Tài liệu Nghiên cứu sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn streptomyces orientalis

Bộ Coâng Thương Trường Đại Học Coâng Nghiệp Thực Phẩm Khoa Công Nghệ Sinh Học - Kỹ Thuật Môi Trường BAØI TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai Danh saùch thaønh vieân : Nguyễn Tuấn Ngọc 2013100090 Leâ Hoà Thaûo Nguyeân 2008100132 Huỳnh Ngọc Tuyeàn 2008100168 Leâ Thò Thuùy Haèng 2008100110 Tháng 12 -2011 MỤC LỤC 0 I. ĐẶT VẤN ĐỀ 2 II. NỘI DUNG 1. Khái quát về Streptomyces orientalis 3 1.1. Streptomyces 3 1.2. Streptomyces orientalis 3 1.3. Ứng dụng trong sản xuất kháng sinh 4 2. Khái quát về Vancomycin 4 2.1. Sinh tổng hợp 5 2.2. Dược và hóa học 6 2.3. Cơ chế tác dụng 7 3. Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 8 3.1. Chủng giống vi sinh vật 7 3.2. Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 8 3.3. Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 49129 3.4. Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến 9 3.5. Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên men 11 4. Một số ứng dụng khác của Streptomyces 12 4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật 12 4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar 13 4.3 Streptomyces như một vật chủ cho việc tiết ra các protein dị để sản xuất dược sinh học 13 4.4 Vi sinh vật phân giải PhotPho (P) 13 I. KẾT LUẬN 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 15 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, công nghệ sinh học được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế giới. Và trong đó, công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin và các loại hoạt chất ứng dụng 1 trong y học cũng như những lĩnh vực khác phục vụ cho đời sống và nghiên cứu đang có những bước phát triển vượt bậc. Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò quan trọng của mình. Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra còn có khoảng 8.000 chất là do kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp hơn 60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt trong số đó có chất kháng sinh Vancomycin đóng vai trò rất quan trọng, có nhiều ứng dụng trong thực tiễn đời sống hiện nay. Trong cuộc sống bình thường không chừa một ai, vì thế những nhà khoa học cũng như những y bác sĩ không ngừng học hỏi tìm tòi để có thể tìm được ra những phương thức mới để kháng bệnh, và trong đó có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS” của các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học thực hiện, được nhóm tâm đắc nhất và nhóm đã quyết định tìm hiểu cũng như học hỏi phương pháp ở đề tài này. + Mục tiêu : Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 ph hợp với nguyên liệu và điều kiện môi trường khí hậu Việt Nam. + Nội dung nghiên cứu : - Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại và bảo quản chủng Streptomyces orientalis trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp bằng các nguyên liệu trong nước và điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis trong phòng thí nghiệm. - Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản và nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng giống. - Nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men có bổ sung cơ chất. - Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất ở trong nổi lên men nhỏ. 2 - Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin từ dịch lên men chủng Streptomyces orientalis 4912. - Nghiên cứu điều chế vancomycin-Na. II. NỘI DUNG 1. Khái quát về Streptomyces orientalis 1.1 Streptomyces Streptomyces là lớn nhất chi của Actinobacteria và chi nhập của gia đình streptomycetaceae. Hơn 500 loài Streptomyces vi khuẩn đã được mô tả. Cũng như với các Actinobacteria khác, Streptomyces là Gram dương, và có bộ gen với cao GC . được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục HHnh 1.1 nát, nhất Streptomyces sản xuất bào tử, và được Streptomyces ghi nhận về mùi của họ mà kết quả từ sản xuất của một biến động chất chuyển hóa, geosmin. Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi nhất và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (atinomyces). Streptomyces thường sống ở đất và chúng nhận vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng. Chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuộc kháng sinh của thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế. 1.2 Streptomyces orientalis Một loài Streptomyces sản xuất thuốc kháng sinh là Streptomyces orientalis , nay được gọi là orientalis Amycolatopsis, vi khuẩn Streptomyces chủ yếu được tìm thấy trong đất và thảm thực vật mục nát . Streptomyces orientalis ban đầu được tìm thấy trong đất Ấn Độ và Indonesia. Nó được phát triển trên môi trường thạch men một chiết xuất mạch nha và có một nhiệt độ tối ưu là 280C. Streptomyces