Tài liệu Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác định dư lượng kháng sinh trong sữa​

GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----------------------------------------- ĐẶNG THỊ THU PHƯƠNG NGHIÊN CỨU, SÀNG LỌC VÀ THU NHẬN APTAMER ĐẶC HIỆU KHÁNG SINH STREPTOMYCIN VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn:PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN Viện Công nghệ sinh học Hà Nội – 12/2015 Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 1 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn MỞ ĐẦU *** Kháng sinh có vai trò quan trọng trong chăn nuôi giúp tăng hiệu quả, thúc đẩy tăng trưởng, ngăn ngừa bệnh tật. Streptomycin là một kháng sinh aminoglycoside có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp bình thường protein của vi khuẩn, thường xuyên được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để phòng chống bệnh cho gia súc. Phổ kháng khuẩn của streptomycin bao gồm vi khuẩn Gram âm hiếu khí và một số vi khuẩn Gram dương; streptomycin không có tác dụng với vi khuẩn yếm khí. Streptomycin có hoạt tính đặc biệt chống M.tuberculosis và M.bovis. Streptomycin cũng có hoạt tính chống một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm hiếu khí như : Brucella, Francisellatularensis, Yersinia pestis, Escherichia coli,… Tuy nhiên bên cạnh những mặt có lợi, streptomycin cũng gây ra nhiều tác hại như gây dị ứng, rối loạn cơ quan chức năng thần kinh, thính giác, tạo máu,…Thêm vào đó, việc sử dụng streptomycin trong nông nghiệp có liên quan đến sự gia tăng hiện tượng kháng kháng sinh nguy cơ tiềm tàng tác động đến sức khỏe con người. Do đó, tồn dư kháng sinh trong môi trường và thực phẩm hiện nay đang là vấn đề rất được quan tâm Hiện nay, có ba phương pháp chủ yếu để xác định dư lượng kháng sinh. Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LCMS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các cơ quan thẩm quyền của các nước nhập khẩu chấp nhận. Tuy nhiên, những phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận hành, kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy, nó không phù hợp với các phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm gần đây, cách tiếp cận mới về phương pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (enzyme linked immunosorbent assay ELISA) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận cho phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (quyết định Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 2 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư lượng các chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo, các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Một trong các phương pháp hiện nay đang được tập trung nghiên cứu để xác định dư lượng kháng sinh là phương pháp aptasensor (sử dụng aptamer tham gia cấu tạo sensor) điện hóa. Aptamer là các oligonucleotide (các acid ribonucleoic, RNA và các sợi đơn của acid deoxyribonucleic, ssDNA) hoặc là các phân tử peptide có cấu hình không gian đặc trưng và có khả năng nhận biết và gắn kết với các phân tử đích tương đương kháng thể đơn dòng. Aptamer đã trở thành lớp chất có nhiều tiềm năng và hy vọng nhất để tạo KIT chẩn đoán và thuốc điều trị hướng đích,.. Với những ưu điểm vượt trội, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sử dụng aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin nhằm tạo KIT xác định nhanh kháng sinh này trong thực phẩm. Aptasensor là một Biosensor, một thiết bị phân tích có khả năng chuyển một tín hiệu sinh học thành một tín hiệu quang hoặc tín hiệu điện. Đối với aptasensor điện hóa bao gồm các yếu tố thành phần: (1) Phần nhận biết sinh học đối với aptasensor là aptamer; (2) Phần chuyển đổi và khuếch đại tín hiệu nhận biết thành tín hiệu điện có thể định lượng; (3) Phần xác định cường độ tín hiệu điện. Từ kết quả liên quan tới tín hiệu điện có thể suy ra lượng chất phân tích cần xác định. Biosensor theo nguyên lý điện hóa hoạt động theo nguyên lý chuyển hóa trực tiếp một hiện tượng sinh học thành tín hiệu điện để có thể đo được bằng các thiết bị điện. Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi tiến hành đề tài: “nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin và ứng dụng để xác định dư lượng kháng sinh trong sữa” Mục tiêu đề tài : Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 3 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn - Xây dựng được quy trình sàng lọc các aptamer (có bản chất DNA) có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin. - Tách dòng và chọn dòng các aptamer gắn kết đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Xác định trình tự và xây dựng cấu trúc bậc 2 của các aptamer thu nhận được - Xây dựng quy trình ELISA phát hiện dư lượng streptomycin trong sữa Nội dung nghiên cứu: - Chuẩn bị thư viện DNA có độ đa dạng khoảng 1015 phân tử - Sàng lọc Aptamer đặc hiệu với kháng sinh streptomycin - Tách dòng và chọn dòng các aptamer thu được có ái lực cao với kháng sinh đích - Sử dụng phương pháp ELISA để phát hiện dư lượng kháng sinh streptomycin CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU *** Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 4 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn 1.1.Tổng quan về streptomycin 1.1.1. Kháng sinh streptomycin Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Từ “antibiotics” (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ “antibiosis”. “anti” có nghĩa là “chống lại” và “biosis” có nghĩa là “cuộc sống”. Chất kháng sinh tác động, chống lại một số loại vi khuẩn. Thật vậy, chất kháng sinh là chất hoá học lấy từ cơ thể các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, hoặc một vài thực vật. Streptomycin là aminoglycoside đầu tiên được sản xuất thương mại và được phân lập từ chủng Streptomyces griseus năm 1944 và sử dụng rất hiệu quả trong điều trị bệnh lao. Các streptomycin đều tạo muối với acid vô cơ. Các loại muối kháng sinh thường gặp là sunfat, clohydrat, photphat và có cả phức canxi clorua của streptomycin clohydrat. Các muối này hoà tan trong nước, hầu như không tan trong clorofooc, cồn và ethel. Tên quốc tế : Streptomycine Loại thuốc: kháng sinh nhóm aminoglycoside Streptomycin là kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng diệt khuẩn bằng cách ngăn cản quá trình tổng hợp bình thường protein của vi khuẩn Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 5 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Hình 1.1. Cấu trúc streptomycin và dihydrostreptomycin Họ thuốc penicillins Chất hoạt động n amoxicillin 7 ampicillin 4 benzylpenicillin Họ thuốc Chất hoạt động n chlortetracycline 6 oxytetracycline 6 9 dihydrostreptomycin 3 cloxacillin 7 gentamycin 1 nafcillin 2 kanamycin 1 penethamate 2 neomycin 3 streptomycin 2 tetracyclines aminoglycosides Bảng 1.1 Phân loại (n : loại nhóm) các hợp chất hoạt động có trong thuốc thú y được đăng ký ở Bỉ áp dụng để quản lý quá trình sản xuất sữa bò. ( 5/8/2010 - Anon.) Trong thú y thường dùng streptomycin sulfat. Trong đó hàm lượng Dihydro streptomycin chiếm 79,87%.  Tác dụng: Tác dụng trên các cầu khuẩn gram (+) kháng penicilin, tụ cầu khuẩn, đóng dấu, nhiệt thán, phế cầu, liên cầu (có tác dụng hiệp đồng với kháng sinh nhóm β lactam) Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 6 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Tác dụng chủ yếu đối với vi khuẩn gram (-). Đặc biệt nhạy cảm là: vi khuẩn tụ huyết trùng, E.coli, shigella (lỵ), pseudomonas, salmonella (vi khuẩn thương hàn), Haemophilus, Brucella. Đặc biệt tác dụng đối với trực khuẩn lao, brucella và các xoắn khuẩn (leptospira) Vi khuẩn kháng streptomycin: khuẩn kỵ khí, trực khuẩn mủ xanh và 1 số nấm bệnh. Hấp thu nhanh qua mao mạch và thải trừ qua thận sau khi tiêm nồng độ streptomycin cao nhất trong máu vào giờ thứ 2. Thải trừ nhanh qua thận 50-70% và sau 12 giờ thải trừ hết. Ứng dụng điều trị: Người ta thường kết hợp streptomycin với các sulfamid hay với các thuốc khác để trị các bệnh viêm nhiễm do vi khuẩn