, các giống loài kí sinh trùng, vi khuẩn, virut gây bệnh trên cá, dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của cá đối với từng tác nhân gây bệnh khác nhau. Ông cũng đã mô tả về phản ứng sinh lý của cá, quá trình biến đổi chung của cơ quan trong cơ thể cá khi bị tác nhân xâm nhập và gây bệnh. Bên cạnh đó, ông cũng trình bày cơ bản về những đáp ứng miễn dịch chung của cá trước tác động của các yếu tố vô sinh và hữu sinh. Suprance et al., (1991) nghiên cứu về mô học trên cá trê trắng. Tác giả không nghiên cứu trên cá bệnh mà chỉ nghiên cứu trên cá khỏe và khảo sát 1 số cơ quan như hệ bài tiết, hệ tuần hoàn,… nhằm so sánh khi nghiên cứu mô và cung cấp sự hiểu biết về mô học. Grizzle et al., (1976) giải phẩu và nghiên cứu mô học trên cá nheo. Tác giả đã mô tả đặc điểm về mô trên một số cơ quan của cá nheo như hệ thần kinh, hệ cơ, hệ tiêu hoá...nhằm nhận dạng đặc điểm của các cơ quan để nghiên cứu sau này. Groman (1982) nghiên cứu mô học trên cá chẽm. Tác giả đã quan sát cấu trúc mô khỏe ở nhiều giai đoạn của cá từ giống đến trưởng thành ở một số cơ quan: hệ hô hấp, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ tiêu hoá, hệ sinh dục, hệ bài tiết…Tiếp đó, Herrera (1996) nghiên cứu trên cá rô phi (Oreochromis niloticus). Tác giả dùng phương pháp mô học để nghiên cứu trên một số cơ quan như da, cơ, xương, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết, hệ sinh dục, hệ thần kinh… Ở nước ta ngày nay, mô học đã được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực thủy sản như: Nguyễn Quốc Thịnh (2002) bước đầu nghiên cứu về mô bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra. Tác giả đã đưa ra sự so sánh về những biến đổi cấu trúc của mô cá bệnh như hiện tượng xuất huyết, hoại tử, xung huyết so với cá khỏe. Đến năm 2003, Bùi Châu Trúc Đan nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học bệnh phù mắt trên cá tra, quan sát trên các cơ quan như gan, nội tạng… nhằm so sánh những cấu trúc vi thể của cá và tiếp theo là Phan Thị Hừng, 2004 nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra bị bệnh vàng da. Tác giả cũng quan sát cơ quan gan, thận và tỳ tạng trong cấu trúc của mô 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com cá bệnh để so sánh với cá khỏe. Gần đây, Võ Quốc Hào (2008), nghiên cứu cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra. Tác giả đã xác định được đặc điểm, cấu trúc mô của cá khỏe từ đó làm cơ sở cho việc chẩn đoán. Ở nước ta, nghiên cứu về mô học trên cá được thực hiện khá phổ biến nhưng chủ yếu thiêng về chẩn đoán và xác định mầm bệnh. Hiện nay, vaccine là biện pháp phòng bệnh hữu hiệu cho cá tra nuôi nhưng việc sử dụng vaccine chưa đem lại hiệu quả do chưa nghiên cứu. Việc sử dụng vaccine có hiệu quả hay không là phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cá. Do đó, nghiên cứu về sự hình thành cơ quan lymphoid trên cá tra là điều cần thiết. 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thời gian thực hiện: Từ 29/12/2008 – 19/05/2009 Địa điểm thu mẫu: Mẫu thu ở trại ương cá tra Thị Trấn Hồng Ngự - tỉnh Đồng Tháp Địa điểm phân tích mẫu: Phòng mô của Bộ môn Sinh học và Bệnh thuỷ sản Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ: Bộ tiểu phẩu, ống universal, khay nhựa, lọ thuỷ tinh, cốc đốt 500ml, máy cắt lát mỏng (microtom), máy xử lý mô, khuôn đúc mẫu, máy ảnh, kính hiển vi, lame, lamelle… 3.2.2 Hoá chất: Formol thương mại (37%), ethanol, xylene, paraffin, sáp ong, thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin, keo dán enterllan. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu Thu mẫu cá ở ao ương, thu cá từ 1 đến 30 ngày tuổi sau khi nở, mỗi ngày tuổi thu 6 - 30 con. 3.3.2 Phương pháp cắt mẫu Mẫu xác định ở 3 cơ quan chính là thận, tỳ tạng và tuyến ức được tiến hành cắt mẫu thăm dò ở các ngày tuổi như 1, 8, 15, 22,… và sau đó xác định các cơ quan này bằng cách cắt mẫu ở các độ tuổi ngắn lại và xem sự hình thành các chức năng của nó. 13 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com