orientalis sản xuất Vancomycin kháng sinh, được sử dụng để phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là khuẩn tụ cầu. Nó hoạt động bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương. Trong khi 3 Vancomycin có thể hữu ích để ngăn ngừa viêm nhiễm, nó cũng có thể gây ra vấn đề. Nó đã được báo cáo là gây độc cho thận, và trong vài trường hợp gây độc cho tai, đặc biệt là các dây thần kinh thính giác. Do đó, Vancomycin thường được sử dụng như một loại thuốc cuối cùng, chỉ được sử dụng khi không có gì khác. 1.3. Ứng dụng trong sản xuất kháng sinh Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp. - Tại Hàn Quốc năm 2007 phân lập được loại xạ khuẩn Streptomyces sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin. - Tại Nhật năm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột. CKS này có khả năng kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans. Chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml. - Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta còn có thể sử dụng một số biện pháp kĩ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng tạo điều kiện phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh này cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại. 4 Một số loại thuốc kháng sinh 2. Khái quát về Vancomycin Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh, từng được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị được các bệnh nhiễm H nh 1.2 do các chủng vi sinh vật kháng trùng nguyHhiểm HHnh 1.3 methicillin (chất kháng sinh nhiễm -lactam) gây nên. Vancomycin đã được đưa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn được coi HHnh 2.1 là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một mình hoặc phối hợp với các kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng. Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin vẫn được quan tâm, phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả chữa bệnh cao. Hơn nữa nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuộc, do Bộ Y tế đề ra. Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phối hợp với điều kiện kinh tế và môi trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết. Cùng với nó, việc triển khai xây dựng một cơ sở sản xuất kháng sinh này với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 2.1 Sinh tổng hợp Vancomycin sinh tổng hợp xảy ra thông qua tổng hợp protein khác nhau nonribosomal (NRPSs) . Enzyme xác định trình tự axit amin trong quá trình lắp ráp đến 7 mô-đun. Trước khi Vancomycin được lắp ráp thông qua NRPS, các axit amin đầu tiên được sửa đổi. Ltyrosine được sửa đổi để trở thành hydroxychlorotyrosine (-hTyr) và 5 4-hydroxyphenylglycine (HPG) dư lượng . Mặt khác, acetate được sử dụng để lấy 3,5 dihydroxyphenylglycine vòng (3,5-DPG). Tổng hợp peptide Nonribosomal xảy ra thông qua phân biệt các mô-đun có thể tải và mở rộng các protein axit amin, thông qua việc hình thành liên kết amide tại địa điểm liên kết của các phạm vi hoạt động. Mỗi module thường bao gồm một adenylation (A) tên miền, một chất vận chuyển peptidyl protein (PCP), miền và tên miền ngưng tụ (C) hoặc kéo dài. Trong lĩnh vực A, amino axit cụ thể được kích hoạt bằng cách chuyển đổi thành một phức tạp enzyme aminoacyl adenylate gắn liền với một đồng yếu tố 4'-phosphopantetheine bởi thioesterification phức tạp sau đó được chuyển vào miền PCP với việc đẩy AMP. Trong sinh tổng hợp các Vancomycin, lĩnh vực sửa đổi bổ sung có mặt, chẳng hạn như các epimerization (E) miền, được sử dụng isomerizes axit amin từ một lập thể khác, và một tên miền thioesterase (TE) được sử dụng như một chất xúc tác cho tạo vòng và vận hành của phân tử thông qua một thioesterase phân cắt. Một tập hợp các multienzymes (CEPA enzym tổng hợp peptide, CepB, và CepC) chịu trách nhiệm lắp ráp các heptapeptide. (Hình 2). Các tổ chức của CEPA, CepB, và CEP C chặt chẽ tương tự như tổng hợp peptide khác như những chất cho surfactin (SrfA1, SrfA2, và SrfA3) và gramicidin (GrsA và GrsB). Mỗi enzym tổng hợp peptide kích hoạt mã hoá cho các axit amin khác nhau để để kích hoạt từng lĩnh vực. CEPA mã hóa cho mô-đun 1, 2, và 3. CepB mã hóa cho các mơ-đun 4, 5, và 6. và CepC mã hóa cho mơ-đun 7. Sau khi phân tử heptapeptide tuyến tính được tổng hợp, Vancomycin đã phải trải qua thay đổi hơn nữa, chẳng hạn như oxy hóa liên kết ngang và glycosyl hóa. Để chuyển đổi heptapeptide tuyến tính, tám enzyme, open reading frames (ORF) 7, 8, 9, 10, 11, 14, 18, 20, và 21 được sử dụng. Enzyme ORF 7, 8, 9, và 20 là những enzym P450 . Và ORF 9 và 14 được xác định là enzym thủy phân giả định. Với sự gíup đỡ của các enzym này, các nhóm -hydroxyl được giới thiệu trên tyrosine dư lượng 2 và 6, và khớp nối xảy ra trong vòng 5 và 7, vòng 4 và 6, và vòng 4 và 2. Ngồi ra, haloperoxidase được sử dụng để gắn các nguyên tử clo vào vòng 2 và 6 thông qua một quá trình oxy hóa. 6 HHnh 2.2 2.2 Dược và hóa học Vancomycin là một nhánh ba vòng peptide nonribosomal glycosyl hóa được sản xuất bởi quá trình lên men của các loài actinobacteria Amycolatopsis orientalis (trước đây là chỉ định Nocardia orientalis ). 