gây ra. Theo chỉ thị mới nhất của bộ Y tế, hiện nay không dùng streptomycin cho đường tiêu hóa. Streptomycin gây ra phản ứng mẫn cảm ở da thường xuất hiện vào tuần thứ 2 và 3. Hết sức thận trọng để chọn liều thích hợp với người bệnh suy thận. Với người tăng ure huyết trầm trọng, một liều đơn có thể tạo nồng độ thuốc cao trong máu vài ngày và có thể tích luỹ gây độc trên tai. Khi điều trị dài ngày bằng Streptomycin, kiềm hoá nước tiểu có thể giảm thiểu hoặc ngăn ngừa kích ứng thận. Trẻ em không được dùng Streptomycin vượt quá liều đã khuyến cáo vì đã gặp hội chứng ức chế thần kinh trung ương ở trẻ dùng quá liều.[2,3,12,13] Kháng sinh streptomycin và đồng phân của nó, dihydrostreptomycin được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở gia súc, cừu, lợn và gia cầm. Chúng là nhóm aminoglycoside chủ yếu hoạt động chống lại các vi khuẩn gram âm và tác động chủ yếu vào quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn qua việc gắn vào các ribosome nhân sơ. Các chủng mẫn cảm gồm Actinomyces bovis, Pasturella spp., E.coli, Salmonella spp., Campylobacter fetus, Leptospira spp., và Brucella spp., Mycobacterium tuberculosis. Streptomycin cũng được sử dụng để trị các bệnh do vi khuẩn ở ong mật, như bệnh European foulbrood gây ra bởi Melissococcus pluton, Streptococcus apis và Bacillus olvei. Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 7 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Mục đích sử dụng khác của streptomycin là kiểm soát Fireblight, một bệnh tàn phá do vi khuẩn, gây ra bởi Erwina amylovora, ảnh hưởng đến cây ăn quả trong mùa ra hoa.[18] 1.1.2. Cơ chế tác động của kháng sinh streptomycin lên vi khuẩn Streptomycin là thuốc diệt khuẩn, ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức ribosom. Streptomycin gắn đặc hiệu vào tiểu phần 30s của ribosom ở vị trí P10. Do vậy, mã bị đọc sai, gây tổng hợp và tích lũy protein sai lạc, kìm hãm vi khuẩn phát triển. Streptomycin gây rối loạn cả quá trình tổng hợp khâu khởi đầu, kéo dài đến kết thúc, do có thể những P8 và P11... cũng gắn vào Streptomycin. Ngoài ra còn có cơ chế khác như: thay đổi tính thấm màng, hô hấp tế bào, đến DNA của vi khuẩn. Hình 1.2. Kháng sinh tác động đến sự tổng hợp protein 1.1.3. Kháng sinh trong chăn nuôi 1.1.3.1. Tác dụng của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 8 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh là rất phổ biến. Nó được sử dụng với 3 mục đích: điều trị bệnh, phòng bệnh và dùng như chất kích thích sinh trưởng đem lại những lợi ích sau: - Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm - Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóng với sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn. - Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh - Phòng các bệnh mạn tính và ngăn chặn xảy ra những dịch bệnh do vi trùng - Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi [16] Thuốc kháng sinh đã được sử dụng trong ngành công nghiệp sữa trong hơn 5 thập kỷ. Chúng được dùng chủ yếu để điều trị các bệnh lây nhiễm ở bầu vú (bò, cừu,…, và cũng được dùng để điều trị các bệnh khác (STEAD et al. 2008). Sự điều trị cho kháng khuẩn cho những động vật tiết sữa có thể dẫn đến sự tồn dư thuốc trong sản phẩm sữa. Sự tồn tại của dư lượng kháng sinh trong thành phần sữa là mối nguy hại tiềm ẩn đối với người tiêu dùng vì các phản ứng dị ứng, ảnh hưởng xấu cho đường ruột và nguy cơ kháng khuẩn trong cộng đồng (LINGE et al. 2007). Những thiệt hại lớn về kinh tế cũng xuất hiện trong các sản phẩm lên men do sự kìm hãm hoạt động của vi khuẩn (ALTHAU et al. 2003). Bởi dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật đặt ra mối nguy tiềm ẩn cho người tiêu dùng, theo quy định của châu Âu the Commission Regulation No.37/2010 quy định các giới hạn (MRL) cho các sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc động vật. MRL là nồng độ tối đa dư lượng của một chất có hoạt tính dược học được cho phép tồn tại trong thực phẩm. Dư lượng thuốc trong thực phẩm được kiểm soát và điều chỉnh theo the Council Directive 96/23/EC of 29 April 1996, về định lượng các chất trong động vật sống và sản phẩm từ động vật 1.1.3.