Tài liệu Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nhân nhanh in vitro cây hoa hồng pháp (rose gallica l.)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƯƠNG THỊ MẾN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NANO TRONGNHÂN NHANH IN VITRO CÂY HOA HỒNG PHÁP (Rosa gallica L.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Đồng Huy Giới NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kì học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được ghi rõ nguồn gốc. Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Dương Thị Mến i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS.Đồng Huy Giới, người đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ Môn sinh học, Khoa công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, các Thầy Cô giáo khoa Công nghệ sinh học đặc biệt là các Thầy Cô trong Bộ môn Sinh học – Học viện nông nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên, khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./. Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017 Tác giả luận văn Dương Thị Mến ii MỤC LỤC Lời cam đoan ................................................................................................................. i Lời cảm ơn ................................................................................................................... ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh mục viết tắt ......................................................................................................... vi Danh mục bảng ...........................................................................................................vii Danh mục hình ...........................................................................................................viii Trích yếu luận văn ........................................................................................................ ix Thesis abstract. .............................................................................................................. x Phần 1. Mở đầu ........................................................................................................... 1 1.1. Lý do chọn đền tài ........................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu của đề tài.......................................................................................... 1 1.3. Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.4. Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học ........................................................... 2 Phần 2. Tổng quan tài liệu .......................................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây hoa hồng pháp (Rosa gallica.L) ............................................ 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại .................................................................................. 3 2.1.2. Một số đặc tính sinh học của cây hoa hồng và yêu cầu ngoại cảnh ................... 3 2.2. Các nghiên cứu về nuôi cấy in vitro cây hoa hồng và một số cây trồng khác ................................................................................................................. 8 2.2.1. Nghiên cứu về nhân nhanh in vitro cây hoa hồng và một số cây trồng khác ................................................................................................................. 8 2.2.2. Nghiên cứu về tạo mô sẹo. ............................................................................. 11 2.2.3. Giới thiệu về công nghệ nano và nano bạc, nano đồng ................................... 12 2.2.4. Cơ chế diệt khuẩn, nấm của nano bạc, nano đồng và ứng dụng. ..................... 13 2.2.5. Công nghệ nano trong nuôi cấy in vitro.......................................................... 15 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .......................................................... 19 3.1. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 19 3.2. Thời gian nghiên cứu ..................................................................................... 19 3.3. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 19 3.4. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 19 iii 3.5. Phương pháp thí nghiệm ................................................................................ 20 3.5.1. Thiết kế thí nghiệm ........................................................................................ 20 3.5.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu.................................................................................. 20 3.5.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 21 3.5.4. Phân tích số liệu............................................................................................. 26 Phần 4. Kết quả và thảo luận.................................................................................... 27 4.1. Nghiên cứu khả năng khử trùng mẫu hoa hồng pháp của hỗn hợp dung dịch nano bạc-đồng ........................................................................................ 27 4.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp........................................................................................ 27 4.1.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp........................................................................................ 28 4.2. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng ba và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng pháp. .................................... 30 4.2.1. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp. ................................................... 30 4.2.2. Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp. ................................................................................. 31 4.3. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng iba và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng pháp. ................................................................ 33 4.3.1. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp. .............................................................................................. 33 4.3.2. Ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp. ................. 34 4.4. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng ba và nano bạc đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hống pháp. ........................................................ 36 4.4.1. Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp. ................................................................ 36 4.4.2. Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp. ..................................................................................................... 38 4.5. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng -naa và nano bạc lên sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng pháp. ....................................................................... 40 iv 4.5.1. Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp. .............................................................................................. 40 4.5.2. Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp. .................. 42 Phần 5. Kết luận và kiến nghị ................................................................................... 44 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 44 5.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 44 Tài liệu tham khảo ..................................................................................................... 45 Phụ lục ...................................................................................................................... 50 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng việt BA Bezyl adenine CS Cộng sự CT Công thức CV% Sai số thí nghiệm ĐC Đối chứng GA Gibberellin IAA Indole – 3 – acetic acid IBA Indole – 3 – butylic acid LSD0,05 Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5% MS Murashige and Skoog α -NAA α – naphthalene acetic acid NĐ Nồng độ NXB Nhà xuất bản TB Trung bình TDZ Thidiazurol NS Nano bạc NS/NC Hỗn hợp nano bạc-đồng vi DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần). ............................................................... 