7 Vancomycin exhibits atropisomerism – nó có nhiều hóa học khác biệt rotamers do hạn chế luân phiên của một số liên kết. Các hình thái hiện diện trong thuốc là các mặt nhiệt động ổn định hơn conformer và do đó có hoạt động mạnh hơn. 2.3 Cơ chế tác dụng Vancomycin hoạt động bằng cách ức chế tổng hợp thích hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương. Do cơ chế khác nhau mà theo đó các vi khuẩn Gram âm sản xuất thành tế bào của nó và các yêu tố khác nhau liên quan đến việc đi vào màng ngoài của các sinh vật gram âm, vancomycin không phải là hoạt động chống lại các vi khuẩn Gram (ngoại trừ một số loài do lậu cầu của Neisseria) . Các phân tử ưa nước lớn có thể hình thành liên kết hydro tương tác với các thiết bị đầu cuối D-alanyl-D-alanine moieties các NAM / NAG- peptide. Trong những trường hợp bình thường, đây là một sự tương tác năm điểm . Điều này ràng buộc của vancomycin D-Ala-DAla ngăn chặn tổng hợp thành tế bào trong hai cách: + Ngăn chặn sự tổng hợp của polyme di của N-acetylmuramic acid (NAM) và N-acetylglucosamine (NAG) đã hình thành sợi xương sống của các tế bào vi khuẩn. + Ngăn cản các polyme xương sống để kìm chế sự hình thành, liên kết với nhau. HHnh 2.5 Cơ chế tác dụng của Vancomycin 3. Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 8 3.1 Chủng giống vi sinh vật Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2, các hóa chất dung để phân tích, định lượng và vancomycin chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1, A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48. HHnh 3.1 Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 A. Hình dạng khuẩn lạc, B. Cuống sinh bào tử, C. bào tử. 3.2 Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và đã lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất có thể làm môi trường cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh. HHnh 3.2 Hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 Chủng S. orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose với hàm lượng thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong số 9 các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích hợp. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 là 280C và pH từ 6 đến 8. Lượng giống được cấy vào môi trường lên men thích hợp 6 - 8% so với môi trường lên men. Nghiên cứu động thái quá trình men chủng S. orientalis 9412 cho thấy, sinh khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men. Như vậy, động thái quá trình lên men chủng này có đặc trưng giống như ở các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác. 3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 Trước hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp gay chủng đột biến bằng tia UV. Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ 1-10%, kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng này tăng lên từ 8-30,3% đối với xử lý bào tử và 66,33% đối với xử lý tế bào trần. Khả năng sống sót của tế bào trần và Hoạt tính kháng sinh của các khuẩn bào tử chủng S. lạc chủng S. orientalis 4912 xác định orientalis 4912 sau bằng phương pháp cục thạch (A) và đục khi xử lý UV và lỗ (B) MNNG HHnh 3.3 Sau đó các nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, đó là gây chủng đột biến bằng MNNG. Trên cơ sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH và thời gian xử lý thích hợp để xử lý bào tử và tế bào trần thì tỷ lệ biến chủng của hoạt tính kháng sinh cao hơn chủng gốc là 80,8 và 92,86 %. Kết quả nhận được biến chủng S. orientalis 491281-61 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) của hoạt tính kháng sinh cao nhất là 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên 10 men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866 mcg/ml). 3.4 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến Dựa trên môi trường lên men thích hợp cho chủng S. orientalis 4912, đã tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm của Box-Wilson cho biến chủng S. orientalis 4912-81-61 như sau Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 2 g/l; CaCl2 40 mg/l; CuSO4 10 mg/l. Ảnh hưởng của của các yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%, nhiệt độ lên men tối ưu 28oC và nồng độ pH thích hợp 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (dO2) trong môi trường tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp vancomycin, các thí nghiệm lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61 được thực hiện trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với