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở một số quốc gia Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 9 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn * Trên thế giới ở Mỹ, hàng năm có khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong chăn nuôi. Xấp xỉ 80% gia cầm, 70% lợn, 70% bò sữa và 60% thịt bò ở Mỹ được nuôi dưỡng bằng thức ăn có bổ sung kháng sinh và cứ mỗi một USD chi phí cho kháng sinh dùng trong thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2 – 4 USD. Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu pao (9270 tấn), trong đó kháng sinh nhóm ionophore và arsen chiếm nhiều nhất (47,5%), tetracycline (15,67%), penicillin (4,26%) và các loại khác (32,57%). Trong số 20,42 triệu pao, có khoảng 2,8 triệu pao (13,7%) được dùng như chất kích thích sinh trưởng. Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong nhân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10.500 tấn (quy theo mức 100% tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong nhân y, 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. *Tại Việt Nam Theo tổng hợp việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y ở Việt Nam – TS. Nguyễn Quốc Ân – Phó trưởng phòng Quản lý thuốc, Cục thú y, Bộ phát triển nông nghiệp và nông thôn.Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở một số trang trại chăn nuôi tập trung trên địa bàn tỉnh Hưng Yên, Hà Tây tại 30 trang trại chăn nuôi lợn thịt và 30 trang trại chăn nuôi gà thịt cho thấy: - 100% các trang trại chăn nuôi có sử dụng kháng sinh, với mục đích chủ yếu để trị bệnh (63,3% với lợn thịt, 50% với gà thịt); với mục đích phòng và trị bệnh (13,3% với lợn thịt, 46,7% với gà thịt) - 60,3% mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt, 70,3% mẫu thức ăn chăn nuôi gà thịt phát hiện ít nhất có một trong số các loại kháng sinh thuộc nhóm tetracycline và tylosin trong đó có một mẫu thức ăn chăn nuôi lợn thịt có hàm lượng tylosin vượt giới hạn cho phép. Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 10 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở 55 trại chăn nuôi lợn tại 2 tỉnh Đồng Nai và Bình Dương: - 44,05% trại chăn nuôi lựa chọn kháng sinh dựa vào triệu chứng bệnh của đàn lợn và kinh nghiệm của người nuôi, 33,33% trại sử dụng thuốc theo chỉ định của thú y viên và 16,67% sử dụng thuốc theo thông tin và khuyến cáo của nhà sản xuất, chỉ có 5,95% trại sử dụng thuốc theo kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ - Tỉ lệ mẫu thức ăn chăn nuôi có sử dụng kháng sinh lần lượt là : tylosin 31/60 mẫu (51,67%), tetracyclin : 25/60 mẫu (41,16%), oxytetracycylin: 4/60 mẫu (6,6%) và chlotetracycline: 15/60 mẫu (25%) - Số mẫu vượt quá quy định theo 10TCN 861 – 2006: tylosin 1/60 mẫu (1,66%), tetracycline 2/60 mẫu (3,3%), oxytetracyline 1/60 mẫu (1,66%), chlotetracycline 9/60 mẫu (15%) [9,10,11,13] Hình 1.3. Biểu đồ tỉ lệ 13 loại kháng sinh sử dụng nhiều nhất ở 55 trại chăn nuôi tại Đồng Nai, Bình Dương 1.1.4. Dƣ lƣợng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và một số phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng kháng sinh. 1.1.4.1. Dƣ lƣợng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và sữa Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 11 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Từ những năm 1950, việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh bổ sung vào thức ăn gia súc cho thấy chúng có tác dụng kích thích sinh trưởng, tăng cường hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm tỷ lệ chết và còi cọc, tăng khả năng sinh sản. Tuy nhiên, sử dụng thức ăn có bổ sung kháng sinh trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, lượng kháng sinh tồn dư này có thể gây dị ứng, gây bệnh thiếu máu, gây ung thư cho con người sử dụng sản phẩm đó. Đồng thời bổ sung kháng sinh vào thức ăn gia súc sẽ gây