27 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lí hợp nano bạc -đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp (sau 4 tuần). ......................................................29 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp (sau 4 tuần).............................30 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nano bạc đến sự tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp (sau 4 tuần). ................................................................32 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp (sau 6 tuần)........................................................................ 33 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của nano bạc lên quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). .............................................................................................. 35 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). ........................................ 37 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc lên quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp (sau 6 tuần)........................................................................ 39 Bảng 4.9. Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). ....................................................................41 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 giống hoa hồng Pháp (sau 6 tuần)........................................................................ 42 vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1. Khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ trong các môi trường có nồng độ BA khác nhau (sau 4 tuần). ........................................................ 31 Hình 4.2. Khả năng tái sinh chồi từ mắt ngủ từ đoạn thân trong môi trường nuôi cấy với nồng độ nano bạc khác nhau (sau 4 tuần)......................................... 33 Hình 4.3. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). ......................................................................... 34 Hình 4.4. Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). ........................................................................................................ 36 Hình 4.5. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). .....................................................38 Hình 4.6. Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). ...............................................................................40 Hình 4.7. Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp (sau 6 tuần). ......................................................................42 Hình 4.8. Ảnh hưởng của nano bạc đến sự ra rễ chồi cấp 2 giống hoa hồng Pháp (sau 6 tuần)..................................................................................................43 viii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dương Thị Mến. Tên luận văn: Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nhân nhanh in vitro cây hoa hồng pháp (Rosa gallica L.). Ngành: Công nghệ sinh học. Mã số: 60.42.02.01 Tên cơ sở đào tạo: Học viện nông nghiệp Việt Nam. Mục đích nghiên cứu: Xác định được nồng độ, thời gian xử lý chế phẩm nano thích hợp nhất cho việc khử trùng mẫu đoạn thân mang mắt ngủ cây hoa hồng Pháp (Rosa gallica L.). Xác định được nồng độ dung dịch nano bạc và các chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho nuôi cấy in vitro cây hoa hồng Pháp. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành, mỗi thí nghiệm được bố trí 5 công thức, mỗi công thức 20 mẫu, 3 lần lặp lại. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, IRRISTAT 5.0. Kết quả chính và kết luận: Đã bố trí được các thí nghiệm theo mục đích đề ra và đã xác định được: i) Nồng độ hỗn hợp nano bạc – đồng và thời gian thích hợp nhất để khử trùng mẫu đoạn thân mang mắt ngủ là 200 ppm trong 60 phút với tỷ lệ mẫu sống sạch 90%, ii) Nồng độ BA và nano bạc thích hợp nhất cho sự tái sinh chồi đoạn thân mang mắt ngủ là 2 mg/l và 2 ppm với tỷ lệ bật chồi 91,7% , iii) Nồng độ IBA và nano thích hợp nhất cho quá trình tạo mô sẹo từ lá in vitro là 0,5 mg/l và 4 ppm với tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 86,7%, iv) Nồng độ BA và nano thích hợp nhất cho quá trình nhân chồi là 1,5 mg/l BA và 2ppm cho hệ số nhân chồi 5,23 lần. v) Xác định nồng độ NAA và nano thích hợp nhất cho sự ra rễ tương ứng là 2 mg/l và 2 ppm cho tỷ lệ ra rễ là 76,67%, số rế trung bình trên chồi là 4.23. ix THESIS ABSTRACT Author: Duong Thi Men. Thesis title: Study on the use of nanoparticles in French rose (Rosa gallica L.) Tissue Culture. Field of study: Biotechnology. Code: 60.42.02.01 Training center: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Aims: - To determine the best concentration of mixed nanosilver and nanocopper and processing time for sterilization of the French rose explants. - To determine optimal medium for tissue culture of French rose (Rosa gallica L.). Method: The study was conducted according to the current tissue culture method; each experiment has 5 formulas, each of which consists of 20 samples and is repeated 3 times. Data is processed by Microsoft Excel 2007, IRRISTAT 5.0. Main results and conclusion: This study identified: (i) Concentration of 200 ppm of mixed nanosilver and nanocopper for 1 hour after surface sterilization was the best treatment of the French rose explants, which made 90% samples clean and survival ; (ii) 91.7% of French rose explants formed shoots on the medium supplemented with 2 mg/l BA and 2 ppm silvernano; (iii) The formation of callus from the in vitro leaf piece of French rose were best in medium added with 0,5 mg/l IBA and 4 ppm silvernano; (iv) The optimal medium for micropropagation of French rose was medium containing 1,5 mg/l BA and 2 ppm of nanosilver; (v) On the medium supplemented with 2 mg/l NAA and 2 ppm nanosilver, rooting rate of shoots in vitro French rose was 76.7%, with an average of 4.23 roots/shoot. x PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀN TÀI Cây hoa hồng Pháp là loài thực vật có hoa tên khoa học là Rosa gallica L. thuộc chi Rosa, họ Rosaceae. Cây hoa hồng Pháp thuộc loại cây bụi, thân leo, có gai, lá cây màu xanh tươi, hoa có nhiều màu nhưng chủ yếu là màu hồng và màu tím. Loài hoa này dễ canh tác, dễ chăm sóc và có sức sống mạnh mẽ. Hoa hồng Pháp có thể dùng trồng làm cảnh sân vườn, tiểu cảnh, trồng trong khuôn viên đô thị, công viên hoặc trồng trong chậu trang trí nội thất văn phòng, cây ban công. Hiện nay một số phương pháp nhân giống chủ yếu của hoa hồng Pháp là nhân giống bằng hạt, ghép cành, chiết cành. Tuy nhiên, hạt chủ yếu là nhập khẩu nên ở Việt Nam chưa chủ động được việc nhân giống bằng hạt, với phương pháp chiết ghép thì số lượng nhân chưa được nhiều, bên cạnh đấy các cây con được tạo ra thường chưa sạch bệnh, hay bị nhiễm khuẩn và nấm. Nuôi cấy mô là biện pháp kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để nhân giống cây trồng sạch bệnh. Tuy nhiên, trong quá trình nhân giống hoa hồng Pháp cũng như các loại cây trồng khác bằng nuôi cấy mô, vấn đề mà chúng ta luôn gặp phải là sự nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu cấy gây ảnh hưởng lớn tới hiệu suất nuôi cấy và chất lượng cây khi ra vườn ươm. Hiện nay, chúng ta thường sử dụng một số hóa chất khử trùng (HgCl2, CaClO2, …). Tuy nhiên, việc sử dụng các hóa chất trên gây ô nhiễm môi trường, gây độc hại cho người và các sinh vật khác. Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu vật liệu nano và ứng dụng nó trong đời sống của con người đang được qua tâm. Một trong những ứng dụng trong sử dụng vật liệu nano là ứng dụng trong nông nghiệp. Nano bạc và đồng dùng cho nông nghiệp được biết đến với những công dụng trong sản xuất cây trồng như: Phòng trừ và tiêu diệt các loại vi rút, vi khuẩn, nấm bệnh gây hại cây trồng. Trong những năm gần đây nano bạc và đồng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ngoài ra nano bạc còn được biết đến có tác động tích cực đến quá trình phát sinh hình thái của cây in vitro. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nano trong nhân nhanh in vitro cây hoa hồng pháp (Rosa gallica L.)”. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định được nồng độ, thời gian xử lý chế phẩm nano thích hợp nhất 1 trong khử trùng mẫu đoạn thân mang mắt ngủ cây hoa hồng Pháp. Xác định được nồng độ chế phẩm nano và các chất điều tiết sinh trưởng thích hợp nhất cho nhân giống in vitro giống hoa hồng Pháp. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Giống hoa hồng Pháp (Rosa gallica L.); chế phẩm nano bạc và nano đồng với nồng độ 500 ppm được cung cấp bởi Bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 7/2016 đến tháng 5/2017. Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chế phẩm nano trong nuôi cấy in vitro hoa hồng Pháp. Xác định được nồng độ chế phẩm nano thích hợp nhất cho việc khử trùng đoạn thân mang mắt ngủ, tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ, nhân chồi in vitro, ra rễ từ chồi cấp 2 và tạo mô sẹo từ mẫu lá in vitro của hoa hồng Pháp. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY HOA HỒNG PHÁP (Rosa gallica.L) 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại Hoa hồng Pháp thuộc chi Rosa, họ Rosacaea, phân họ hoa hồng (Subrosaceae). Nó có nguồn gốc ôn đới và nhiệt đới vùng Bắc bán cầu (Việt Chương, Lâm Thị Mỹ Hương, 2006) thuộc loại cây bụi có gai, lá cây màu xanh tươi, hoa nhiều màu đỏ, hồng, vàng, trắng…, thân có gai và lông mao. Hiện nay nó được phân bố rộng rãi trên thế giới và đã được du nhập và trồng ở Việt Nam từ lâu, có giá trị kinh tế cũng như tinh thần rất cao. 2.1.2. Một số đặc tính sinh học của cây hoa hồng và yêu cầu ngoại cảnh 2.1.2.1. Đặc điểm sinh học  Thân: Cây hoa hồng thuộc cây thân gỗ, cây bụi thấp, thẳng hoặc leo, có nhiều cành, có gai hoặc không có gai. Đa số các loài hoa hồng thân đều rỗng ở giữa khi hóa gỗ (Mai Thị Ngoan, 2009).  Rễ Rễ hoa hồng thuộc rễ chùm, chiều ngang tương đối rộng, khi bộ rễ lớn phát triển nhiều rễ phụ, phân bố nông trên lớp mặt đất mặt từ 5 – 30cm. Bộ rễ hoa hồng không chịu được ngập úng, ưa đất ẩm nhưng phải thông thoáng, thoát nước.  Lá Lá hoa hồng có dạng kép lông chim với 3, 5, 7, 9, 11, 13 lá chét và đính lá kèm ở gốc, xung quanh lá chét có nhiều răng cưa nhỏ và thường có những gai trên gân lá. Kích thước chiều dài và chiều rộng lá chét cũng thay đổi tùy thuộc vào các mẫu giống và nhóm giống chẳng hạn như giống hoa cắt cành có lá chét to hơn nhóm hoa tiểu muội. Tùy giống mà lá có màu xanh đậm hay nhạt, răng cưa nông hay sâu hay có hình dạng lá khác (Lê Xuân Thiệu, 2007).  Gai Gai hoa hồng là do biểu bì biến thành, nó giống móc câu, thường là một gai hoặc bụi gai. Gai hoa hồng giúp cho cây hoa hồng có khả năng chống chịu tốt với côn trùng và giúp cây thích nghi với điều kiện hạn hán.  Hoa Theo như khảo sát nghiên cứu của Nguyễn Mai Thơm (2009) đã cho kết quả về đường kính hoa, số cánh hoa, số nhị, số nhụy,… ở một số giống hoa hồng, 3 hoa hồng thường có cánh bộ 5, ví dụ như hoa hồng Rosa sericea có 4 cánh nhưng hoa hồng Rosa gallica lại có vô số cánh, đó là nét đặc trưng của loại hoa hồng này. Hoa thức của phụ hoa hồng Rosoideae là K4-5 C5 A4G . Hoa hồng Pháp có hoa dạng đơn, có nhiều cánh sắp xếp hình xoắn ốc cánh hoa mềm, dễ bị dập nát và gãy thuộc loại hoa lưỡng tính, nhị đực và nhị cái trên cùng một hoa, phân hóa đài hoa rõ rệt, nhị hoa nhiều xếp hình xoắn ốc dính vào nhau, nhuỵ hoa nhiều, rời nhau xếp hình xoắn ốc quanh đế hoa, đế hoa lõm hình chén, hoa có màu phớt hồng hay anh đào, có mùi thơm nhẹ....  Quả và hạt Quả hình trái xoan có các cánh đài còn lưu lại, có màu xanh, khi chín có màu nâu vàng hoặc đỏ tùy theo màu sắc hoa. Mỗi quả chứa nhiều hạt nhỏ, có lớp lông trắng bao phủ. khả năng nảy mầm của hạt rất kém do có lớp vỏ dày (Đặng Văn Đông và cs., 2002). 