các điều kiện pH, nhiệt độ và tỉ lệ giống được xác định ở trên. Kết quả xác định sinh khối khô và hoạt tính kháng sinh sau 120 giờ lên men cho thấy, khi dO2 được duy trì ở mức 20-30% thì lượng vancomycin và sinh khối đạt cao nhất, tương ứng bằng 2983 mcg/ml và 9,8 mg/ml. Như vậy, kết quả của các thí nghiệm này cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan và bảo đảm đảo trộn tốt trong bình lên men là điều kiện thiết yếu của sản xuất vancomycin. Để xác định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S. orientalis 4912-81-61 được nuơi trong thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với thành phần môi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng này phát triển tốt trong bình lên men, đặc biệt từ giờ thứ 48 sinh khối của chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml. Cũng tại thời điểm này chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 giờ nồng độ đạt cực đại là 2983 mcg/ml. Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomycin 11 bởi biến chủng S. orientalis 4912-81-61 trên thiết bị Bioflo 5000 3.5 Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên men HHnh 3.4 Quy trình chiết xuất vancomycin Kết quả kiểm tra vancomycin tách chiết từ biến chủng S. orientalis 4912-81-61 bằng sắc ký lớp mỏng trên hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2O (4 : 3 : 7) cho gía trị Rf của các mẫu là 0,75; bằng phương pháp phổ khối Agilent 6310 Ion Trap trên máy HPLC-MS, trọng lượng phân tử là 1449,27 và bằng sắc ký lỏng cao cấp trên máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, thời gian lưu là ở 4,4 phút giống như vancomycin chuẩn (Merck). Sắc ký đồ HPLC cho thấy không có các pic tạp chứng tỏ vancomycin chế phẩm khá tinh sạch, độ tinh khiết đạt 95,4%. 12 Kiểm tra vancomycin bằng Phỏ UV của sắc ký lớp mỏng vancomycin 1. Vancomycin từ Phỏ HPLC của chuẩn (trên) và môi trường nuôi vancomycin chuẩn (trên) vancomycin cấy 2. Vancomycin và vancomycin chủng S. chủng S. được tách chiết và orientalis 4912 (dưới) orientalis 4912 làm tinh khiết; và (dưới) 3. Vancomycin chuẩn (Merck) 4. Một số ứng dụng khác của Streptomyces 4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta có thể sử dụng một số biện pháp kỹ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại. Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ dại… kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc hoá học, dùng các chất CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân huỷ, các tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hoá học. CKS và dịch lên men các chủng sinh CKS còn 13 dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh ở cả các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất. Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biên rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, An Độ… Ở Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng xạ khuẩn từ đất và nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp.201 có khả năng sinh CKS mới là z –methylheptyl iso –nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F.solani… Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F.oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật. 4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar. Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên thành sợi khí sinh thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác nhau tuỳ loài : thẳng, lượn sóng xoắn, có móc, vòng…. Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng 2 phương pháp : phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng tế bào có thể nhẵn, gai khối u, nếp nhăn…. Tuỳ thuộc vào lõi xạ khuẩn với môi trường nuôi cấy. Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza thì bào tử thể hiện đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sinh khí cũng rất khác nhau tuỳ theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram (+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu 14 thường là 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh). Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi và các tế bào ung thư, virus và động vật nguyên sinh. 4.3 Streptomyces như một vật chủ cho việc tiết ra các protein dị để sản xuất dược sinh học Việc sản xuất thương mại protein chữa bệnh hoặc chẩn đoán vi sinh vật lý tổ hợp được quan tâm đáng kể. Một số hệ thống sản xuất protein của vi khuẩn đang được phát triển. Một số chi của các vi khuẩn Gram dương đang được thử nghiệm như là vật chủ lưu trữ để sản xuất protein dị do khả năng tiết ra các protein có hiệu quả trong môi trường nuôi cấy. Trong số đó chi Streptomyces nhiều kể từ khi các loài của nó được biết là tiết ra một lượng protein cao. Vì sự vắng mặt của một hệ thống hạn chế, thay đổi rộng lớn, hoạt động của protease hạn chế về sự sẵn có của hệ thống vector thích hợp, Streptomyces lividans được chọn lựa cho việc tiết của các protein dị. Các kết quả trình bày cho thấy rằng lividans có thể hoạt động như một vật chủ lưu trữ thú vị để sản xuất một số protein hữu ích cho một số bệnh quan trọng trong ngành thương mại dược phẩm trên toàn thế giới như là: ung thư, miễn dịch học, bệnh tim mạch và các bệnh truyền nhiễm. 