hiện tượng lờn thuốc, phát triển các loại vi khuẩn độc hại kháng thuốc. Movassagh chỉ ra rằng 4,66% sữa tiệt trùng của Iran dương tính với dư lượng kháng sinh beta lactam vào năm 2010 Trong một nghiên cứu của Ceyhan và Bozkurt với 200 mẫu sữa thu thập từ vùng Ankara, 5,5% dương tính với dư lượng kháng sinh Aydin và cộng sự nghiên cứu với 204 mẫu sữa ở Thổ Nhĩ Kỳ, 44% phát hiện có dư lượng kháng sinh. Yamaki và cộng sự phân tích 2686 mẫu sữa ở Tây Ban Nha, 1,7% có dư lượng kháng sinh Adesiyun và cộng sự nghiên cứu dư lượng kháng sinh phổ biến trước và sau xử lý sữa bò ở Trinidad, chỉ ra rằng có 10,8% mẫu sữa phát hiện dư lượng. Shitandi (2001) nghiên cứu 1109 mẫu sữa ở Kenya, có 21% phát hiện dư lượng kháng sinh . Vào năm 1988, 71% mẫu kiểm tra từ các trang trại của Mỹ có phát hiện dư lượng kháng sinh Năm 2006, Khaskheli và cộng sự phân tích thấy 36,5% mẫu có dư lượng beta lactam trong sữa bò ở Pakistan ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh được sử dụng tràn lan trong thức ăn cho gia súc và gia cầm, và tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm là phổ biến. Các nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý (không xét nghiệm kháng sinh đồ, sử dụng theo kinh nghiệm, không đúng liều lượng và liệu trình điều trị), một số cơ sở chăn nuôi không ngưng thuốc đúng quy định, bán chạy khi điều trị không hiệu quả. Từ đó dẫn tới tính trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm cao gấp hàng chục tới hàng ngàn lần so với tiêu chuẩn quốc tế (CODEX). Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 12 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Nhiều nghiên cứu trong nước cũng cho thấy tình trạng lờn thuốc của các vi khuẩn gây bệnh với tỉ lệ rất cao, chính vì thế mà dịch bệnh thường xuyên xảy ra và một số loại kháng sinh đặc hiệu cho một số bệnh trên đường hô hấp và đường tiêu hóa đã không còn tác dụng nữa. Quy định về tồn dƣ kháng sinh streptomycin trong thực phẩm 1.1.4.2. Sự tồn dư streptomycin trong thực phẩm có nguồn gốc động vật có thể gây dị ứng. Người ta cũng thấy có sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc khi thực phẩm có dư lượng kháng sinh streptomycin. Các yếu tố kháng thuốc khi truyền vào con người sẽ trở thành nguy cơ tiềm ẩn và có thể làm giảm đáng kể hiệu quả của thuốc kháng sinh chữa bệnh cho người. Trong ngành công nghiệp sữa, sữa có tồn dư kháng sinh có thể phá hoại các sản phẩm lên men như sữa chua hay pho mát do sự kìm hãm các giống khởi động và gây ra thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Cây cối có phun nồng độ cao streptomycin có thể tạo ra chuỗi lan nhiễm từ phấn hoa, mật hoa, ong và cuối cùng là mật ong. Để bảo vệ người tiêu dùng, các nhà chức trách đã thiết lập giới hạn dư lượng cho phép đối với hầu hết các thuốc thú ý được cấp phép sử dụng trong thực phẩm có nguồn gốc động vật. Các giới hạn này dựa trên các dữ liệu độc tố bao quát từ các thử nghiệm y học và đặc hiệu đối với lượng tồn dư thuốc được cho là an toàn và có thể chấp nhận được. Giới hạn dư lượng của streptomycin và dihydrostreptomycin trong thực phẩm được liệt kê ở bảng sau: Bảng 1.2. Quy định giới hạn dư lượng streptomycin và dihydrostreptomycin đối với thực phẩm ở các khu vực trên thế giới[18] Phạm vi Kháng sinh Loài Đặng Thị Thu Phương Giới hạn cho phép (ppb) Mô đích Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 13 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Gia súc (trâu, 200 Sữa Gia súc, cừu, lợn, 500 Cơ gia cầm 500 Mỡ 500 Gan 500 Thận Gia súc, cừu 200 Sữa Gia súc, cừu, gia 500 Cơ cầm, lợn 500 Mỡ 500 Gan 500 Thận Gia súc 200 Sữa Gia súc, gia cầm, 500 Cơ cừu, lợn 1000 Thận 500 Mỡ 500 Gan 2000 Thận 500 Mô ăn được 2000 Thận 500 Mô ăn được bò), cừu streptomycin EU dihydrostreptomycin Streptomycin Codex dihydrostreptomycin streptomycin Gia súc, gia cầm, lợn Gia súc, gia cầm U.S. dihydrostreptomycin Ở Việt Nam, ngày 19/12/2007, Bộ Y Tế đã ban hành quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm kèm Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT, trong đó có giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh streptomycin trong thực phẩm như sau: Bảng 1.3: Giới hạn dư lượng streptomycin và dihydrostreptomycin theo quyết định 46/2007/QĐ-BYT Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 14 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn MRL (µg/kg) Thực phẩm Trâu, bò và cừu Sữa (µg/l) 200 Thịt 600 Gan 600 Thận 1000 Mỡ 600 Lợn, gà Thịt 600 Gan 600 Thận 1000 Mỡ 600 Xác định hoạt chất: tổng dihydrostreptomycin và streptomycin ADI: 0 – 50 µg/kg thể trọng/ngày đối với dư lượng của dihydrostreptomycin và streptomycin - ADI (acceptable daily intake) khối lượng chấp nhận hàng ngày: khối lượng trung bình chất tồn dư có trong một loại mô mà một người có thể sử dụng trong 1 ngày, không gây độc tính - MRL (maximum residue limit) giới hạn tồn dư tối đa: hàm lượng cao nhất mà chất tồn dư được phép có trong một khối lượng mô (µg/kg, UI/lit) Bảng 1.4. Quy định giới hạn dư lượng streptomycin/dihydrostreptomycin trong các sản phẩm sữa [4,5,6,7,8] Quy chuẩn Phạm vi quản lý QCVN 5-1:2010/BYT: Quy Các sản phẩm sữa dạng lỏng: chuẩn kỹ thuật quốc gia đối sữa tươi nguyên chất thanh Đặng Thị Thu Phương Giới hạn tối đa (µg/kg) Phân loại chỉ tiêu 200 A Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 15 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn với các sản phẩm sữa dạng trùng, sữa tươi thanh trùng, sữa lỏng. tươi nguyên chất tiệt trùng, sữa tươi tiệt trùng, sữa tiệt trùng, sữa cô đặc (sữa đặc), sữa cô đặc có bổ sung chất béo thực vật QCVN 5-2:2010/BYT: Quy Các sản phẩm sữa dạng bột: sữa chuẩn kỹ thuật quốc gia đối bột, cream bột, whey bột, sữa bột với các sản phẩm sữa dạng gầy có bổ sung chất béo thực vật 200 A 200 A 200 A 200 A bột. QCVN 5-3:2010/BYT: Quy Các sản phẩm phomat sản xuất chuẩn kỹ thuật quốc gia đối từ sữa tươi nguyên liệu, từ sữa, với các sản phẩm phomat. whey đã qua xử lý nhiệt QCVN 5-4:2010/BYT: Quy Các sản phẩm chất béo từ sữa: chuẩn kỹ thuật quốc gia đối các sản phẩm cream, bơ, dầu bơ, với các sản phẩm chất béo từ chất béo sữa và chất béo từ sữa sữa. dạng phết QCVN 5-5:2010/BYT: Quy Các sản phẩm sữa lên men chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm sữa lên men. 1.1.4.3. Một số phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng kháng sinh Phân tích nhóm kháng sinh trong các nền mẫu sinh học (có nguồn gốc từ động vật) trước đây đã có nhiều tác giả nghiên cứu, có thể kể đến như: xác định định tính theo phương pháp vi sinh vật (Phạm Kim Đăng và cs., 2007; Bogaerts and Wolf, 1980; Myllyniemi et al., 1999), bán định lượng bằng phương pháp ELISA, định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (Chukwuenweniwe et al., 2003), phương pháp Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 16 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn sắc ký lỏng hiệu năng cao (Nguyễn Minh Đức, 2006; Robert and Fischer, 1978)… Trong những năm gần đây, kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ đang được nghiên cứu và áp dụng đối với các nhóm kháng sinh… Với tính ưu việt và chính xác nên chỉ các phương pháp phân tích sắc ký khối phổ mới được coi là phương pháp phân tích khẳng định, có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng, đặc biệt đối với nhóm chất cấm hoặc các chất cần được kiểm soát ở lượng vết hay siêu vết. Tuy nhiên, do tính phức tạp, tính đặc hiệu của phương pháp nên việc ứng dụng, vận hành ổn định và giá thành phân tích luôn là thách thức đối với người làm công tác phân tích. Hình 1.4: Biểu đồ phân bố tỉ lệ các phương pháp phân tích sử dụng để xác định kháng sinh trong thực phẩm (Cháfer-Pericás et al., 2010) Bên cạnh phương pháp chính là sắc ký, phương pháp sinh hóa – công nghệ sinh học, đặc biệt là phương pháp dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể cũng được sử dụng rộng rãi, và có nhiều kết quả ứng dụng. Cụ thể, dựa trên phân loại sáng chế quốc tế IPC (International Patent Classification) của các sáng chế về phân tích dư lượng kháng