2.1.2.2. Yêu cầu về điều kiện ngoại cảnh  Ánh sáng - Cường độ chiếu sáng Đa số các giống hồng rất chịu nắng, hồng là cây ưa sáng, ánh sáng đầy đủ giúp cây phát triển tốt, đây là yếu tố quan trọng nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của hoa hồng. Ánh sáng cung cấp năng lượng cho phản ứng quang hợp, tạo chất hữu cơ cho cây. Có tới 90% chất khô trong cây là do quang hợp tạo nên, cường độ quang hợp phụ thuộc và điều kiện ánh sáng. Thiếu ánh sáng cây không thể quang hợp được. Cường độ quang hợp của cây hoa tăng khi cường độ chiếu sáng tăng, song nếu cường độ ánh sáng vượt quá giới hạn thì cường độ quang hợp bắt đầu giảm đồng nghĩa với việc năng suất và chất lượng hoa đều giảm. Sự phân hóa hoa, sự phát dục của hoa, thời gian giãn cách giữa hai lần cắt hoa, trọng lượng và chiều dài cành, màu sắc và diện tích lá đều phụ thuộc ánh sáng. Khi cây con còn nhỏ yêu cầu về cường độ ánh sáng thấp hơn, khi tuổi cây càng cao càng yêu cầu ánh sáng nhiều hơn (Đặng Văn Đông và cs., 2002). - Chu kỳ và chất lượng ánh sáng. Chu kỳ chiếu sáng không ảnh hưởng đến sự phân hóa hoa nhưng thời gian chiếu sáng dài sẽ kích thích sự sinh trưởng và ra hoa, giảm bớt cánh mù và ra hoa, rút ngắn thời gian ra hoa. Chu kỳ chiếu sáng và độ dài bước sóng ánh sáng có quan hệ tới sự phát dục của hoa và vị trí của mầm hoa. 4 - Cường độ quang hợp Tất cả các giống hoa hồng đều có yêu cầu lượng bức xạ là 1000 Mmol m2 -1 S PAR. Ở nhiệt độ 220C và điều kiện kéo dài bức xạ, mức quang hợp thuần của hoa hồng khi nồng độ CO2 là 360 mg/l. Sức sinh trưởng của hoa hồng và mùa thu – đông – xuân cao hơn mùa hè (Đặng Văn Đông và cs., 2002).  Nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng đối với sinh trưởng và phát triển của cây hoa hồng bao gồm các yếu tố: nhiệt độ ngày, đêm, chênh lệnh nhiệt độ ngày đêm và nhiệt độ đất (Đặng Văn Đông và cs., 2002).. - Nhiệt độ ngày: tùy theo giống, trung bình từ 23 – 250C, cũng có một số giống nhiệt độ tối thích là 21 – 230C. Nhiệt độ ngày cũng ảnh hưởng tới sản lượng hoa. Nhiệt độ từ 26 – 270C sản lượng cao hơn ở 29 – 320C là 49%, hoa thương phẩm cao hơn 20,8%. - Nhiệt độ đêm: nhiệt độ đêm quan trọng hơn nhiệt độ ngày. Đa số các giống thích hợp với nhiệt độ đêm là 160C, nhiệt độ này có ảnh hưởng tốt đến số lượng và chất lượng hoa. Thấp hơn nhiệt độ tối thích này cây sinh trưởng chậm, sản lượng thấp nhưng chất lượng hoa cao. Nếu cao hơn nhiệt độ tối thích thì cây sinh trưởng nhanh nhưng chất lượng hoa kém. - Nhiệt độ đất: nhiệt độ đất thích hợp thì sức sống của rễ cao, tăng năng suất và chất lượng hoa. Nhiệt độ đất trên 210C thì nhiệt độ không khí chỉ 5-80C vẫn có hoa chất lượng cao. Nhiệt độ đất có thể cao hơn 260C cây vẫn có thể sinh trưởng tốt nhưng cao quá 300C thì ảnh hưởng xấu.  CO2 CO2 là yếu tố quan trọng sau nhiệt độ và ánh sáng. Lượng CO2 ảnh hưởng tới quang hợp, sinh trưởng và phát dục của cây. Nhìn chung các loại hoa có phản ứng với việc bổ sung CO2, phản ứng trực tiếp làm tăng quang hợp, tích lũy chất khô và phản ứng gián tiếp là phản ứng hình thái với đặc trưng làm tăng sự nảy mầm và tăng số lượng hoa. Bổ sung thêm CO 2 có thể làm tăng sản lượng và chất lượng hoa, CO2 còn làm tăng hiệu quả của ánh sáng (Đặng Văn Đông và cs., 2002).  Độ ẩm Độ ẩm của không khí và đất đều ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của cây hoa. Độ ẩm thích hợp thì cây hoa sinh trưởng, phát triển tốt ít sâu bệnh, hoa đẹp, chất lượng hoa cao. 5  Nước Nước đóng vai trò quan trọng trong cơ thể thực vật. Nước giữ vai trò quan trọng trong phân chia và dãn của tế bào. Khi có đầy đủ nước và môi trường thích hợp, tế bào phân chia, phát triển thuận lợi, cây sinh trưởng nhanh. Khi thiếu nước các quá trình sinh lý, hóa trong cây hoa giảm, các hợp chất hữu cơ được tạo thành ít, cây còi cọc, phát triển kém. Nếu sự thiếu nước kéo dài, cây hoa có thể khô héo và chết. Nhưng, nếu quá nhiều nước, cây sẽ bị úng ngập, sinh trưởng phát triển của cây bị ngừng trệ. Mỗi loại hoa yêu cầu độ ẩm khác nhau. Hoa hồng thuộc cây ôn đới nên yêu cầu độ ẩm đất thường khoảng 70 - 80% (Đặng Văn Đông và cs., 2002), nếu khống chế độ ẩm thích hợp thì độ dài cành tăng thêm trung bình 8,2%.  Đất Đất là yếu tố môi trường quan trọng nhất, là nơi nâng đỡ cây trồng, cung cấp nước, dinh dưỡng cơ bản và không khí cho sự sống của cây hoa. Phần lớn các cây hoa yêu cầu đất tơi xốp, thoát nước, có khả năng giữ ẩm, tầng canh tác dày. Nhìn chung hoa hồng đều thích nghi và phát triển tốt trên những loại đất trung tính và ít chua, rễ phân bố chủ yếu ở tầng đất 60 cm trở lên, một số ít giống phân bố trên 1m. Đất trồng hoa hồng tốt nhất là đất đen, đỏ vôi (đất fegazit) hoặc đất đồi giàu mùn. Loại đất này kết cấu viên tốt, khối lượng riêng nhỏ, khả năng giữ mùn tốt, thoáng khí, có lợi cho sự phát triển của bộ rễ (Lê Xuân Thiệu, 2007).  Dinh dưỡng khoáng Nhu cầu dinh dưỡng khoáng và đặc điểm hút dinh dưỡng của cây có liên quan đến nguồn gốc cây và giống. Nhu cầu và tác dụng sinh lý của các nguyên tố khoáng với hoa hồng có đặc điểm sau: - Nitơ (N): là nguyên tố quan trọng nhất của cây, là thành phần của axit amin, protein, axit nucleic, enzym, chất kích thích sinh trưởng, vitamin (chiếm khoảng 1 – 2% khối lượng chất khô), cây có thể hút N dưới các dạng: NO 3-, NH4+, N ảnh hường rất lớn tới sản lượng và chất lượng hoa hồng. Thiếu N cây sinh trưởng chậm, phân cành yếu, cành, lá nhỏ, diệp lục ít, lá biến vàng, lá già và dễ bị rụng, rễ nhỏ dài và ít, cây thấp, khả năng quang hợp giảm. - Phospho (P): tham gia vào thành phần quan trọng của axit nucleic và màng tế bào, tạo thành ATP là vật chất mang và tải năng lượng. P thường chiếm từ 1 – 1,4% khối lượng chất khô của cây. Cây hút P dưới dạng H2PO4- và HPO42-, P có 6 thể di chuyển trong cây, chủ yếu tập trung ở phần non. Khi thiếu P thì phần già biểu hiện trước. P cũng ảnh hưởng lớn đến phẩm chất cây, thiếu P dẫn tới tích lũy N dạng nitrat gây trở ngại cho việc tổng hợp protein, cành, lá, rễ sinh trưởng chậm, cây thấp, lá có màu tím tối hoặc tím đỏ ảnh hưởng đến tổng hợp chất tinh bột, hoa nở khó, nhiều P quá sẽ ức chế sinh trưởng dẫn tới thừa sắt, lá biến vàng, ảnh hưởng tới sự hút sắt. - Kali (K): không tham gia thành phần cấu tạo cây, thường tồn tại trong dịch bào dưới dạng ion. Tác dụng chủ yếu của K là điều tiết áp suất thẩm thấu của tế bào, thúc đẩy quá trình hút nước, hút dinh dưỡng của cây. Khi ánh sáng yếu K có tác dụng kích thích quang hợp, tăng sức đề kháng cho cây. Trong cây, K di động tự do. Nếu thiếu K, sự sinh trưởng, phát dục của cây giảm sút, mép lá thiếu màu xanh, ngọn lá khô héo sau đó lan ra toàn lá, các đốt ngắn lại, nụ hoa nhỏ và dễ trở thành hoa mù. K là nguyên tố mà cây hút nhiều nhất, (gấp 1,8 lần N). K ít ảnh hưởng tới sự phát triển của cây so với N và P. Tuy nhiên, thiếu K cây sinh trưởng kém, ít nhiều ảnh hưởng tới việc hút canxi và magie từ đó ảnh hưởng đến độ cứng của thân, cành và chất lượng hoa. - Canxi (Ca): chủ yếu tham gia vào sự tạo vách tế bào và hoạt hóa nhiều loại enzym, có tác dụng tới việc duy trì công năng của màng tế bào và duy trì cân bằng với môi trường bên ngoài. Trong cây, Ca không di động tự do. Nếu thiếu Ca, phần bị hại trước tiên là chóp rễ sau đó là đỉnh ngọn chồi bị xám đen và chết, quanh mép lá non xuất hiện những vết màu tím tối rồi lá khô và rụng, nụ bị teo và rụng (Hoàng Minh Tấn và Nguyễn Quang Thạch, 1993). - Magie (Mg): tham gia vào hoạt chất của nhiều loại enzym và tham gia vào thành phần của chất diệp lục. Thiếu Mg ảnh hưởng tới quang hợp, mặt dưới của gân lá màu vàng, nếu thiếu quá, gân lá sẽ thâm đen, lá bị rụng. - Sắt (Fe): là thành phần của nhiều loại enzym có liên quan tới quang hợp. Nếu thiếu sắt, quang hợp sẽ giảm, lá non thiếu màu xanh. Sắt không di động được trong cây. Triệu chứng thiếu sắt trước hết biểu hiện ở các phần non. Trong đất sắt thường tồn tại ở dạng Fe2O3, cây hút sắt ở dạng FeSO4. Nói chung trong đất sắt không thiếu nhưng do có nhiều hợp chất cây không hút được dẫn tới thiếu. Khi hàm lượng axit phospho cao, sắt không hòa tan được, khi pH trên 6,5 sắt cũng sẽ bị kết tủa (Mai Thị Ngoan, 2009). - Mangan (Mn): không phải là thành phần của diệp lục nhưng có quan hệ chặt chẽ với sự hình thành diệp lục và quá trình quang hợp. Nếu thiếu Mn, quang 7 hợp sẽ giảm. Mn làm tăng hoạt tính của rất nhiều loại enzym. Trong cây, Mn và sắt có tính đối kháng, nhiều Mn thì thiếu sắt, sắt quá nhiều thì thiếu Mn. Khi thiếu Mn, trên lá xuất hiện nhiều vết vàng (Lê Xuân Thiệu, 2007). - Đồng (Cu): có trong các coenzym, trong nhiều loại enzym oxidase, tham gia vào quá trình oxy hóa khử trong cây. Cu có quan hệ rất chặt chẽ với việc hình thành chất diệp lục, quan hệ tới hiệu suất quang hợp đồng thời còn tham gia vào quá trình trao đổi của đường và protein (Mai Thị Ngoan, 2009). 2.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NUÔI CẤY IN VITRO CÂY HOA HỒNG VÀ MỘT SỐ CÂY TRỒNG KHÁC 2.2.1. Nghiên cứu về nhân nhanh in vitro cây hoa hồng và một số cây trồng khác  Nghiên cứu nước ngoài Theo Gerard C. Douglas et al. (1989), sử dụng đỉnh sinh trưởng của hoa hồng Queen Elizabeth nuôi cấy trong môi trường MS + 1mg/l BA + 0,1mg/l αNAA + 0,1mg/l GA3 và thấy rằng ở môi trường này tỷ lệ sống là cao nhất, một chu kì cấy chuyển là 3 tuần. Nồng độ BA cao có ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng của chồi và rễ. Theo Robert et al. (1990), tiến hành nuôi cấy in vitro giống hoa hồng nhị bội Rosa Wichuraiana trong môi trường lỏng chứa 0,005 Colchicine trong 12h, sau 7 ngày, hình thành khối tế bào tứ bội (4n) chiếm 32,7% từ đó có thể tạo ra giống mới có ý nghĩa trong công tác lai tạo giống. Theo G. Y. Wang et al. (2002), đã nghiên cứu cảm ứng ra hoa của hoa hồng trong nuôi cấy in vitro. Thí nghiệm được bố trí, các cây con được nuôi trong ống nghiệm với môi trường MS cơ bản có bổ sung 400 mg/l- myo-inositol và phytohormone kết hợp với chất điều tiết sinh trưởng khác nhau như sau: BA kết hợp với α-NAA; Thidiazuron (TDZ) với α-NAA và zeatin (ZT) với α-NAA. Kết quả cho thầy, tỷ lệ mẫu có hoa cao nhất là 49,1% và 44,1% trong môi trường bổ sung 0,5 mg/l TDZ và 0,1 mg/l α-NAA hoặc 0,5 mg/l ZT và 0,1 mg/l α-NAA cho kết quả tương tự. Nụ hoa được phát sinh từ ngày thứ 15 đến 30 trong môi trường nuôi cấy và phát triển hoa bình thường. Nghiên cứu cũng cho thấy môi trường nuôi cấy ban đầu và thời gian nuôi cấy trước ra hoa là hai yếu tố quan trọng cho việc rạo hoa in vitro. Các cây trồng 156-561 ngày từ môi trường gốc và nuôi cấy trong môi trường ra hoa trong 45 ngày là tốt nhất cho việc tạo hoa. Theo Soomro et al. (2003), để tạo rễ của cây Rosa indica đã sử dụng 0,6 mg/l 8 IBA và 0,1 mg/l α-NAA sau khoảng thời gian 12 tuần thì rễ sẽ tăng 50%, để tạo chồi của cây Rosa indica đã sử dụng 2,0 mg/l IBA và 2,0 mg/l IAA sau khoảng 12 tuần tỷ lệ chồi 70%. Theo kết quả của Roy et al. (2004), khi sử dụng 1 mg/l và 0,5 mg/l IAA để tạo rễ cho cây Rosa sp thì sau 4 tuần đã cho kết quả cao (85% rễ của cây Rosa sp được tạo ra). Theo Ali Nikbakht et al. (2005), nghiên cứu về khả năng tái sinh của hai giống hoa hồng “Azaran” và “Ghamsar” trong ống nghiệm của BA, α-NAA, GA3 đến sinh trưởng của chồi. Nhóm tác giả đã kết hợp các chất trên với các nồng độ khác nhau. Số lượng chồi cao nhất đạt được trên môi trường MS có bổ sung 1-2 mg/l BA; 0,1 mg/l GA3; 0 – 0,1 mg/l α-NAA đối với giống “Azaran” và 1 – 2 mg/l BA; 0,1 mg/l GA3 đối với giống “Ghamsar”. Theo Al-Khalifah et al. (2005), nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường sucrose lên sự sinh trưởng của hoa hồng (Rosa hybrid L.) trong ống nghiệm cho thấy, khi sử dụng 3,0 mg/l BA kết hợp với 2,0 mg/l kinetin và 40 g/l sucrose thì cây Rosa hybrid có tỷ lệ chồi tăng 71,1%. Theo Zohreh Jabbarzadeh and Morteza Khosh-Khui (2005), nghiên cứu Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô của hoa hồng Damask (Rosa damascena Mill.). Nghiên cứu này đã được tiến hành để đánh giá khả năng tái sinh của hoa hồng Damask. Các mẫu được khử trùng bằng 10% clorox trong 15 phút và nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung với nồng độ khác nhau BA hoặc kinetin riêng biệt hoặc kết hợp với các nồng độ IBA. Sự kết hợp của BA 2,5-3 mg/l và IBA 0,1 mg/l là nồng độ thích hợp nhất cho sự tăng sinh. Một số thí nghiệm đã được thực hiện để kích thích sự ra rễ trong ống nghiệm của hoa hồng Damask. Nghiên cứu trong môi trường khác nhau như MS, 1/2 MS, 1/3 MS và 1/4 MS với nồng độ khác nhau của acid indolo-3-acetic (IAA), IBA và NATPT không đạt được kết quả khả quan. Phương pháp nhân nhanh sử dụng các giải pháp IAA, IBA và αNAA đã khử trùng 0-2000 mg/l. Các phương pháp điều trị khác như sử dụng các nồng độ khác nhau của abscisic acid (ABA) kết hợp với các nồng độ khác nhau của IAA, IBA và NAA, và sử dụng các nồng độ khác nhau của sucrose và agar không tạo ra bất kỳ rễ nào. Cách xử lý tốt nhất để rễ của chồi là 2,5 mg 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) trong 2 tuần trong môi trường MS và sau đó chuyển các mẫu đến môi trường MS mà không có bổ sung chất điều tiết tăng 9