4.4 Vi sinh vật phân giải PhotPho (P) Trong tự nhiên, P nằm trong nhiều dạng hợp chất khác nhau. Các hợp chất P hữu cơ trong đất có nguồn gốc từ xác động vật, thực vật, phân xanh, phân chuồng… Những hợp chất P hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành những hợp chất P vô cơ khó tan, một số ít được tạo thành ở dạng dễ tan. Hợp chất P hữu cơ quan trọng nhất được phân giải ra từ tế bào vi sinh vật là nucleotide. Nucdeotide có trong thành phần nhân tế bào. Nhờ tác động của các nhóm vi sinh vật hoại sinh trong đất, chất này tách ra từ thành phần tế bào và được phân giải thành 2 phần protein và nuclein. Protein sẽ đi vào vùng chuyển hoá và các hợp chất nitrogen, nuclein sẽ đi vào vòng chuyển hoá các hợp chất P. Sự chuyển hoá các hợp 15 chất P hữu cơ thành muối của H3PO4 được thực hiện bởi nhóm vi sinh vật phân huỷ P hữu cơ theo sơ đồ tổng quát sau : Nucleoprotein  Nuclein  Acid.Nucleic  H2SO4 Vi sinh vật phân hủy P hữu cơ chủ yếu thuộc 2 chi Bacillu và Pseudomonas. Các loài có khả năng phân giải mạnh là : B.megaterium, Serratia, B.subtilis, Serratia, Proteus, Arthrobster, ...  Vi khuẩn: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium.  Xạ khuẩn: Streptomyces... III. Kết luận Vancomycin là một kháng sinh nhóm glycopeptid được sử dụng để chữa các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt là các vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin. Kết quả nghiên cứu được xây dựng được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao hơn chủng gốc 344%. Chất kháng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck). Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng 4912: Chủng này có đặc điểm giống loại S.orientales như chủng chuẩn ISP 504 được mô tả, sử dụng hầu hết các nguồn đường, sinh trưởng phát triển tốt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 28-300C, pH thích hợp cho sự phát triển của chủng này từ 6 đến 9, chịu muối đến 6% và không có khả năng tạo xenlulaza. Chủng S. orientalis 4912 cĩ hoạt phổ kháng khuẩn rộng giống lồi Streptomyces orientalis Pittenger & Brigham, ức chế được cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Đã lựa chọn môi trường thích hợp MT 48 làm môi trường cơ sở để nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men. Chủng 4912 có đặc điểm sinh học giống lồi Streptomyces orientalis và hoạt tính kháng sinh cao. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cho thấy nguồn dinh dưỡng thích hợp là saccaroza 3%, bột đậu tương 0,2%, pH 7,0 - 7,5 nhiệt độ 16 lên men 300C và tỷ lệ cấy giống 10%. Lượng sinh khối và kháng sinh cao nhất của quá trình lên men ở 120 giờ nuôi cấy. Đã nghiên cứu sự biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 và nhận thấy, chủng này không có biến động lớn về hoạt tính kháng sinh; không có biến chủng âm tính và được lựa chọn được 1 chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất. Đã lựa chọn được chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912-81-345 có khả năng sinh tổng hợp vancomycin cao và các chủng được đột biến có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn chủng gốc. Đã nghiên cứu và sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần bằng tia UV và nâng cao được hoạt tính của chủng S. orientalis 4912. Được xác định được hoạt tính kháng sinh của các biến chủng sau khi xử lý UV: Hoạt tính kháng sinh của các chủng dương tính đều cao hơn chủng gốc và biến chủng âm đều thấp hơn chủng gốc. Đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men tổng hợp vancomycin của chủng gốc và các chủng đột biến; Nghiên cứu động thái quá trình lên men trên nội lên men 5 lít và 80 lít. Đã nghiên cứu tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 bằng dung môi và các chất hấp phụ, sản phẩm nhận được là vancomycin. Đã nghiên cứu tinh chế và điều chế vancomycin.HC1 và bào chế 2 dạng thuốc : Thuốc tiêm và viên nang. TÀI LIỆU THAM KHẢO (1) http://en.wikipedia.org/wiki/Streptomyces (2) http://www.microbiologybytes.com/video/Streptomyces.html (3) http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/strept.html (4) http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/strept.html (5) http://www.businesschemistry.org/article/?article=82 (6) www.en.wikipedia.org/wiki/Vancomycin (7) www.dspace.isivast.org.vn/dspace/bitstream/123456789/3266/1/dt1.d oc (8) www.scribd.com/doc/35890819/STREPTOMYCES 17 Tạp chí công nghệ sinh học 18