sinh được đăng ký cho thấy 2 xu hướng nghiên cứu chính là dựa trên hóa tính, lý tính và Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 17 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn phân tích bằng các quá trình có sử dụng enzyme hoặc vi sinh vật chiếm đến 85% tổng số sáng chế đăng ký, các phương pháp khác chiếm 15%. [10,12] Hình 1.5: Biểu đồ tỉ lệ các phương pháp nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh phổ biến nhất theo IPC Các phương pháp phổ biến áp dụng công nghệ sinh học trong chẩn đoán sinh phẩm gồm: - Công nghệ sắc ký miễn dịch (Lateral flow rapid test): sắc ký miễn dịch hay miễn dịch nhanh có ưu điểm là không đòi hỏi thiết bị; cho kết quả nhanh và giá thành vừa phải, vì thế nên thị trường lớn, có nhiều hãng sản xuất tham gia với nhiều sản phẩm chất lượng khác nhau, cạnh tranh cao. Tuy nhiên điểm cần lưu ý là phương pháp này cần phải kiểm soát chặt chẽ về độ nhạy cũng như độ đặc hiệu - Khuếch đại nucleic acid (nucleic acid amplification): có thể áp dụng trong nhiều lĩnh vực với ưu điểm là độ nhạy và tính đặc hiệu cao nên có tiềm năng thị trường lớn. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi thiết bị, quy trình kiểm soát chất lượng và tay nghề cao vì thế phần nào hạn chế phạm vi ứng dụng thực tế - Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enxyme (ELISA – Enzyme linked Immuno Sorbent Assay): dùng kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích, hiện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp và đặc biệt trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 18 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn các sản phẩm thực phẩm. Thị trường tiềm năng hiện nay của phương pháp này là lĩnh vực kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, bệnh nhiệt đới… Phương pháp ELISA có ưu điểm nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, không cần nhân viên chuyên môn cao, chi phí kiểm mẫu thấp do có thể kiểm đồng thời số lượng mẫu lớn. Tuy nhiên, nhược điểm do đây là sinh phẩm nên một số hóa chất phải bảo quản lạnh và có hạn sử dụng nhất định, độ chính xác không cao bằng các phương pháp hóa lý như phương pháp sắc ký vì thế chỉ thích hợp với các phân tích sàng lọc hơn là các phân tích định lượng Hình 1.6: KIT dùng trong sắc ký miễn dịch Với sự phát triển của công nghệ vi điện tử, công nghệ nano và các loại vật liệu mới, các phương pháp đặc tính sinh học trở nên hiệu quả hơn, hướng nghiên cứu cảm biến sinh học đo tín hiệu điện hóa được nhiều nhóm khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Phương pháp này có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, không đòi hỏi nhiều hóa chất, lượng mẫu cần phân tích nhỏ, có khả năng phân tích nhanh theo thời gian, thiết bị nhỏ gọn, sử dụng đơn giản… Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 19 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn Hình 1.7. Hoạt động của biosensor 1.2. Tổng quan về aptamer 1.2.1. Khái niệm Aptamer là các oligonucleotide (chẳng hạn các acid ribonucleoic, RNA và các sợi đơn của acid deoxyribonucleic, ssDNA) hoặc các phân tử peptide có cấu hình không gian đặc trưng và có khả năng gắn kết với các phân tử đích tương đương kháng thể đơn dòng. Các aptamer được xác nhận như một lớp chất thay thế kháng thể đơn dòng bởi các lớp chất có nhiều ưu điểm vượt trội so với kháng thể, như tính ổn định, có khả năng tạo ra trong điều kiện in vitro, không cần tới động vật thí nghiệm, có thể biến tính và hồi tính thuận nghịch, có thể biến đổi hoá học mà không ảnh hưởng tới hoạt tính gắn kết với phân tử đích, có tính bền nhiệt cao. [49,50,51,52] Những nghiên cứu đầu tiên về aptamer xuất hiện vào những năm 90: - Tuerk C., Gold L.: Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990; 249: 505-10 - Ellington Ad, Szostak JW: in vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands, Nature 1990, 346:818-22 Đặng Thị Thu Phương Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17 20 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn