Tài liệu Nghiên cứu sản xuất interleukin 2 người tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào escherichia coli trong điều kiện gmp​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------- Nguyễn Thị Minh Thu NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT INTERLEUKIN-2 NGƢỜI TÁI TỔ HỢP DẠNG CẢI BIẾN TRÊN DÒNG TẾ BÀO ESCHERICHIA COLI TRONG ĐIỀU KIỆN GMP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS. TS. Trƣơng Nam Hải Hà Nội, 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong khóa luận là do chính tôi trực tiếp thực hiện. Các số liệu và kết quả đƣợc công bố trong khóa luận là hoàn toàn trung thực, chính xác và chƣa đƣợc công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên cao học Nguyễn Thị Minh Thu i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS. TS. Trƣơng Nam Hải và TS. Phùng Thu Nguyệt, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian tôi học tập và nghiên cứu. Tiếp đến tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của trƣờng Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật, các thầy, cô của Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy cho tôi trong suốt thời gian tham gia khóa học. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cán bộ nghiên cứu, nhân viên của phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học và Công ty TNHH Vắc xin và Sinh phẩm số 1(VABIOTECH) trực thuộc Bộ Y Tế-Việt Nam đã tận tình chỉ bảo động viên và cho tôi những lời khuyên quý giá trong công việc cũng nhƣ cuộc sống. Và sau cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã hết lòng ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập và công tác. Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên cao học Nguyễn Thị Minh Thu ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..............................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................4 1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới ....................................................4 1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ ........................................................................5 1.3. Tổng quan về Interleukin-2 ..................................................................................6 1.3.1. Cấu trúc của Interleukin-2 ................................................................................6 1.3.2. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2 ............................8 1.3.3. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư ...............................................9 1.4. Hệ biểu hiện E. coli ............................................................................................12 1.4.1. Hệ biểu hiện E. coli BL21 ...............................................................................13 1.4.2. Vector biểu hiện pET22b(+) ...........................................................................14 1.4. Lên men sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống lên men Bioreactor .............16 1.4. Tinh sạch protein bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao .............................17 1.5. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2 .........................19 1.6. Phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP ..............................................................20 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................22 2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................22 2.1.1. Chủng giống và plasmid..................................................................................22 2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................................22 2.1.3. Máy móc và thiết bị .........................................................................................22 2.1.4. Các môi trường và dung dịch ..........................................................................24 2.1.4.1. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein ...............................................24 2.1.4.2. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2 ......................24 2.1.4.3. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC ................................24 iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.1.4.4. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE ............................................24 2.1.4.5. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE ............................25 2.1.4.6. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot ........................................26 2.1.4.7. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA ............................................26 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................27 2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít .....................................................................................................27 2.2.2. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế) .........................................27 2.2.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ....................................28 2.2.4. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2 ..29 2.2.5. Kiểm tra tính đặc hiệu của protein bằng phương pháp Western blot.............32 2.2.6. Kiểm tra độ sạch bằng phần mềm Quantity One ............................................33 2.2.7. Kiểm tra nội độc tố bằng LAL kit ....................................................................33 2.2.8. Xác định hàm lượng protein trong mẫu tinh chế bằng phương pháp ELISA .34 2.2.9. Điện di SDS-PAGE .........................................................................................35 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................37 3.1. Tối ƣu lên men chủng E. coli BL21 IL-2 trên quy mô nồi lên men 5 và 10 lít .38 3.1.1. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 5 lít .......................38 3.1.2. Khảo sát thành phần dinh dưỡng và nồng độ chất cảm ứng ..........................39 3.1.3. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở quy mô hệ thống lên men 10 lít đợt 1 .....42 3.1.4. Lên men chủng E. coli BL21-IL2 ở hệ thống lên men 10 lít đợt 2 ..................46 3.2. Xử lý tiền tinh chế thu hồi IL-2 từ sinh khối tế bào lên men .............................49 3.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC .......................................50 3.4. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2 .........................53 3.5. Xác định độ tinh sạch của protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằngphần mềm Quantity One .............................................................................................................55 3.6. Xác định hàm lƣợng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế ....................57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................58 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................59 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN .............................65 iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC ..................................................................................................................66 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp APS Ampicillin Ammoniumpersulfate AU Absorbance unit BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanhbò) CSE Control standard endotoxin (Nội độc tốchuẩn) CTL Cytoxic T lymphocyte (Tế bào gây độc) dH2O Distilled water (nƣớc khử trùng) DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleicacid dOT Dissolved oxygene tension E. coli Escherichia coli ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (Kĩ thuật chất hấp phụ FBS miễn dịch gắnenzym) Fetal Bovine Serum (Huyết thanh thai bò) HIV Human Immunodeficiency Virus IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside IL-2R Interleukin-2 Receptor (Thụ thể củaIL-2) kDa KiloDalton LAL Limulus AmebocyteLysate MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium PBS PVDF Phosphate Bromide bufferedsaline PolyvinylidineDifloride PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride rhIL-2 Recombinant human Interleukin-2 (IL-2 ngƣời tái tổhợp) SDS Sodium dodecylsulfate SDS –PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gelelectrophoresis TBS Tris buffersaline TEMED N, N, N’, N’ – TetramethylEthylenediamin TFA Trifluoroacetic acid TMB Tetramethylbenzidine v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn TTBS VABIOTECH TweenTris buffer saline Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin và Sinh phẩm số 1 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. 1: Tế bào NK tiêu diệt tế bào ung thƣ ..............................................................6 Hình 1. 2: Cấu trúc không gian của Interleukin-2 .........................................................7 Hình 1. 3: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của Interleukin-2 lên tế bào T [38] ......9 Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của Interleukin-2 .............................................................9 Hình 1. 5: Sự phát triển của tế bào ung thƣ biểu mô thận ...........................................10 Hình 1. 6: Ung thƣ hắc tố ác tính ................................................................................11 Hình 1. 7: Sơ đồ cấu trúc vector pET22b+..................................................................15 Hình 1. 8: Cơ chế kiểm soát biểu hiện gene nhờ chất cảm ứng IPTG ........................16 Hình 1. 9: Lên men trên hệ thống Bioreactor tại phòng đạt tiêu chuẩn GMP ............17 Hình 1. 10: Hệ thống tinh sạch protein HPLC ............................................................18 Hình 3. 1: Sự biểu hiện protein IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống lên men 5 lít .............38 Hình 3. 2: Khảo sát bổ sung thành phần chất dinh dƣỡng và nồng độ IPTG trong quá trình lên men ................................................................................................................42 Hình 3. 3: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 1 .....43 Hình 3. 4: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 10 lít đợt 1............................................................................................45 Hình 3. 5: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 2 .....47 Hình 3. 6: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 10 lít đợt 2............................................................................................48 Hình 3. 7: Kiểm tra sản phẩm tiền tinh chế của 2 đợt lên men trong hệ thống 10 lít .49 Hình 3. 8: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC .............................................51 Hình 3. 9: Kết quả kiểm tra protein IL-2 sau khi tinh sạch bằng hệ thống HPLC ......52 Hình 3. 10: Biểu đồ thể hiện sự kích thích tăng sinh tế bào CTLL-2 của các mẫu IL-2 tái tổ hợp ......................................................................................................................53 Hình 3. 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng của các mẫu IL-2 .................................55 Hình 3. 12: Kiểm tra độ tinh sạch của protein IL-2 bằng Quantity One .....................56 Hình 3. 13: Kết quả độ tinh sạch của IL-2 xác định bằng phần mềm Quantity One ..56 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 3. 14: Hình ảnh kết quả sau khi dừng phản ứng đông gel ..................................57 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3. 1: Giá trị OD mẫu thu đƣợc sau quá trình lên men ........................................40 Bảng 3. 2: Giá trị EC50 và hoạt tính riêng của các mẫu IL-2 .....................................54 vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Sức khỏe cộng đồng và ung thƣ là những vấn đề ngày càng đƣợc quan tâmở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Trong đó, ung thƣ là nguyên nhân chủ yếu gây tử vong cho ngƣời bệnh và đang có xu hƣớng ngày càng gia tăng. Theo ghi nhận của tổ chức Y tế Thế giới (năm 2012), trên thế giới có 14,1 triệu ca ung thƣ mớiđƣợc phát hiện và 8,2 triệu ngƣời chết vì ung thƣ. Ƣớc tính tới năm 2030, mỗi năm sẽ có thêm 25 triệu ca mới mắc bệnh. Tại Việt Nam, theo thống kê của Bộ Y tế, trong năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307, ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ mới là 190.000 ca. Nguyên nhân chính gây ung thƣ là do môi trƣờng bên ngoài cùng với chế độ sinh hoạt hằng ngày chiếm tới 90%. Hiện nay các phƣơng pháp nhƣ phẫu thuật, hóa trị, xạ trị…vẫn là những phƣơng pháp phổ biến nhất trong điều trị ung thƣ trên thế giới. Tuy nhiên, chúng còn một số nhƣợc điểm nhƣ là có thể gây tổn thƣơng cho các tế bào lành, ảnh hƣởng không tốt tới sức khỏe ngƣời bệnh. Ngoài các phƣơng pháp điều trị trên thì liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp chữa trị hứa hẹn mang lại hiệu quả cao. Liệu pháp này có thể tiêu diệt tế bào ung thƣ, khống chế khả năng phát triển nhanh chóng của khối u và không làm tổn thƣơng các tế bào khỏe mạnh, tăng cƣờng khả năng miễn dịch cho bệnh nhân, kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lƣợng sống. Do đó,liệu pháp miễn dịch đƣợc coi là liệu pháp xanh vì có hiệu quả điều trị rõ rệt, không có tác dụng phụ, an toàn và dung nạp tốt, mở ra một hình thức điều trị hoàn toàn mới cho bệnh nhân ung thƣ. Liệu pháp miễn dịch sử dụng cytokine để kích hoạt hệ thống miễn dịch nhằm nhận biết và tiêu diệt các tác nhân gây bệnh.Interleukin-2 (IL-2) là một cytokineđƣợc tiết bởi tế bào lympho T đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Cytokine này tham gia vào quá trình kích thích hệ thống miễn dịch sản sinh ra các dòng tế bào T, đồng thời kích thích sự tăng sinh và biệt hóa các dòng tế bào NK và các đại thực bào nhằm tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể. IL2 đã đƣợc sử dụng điều trị hiệu quả hai loại ung thƣ biểu mô thận và ung thƣ da. Ngoài ra, IL-2 còn đƣợc sử dụng hỗ trợ điều trị các bệnh ung thƣ khác nhƣ ung thƣ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ buồng trứng,… và có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch để chống bệnh nhiễm HIV. Năm 1992, Cục Quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã cho phép sử dụng IL-2 tái tổ hợp trong điều trị ung thƣ. Hiện nay, chế phẩm IL-2 với tên thƣơng phẩm Proleukin® (Aldesleukin) đã đƣợc sản xuất bởi hãng Chiron và thƣơng mại hóa trên toàn thế giới, tuy nhiên giá thành của Proleukin® còn khá cao (khoảng 2,5 nghìn USD/ống 1,3 mg). Tại Việt Nam, việc sử dụng IL-2 tái tổ hợp nói riêng và sản phẩm protein tái tổ hợp trong điều trị nói chung vẫn còn bị bỏ ngỏ và chƣa có sản phẩm protein tái tổ hợp đƣợc triển khai áp dụng hoàn toàn từ quá trình nghiên cứu đến quá trình sản xuất . Để chủ động việc sản xuất IL -2 tái tổ hợp trong nƣớc và giảm giá thành sản xuất với chi phí thấp phục vụ cho việc điều trị bệnh ung thƣ ta ̣i Viê ̣t Nam , việc nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp và chuyển giao sang công ty để sản xuất thử nghiệm là rất cần thiết. Trong quá trình nghiên cứusản xuất IL-2 ngƣời tái tổ hợp, trình tự amino acid của IL-2 đã đƣợc cải biến nhằm tạo ra đƣợc sản phẩm Interleukin-2 có trình tự giống với sản phẩm Proleukin đã đƣợc FDA công nhận. Ngoài ra, việc cải biến trình tự amino acid sẽlàm tăng hoạt tính và tăng tính an toàn cho sản phẩm. Sản phẩm Proleukin còn có tên hóa học là desalanyl-1, serein-125 human interleukin-2 tƣơng ứng đột biến mất alanine ở vị trí amino acid số 1, thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine. Để chuyển giao công nghệ sản xuất IL-2 tái tổ hợp từ quy mô phòng thí nghiệm sang phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, chúng tôi đã tiến hành tối ƣu biểu hiện protein IL-2 trong hệ thống lên men 5 và 10 lít tại Viện Công nghệ sinh học và công ty VABIOTECH. Sau đó, sản phẩm lên men đƣợc tiến hành tiền xử lý và tinh chế bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sản phẩm Interleukin-2 sau tinh chế đƣợc tiến hành xác định hoạt tính sinh học và kiểm tra một số chỉ tiêu về độ sạch và độ an toàn, để đáp ứng yêu cầu của sản phẩm tái tổ hợp sử dụng trong điều trị trên ngƣời với giá thành thấp hơn thƣơng phẩm Proleukin. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất Interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến trên dòng tế bào Escherichia coli trong điều kiện GMP”. Đề tài đƣợc thực hiện tại Công ty Vacxin và Sinh phẩm số 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1, Bộ Y tế và phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình ung thƣ ở Việt Nam và trên thế giới Ung thƣ đang là một căn bệnh hết sức nguy hiểm khiến số lƣợng ngƣời tử vong cao nhất thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization, WHO), trong năm 2008 có khoảng 12,7 triệu ca ung thƣ mới (trong đó 6.672.000 nam giới, 5.779.000 nữ giới) và 7,6 triệu ngƣời đã tử vong do ung thƣ (4.293.000 nam giới, 3.300.000 nữ giới)[31]. Đến năm 2012, có khoảng 14,1 triệu ca ung thƣ mới (trong đó 7.410.000 nam giới, 6.658.000 nữ giới) và có 8,2 triệu ngƣời tử vong (4.653.000 nam giới, 3.548.000 nữ giới) [13], số ngƣời mặc bệnh ung thƣ tăng 11% so với 4 năm trƣớc. Ƣớc tính đến năm 2030 số ca mắc bệnh ung thƣ trên thế giới tăng 70% tƣơng đƣơng với 25 triệu ca mới. Số liệu mới nhất theo thống kê của Hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ (American Cancer Society) cho thấy số ca ung thƣ mới tại Mỹ năm 2015 là 1.658.370 và có 589.430 ngƣời tử vong, số lƣợng này đã giảm 0,43% so với năm 2014 số ca ung thƣ mới là 1.665.540 và số ngƣời tử vong là 589.430 ngƣời. Theo tổ chức nghiên cứu ung thƣ quốc tế (International Agency for Research on Cancer) ƣớc tính trên tổng số ca ung thƣ toàn cầu, có khoảng hơn một nửa số ca ung thƣ và hơn hai phần ba ca ung thƣ sẽ gia tăng và tập trung ở những nƣớc đang phát triển. Những bệnh ung thƣ chủ yếu nhƣ: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ gan, ung thƣ máu, ung thƣ thận, ung thƣ da,… Trong đó ung thƣ thận và ung thƣ da chiếm tỷ lệ khoảng 2 - 3% trên tổng số ca ung thƣ [31]. Việt Nam là một trong những nƣớc đang phát triển, theo đó là sự thay đổi về kinh tế, đời sống đƣợc nâng cao, các bệnh gây tử vong trƣớc đây nhƣ bệnh truyền nhiễm và suy dinh dƣỡng đã giảm mạnh. Vấn đề không dừng lại ở đó, khi kinh tế phát triển nhanh đồng nghĩa với nhiều vấn đề xảy ra nhƣ: ô nhiễm môi trƣờng, chất lƣợng thức ăn, béo phì,… Dẫn đến việc gia tăng các bệnh tật nhƣ tiểu đƣờng, tim mạch và đặc biệt là ung thƣ. Theo nhƣ TS. BS. Bùi Xuân Trƣờng, Bệnh viện Đa khoa Quốc tế VinMec cho biết, so với tỷ lệ chung trên thế giới thì Việt Nam thuộc 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn nhóm nƣớc có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với: ung thƣ phổi, ung thƣ vú, ung thƣ dạ dày, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ gan, ung thƣ đại-trực tràng [62]. Bên cạnh đó tỷ lệ ung thƣ gan tại Việt nam cũng thuộc mức cao nhất thế giới, đặc biệt ở nam giới [62]. Hầu hết các bệnh ung thƣ phổ biến thƣờng gặp tại Việt Nam đều chƣa có xu hƣớng giảm xuống và vẫn đang tiếp tục tăng lên [62]. Ƣớc tính khoảng 85% số bệnh nhân ung thƣ tại Việt Nam đƣợc phát hiện khi đã ở độ tuổi trên 40 [62]. Theo số liệu thống kê của bệnh viện K-Hà Nội và Trung tâm U bƣớu Thành phố Hồ Chí Minh, mỗi năm có 150.000 ngƣời mắc ung thƣ mớitrong đó có 75.000 ngƣời tử vong và tại bệnh viện K, tỷ lệ bệnh nhân mắc ung thƣ hằng năm tăng thêm khoảng 20-30% (PGS. TS. Trần Văn Thuấn, Phó giám đốc bệnh viện K, Viện trƣởng Viện nghiên cứu phòng chống ung thƣ) [63]. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2008, dân số Việt Nam có khoảng 87 triệu ngƣời, số ca ung thƣ mới là 111.600 ngƣời (trong đó 55.000 nam giới, 56.500 nữ giới), có 82.000 ca tử vong (43.700 nam giới, 38.300 nữ giới) chiếm tới 73,5% tổng số bệnh nhân ung thƣ [14].Đặc biệt, theo thống kê mới nhất của Bộ Y tế, trong hội thảo “Phối hợp đa ngành trong phòng chống ung thƣ quốc gia” tổ chức ngày 8-12-2015, tại Hà Nội, trong năm 2010 số ca mắc ung thƣ mới tăng lên tới 126.307 và ƣớc tính đến năm 2020 số ca mắc ung thƣ mới là 190.000 ca [64]. Nhƣ vậy, việc tìm ra các phƣơng pháp phòng và điều trị ung thƣ nhằm giảm thiểu số ca mắc bệnh ung thƣ và tỉ lệ tử vong là rất cấp bách. 1.2. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ Ung thƣ là một căn bệnh nguy hiểm và chiếm tỉ lệ tử vong rất cao, tuy nhiên nó có thể đƣợc chữa khỏi hoàn toàn nếu phát hiện và điều trị sớm bằng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp miễn dịch và liệu pháp gen. Các phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau để đem lại hiệu quả điều trị tốt nhất với mục tiêu là chữa khỏi và giúp kiểm soát hoặc làm giảm nhẹ ung thƣ.Việc chọn lựa phƣơng pháp điều trị phụ thuộc vào từng dạng ung thƣ, vị trí khối u, giai đoạn của bệnh cũng nhƣ thể trạng của bệnh nhân. Các phƣơng pháp điều trị truyền thống nhƣ phẫu thuật, xạ trị và hóa trị đều nhằm mục đích loại bỏ các tế bào ung thƣ, phá hủy chúng bằng thuốc hoặc các tác nhân khác. Tuy nhiên, việc điều trị bằng ba phƣơng pháp này thƣờng gây ra các tác 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn dụng phụ không mong muốn nhƣ làm tổn thƣơng các mô bình thƣờng và các bộ phận khác của cơ thể ngƣời bệnh. Nhiều năm gần đây, những nghiên cứu về hệ thống miễn dịch ngày càng phát triển mạnh. Điều trị ung thƣ bằng liệu pháp miễn dịch là phƣơng pháp kích thích hệ miễn dịch của cơ thể gia tăng số lƣợng các tế bào miễn dịch, đặc biệt là các đại thực bào và tế bào giết tự nhiên (NK) nhằm tăng cƣờng khả năng tiêu diệt tế bào ung thƣ và khống chế khả năng phát triển, di căn của khối u. So với các phƣơng pháp điều trị ung thƣ truyền thống thì liệu pháp miễn dịch có rất nhiều ƣu điểm hơn nhƣ là: (i) an toàn, không gây hại cho cơ thể, không tiêu diệt tế bào khỏe mạnh, không tác dụng phụ, không biến chứng; (ii) tiêu diệt một cách tự nhiên các tế bào ung thƣ di căn, giúp dự phòng ung thƣ, ngăn chặn sự hình thành khối u; (iii) giúp bệnh nhân đang điều trị bằng các liệu pháp khác nhanh chóng hồi phục nhờ có hệ miễn dịch khỏe mạnh [54]. Trong các loại ung thƣ đƣợc điều trị bằng liệu pháp miễn dịch, ung thƣ hắc tố da và ung thƣ thận ác tính đã đƣợc điều trị có kết quả nhờ IL-2 [20]. Hình 1. 1: Tế bào NK tiêu diệt tế bào ung thƣ 1.3. Tổng quan về Interleukin-2 Interleukin-2 (IL-2) ngƣời là một cytokine quan trọng trong hệ thống miễn dịch, đƣợc tiết ra chủ yếu từ tế bào lympho T. IL-2 đƣợc Morgan và cộng sự phát hiện năm 1975 nhƣ là một nhân tố có tác dụng kích thích sự tăng sinh của tế bào T [29]. Năm 1983, gene il-2 đƣợc xác định nằm trên nhiễm sắc thể số 4 ở ngƣời và đƣợc nhân dòng lần đầu tiên [10], sau đó cấu trúc của nó đã đƣợc Taniguchi và cộng sự làm sáng tỏ vào năm 1992 [39]. 1.3.1. Cấu trúc của Interleukin-2 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Interleukin-2 ngƣời là một glycoprotein có khối lƣợng phân tử khoảng 15 kDa. Sản phẩm dịch mã ban đầu của IL-2 gồm 153 amino acid và phải trải qua quá trình biến đổi để tạo protein trƣởng thành. Một đoạn peptide tín hiệu tiết đầu N của protein IL-2 gồm 20 amino acid đã đƣợc cắt bỏ và tạo thành rhIL-2 hoàn chỉnh chứa 133 amino acid [11]. Cụ thể, cấu trúc không gian có 4 chuỗi α – helix đƣợc cuộn theo cấu trúc điển hình của họ cytokine loại 1. Các chuỗi xoắn nối với nhau tạo thành cấu trúc liên kết “up – up – down – down”. Trong đó hai chuỗi xoắn đầu (A, B) đƣợc định hƣớng vị trí “up” (nhìn từ đầu N) và hai chuỗi xoắn sau (C, D) đƣợc định hƣớng ở vị trí “down”. Đoạn nối giữa hai chuỗi xoắn A và B có chứa một chuỗi xoắn α nhỏ. Prolin ở vị trí 65 (Pro65) chia chuỗi xoắn B thành hai phần B và B’. Chuỗi xoắn B nối với đoạn nối C – D bằng việc hình thành cầu nối disulfide giữa 2 amino acid Cys58 và Cys105 tạo cấu trúc ổn định cho IL-2 [16]. Hình 1. 2: Cấu trúc không gian của Interleukin-2 Năm 1987, nghiên cứu của Grace Ju và cộng sự cho thấy có 3 vùng trên phân tử IL-2 có vai trò quyết định hoạt tính sinh học của protein này đó là: (i) vùng tận cùng đầu N (các gốc amino acid 1-20), (ii) vùng tận cùng đầu C (các gốc amino acid 121 -133) và (iii) cầu disulfide giữa hai gốc Cys58 và Cys105. Nếu có đột biến làm mất 20 amino acid ở đầu N và 10 amino acid ở đầu C có thể làm mất 99% hoạt tính sinh học của IL-2 và khả năng liên kết của IL-2 với các thụ thể chúng [21]. Trình tự amino acid của IL-2 ngƣời tự nhiên có chứa 3 gốc Cystein tại các vị trí 58, 105, 125 trong đó hai gốc Cys58 và Cys105 tạo cầu disulfide. Việc hình thành chính xác cầu disulfide này sẽ quyết định hoạt tính sinh học của IL-2 [24]. Sự thay đổi hoặc đột biến ở gốc Cys105 làm phá hủy cầu disulfide và làm giảm 8-10 lần hoạt tính 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn của IL-2, bên cạnh đó sự thay thế hoặc đột biến Cys58 làm hoạt tính của IL-2 giảm mạnh tới 250 lần [24]. Tuy nhiên, đột biến mất gốc Cys tại vị trí 125 chỉ ảnh hƣởng rất ít đến hoạt tính sinh học của IL-2 do nó không tham gia vào việc nhận diện thụ thể của IL-2 và đặc biệt khi thay đổi gốc Cys tại vị trí đó thành Ser không làm ảnh hƣởng tới hoạt tính sinh học của cytokine này [24]. Do vậy, để có thể ngăn cản sự tạo thành cầu disulfide không mong muốn giữa gốc Cys125 với hai gốc Cys58 hoặc Cys105 mà vẫn giữ nguyên hoạt tính của protein thì IL-2 dạng cải biến đƣợc biến đổi gốc Cys125 thành Ser125 [2]. Thêm vào đó, tại đầu N của protein IL-2 có điểm glycosyl hóa đƣợc nhận biết bởi trình tự Ala – Pro – Thr ở 3 vị trí amino acid đầu tiên. Trong tự nhiên IL-2 tồn tại ở trạng thái glycosyl hóa có tính thấm cao với màng tế bào, nếu sử dụng IL-2 liều lƣợng lớn sẽ gây nên độc tính của protein này trong cơ thể bệnh nhân [2]. Vì vậy IL-2 dạng thƣơng phẩm dùng làm thuốc tiêm sẽ có các đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa. Proleukin (Aldesleukin) là một dạng IL-2 thƣơng phẩm đƣợc sản xuất bởi công ty Chiron Hoa Kỳ, và đã đƣợc FDA công nhận có khả năng chữa ung thƣ hắc tố da và ung thƣ thƣ biểu mô thận ác tính vào năm 1992. Sản phẩm thƣơng mại này có trình tự amino acid cải biến bằng cách loại bỏ amino acid alanine ở đầu N và thay thế cysteine ở vị trí 125 bằng serine [46]. Một nghiên cứu trƣớc đây cũng đã chứng minh sự thay đổi của 2 yếu tố trên không làm thay đổi hoạt tính sinh học của protein IL-2 [32]. 1.3.2. Cơ chế hoạt động và chức năng sinh học của Interleukin-2 Trong tự nhiên, IL-2 là một glycoprotein đóng vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch. IL-2 kích hoạt hệ miễn dịch nhận biết và loại bỏ các tế bào ung thƣ, cụ thể IL-2 có khả năng hoạt hóa các tế bào bảo vệ đặc hiệu nhƣ tế bào T, tế bào giết tự nhiên (natural killer-NK) và tế bào gây độc (Cytoxic T lymphocyte CTL), biệt hóa tế bào lympho giết tự nhiên (Lymphokine activated killer-LAK cells). Nhiều nghiên cứu về IL-2 trên thế giới tập trung vào chức năng quan trọng của IL-2 trong hệ miễn dịch cho thấy IL-2 chủ yếu đƣợc sinh ra từ tế bào T CD4+ (tế bào trợ giúp T helper TH), tế bào T CD8+ và tế bào T giết tự nhiên (Natural killer T-NKT cells), ở một số điều kiện đặc biệt, lƣợng nhỏ IL-2 cũng có thể đƣợc tạo ra từ các tế bào dendritic hoạt hóa (activated dendritic cells) [6]. Tế bào T hoạt 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn hóa biểu hiện các thụ thể ở bề mặt của tế bào cùng với sự tiết IL-2, sau đó IL-2 bám vào thụ thể trên tế bào và kích thích sự phân chia tế bào. Khi tế bào T không còn đƣợc kích thích bởi IL-2 thì các thụ thể sẽ phân rã và quá trình tăng sinh kết thúc [44]. Hình 1. 3: Sự kích thích tăng sinh và biệt hóa của Interleukin-2 lên tế bào T [44] Nhờ có sự kích thích tăng sinh các tế bào có khả năng diệt khối u của IL-2, khi cơ thể xuất hiện tế bào bất thƣờng, lƣợng lớn tế bào NKT đã hoạt hóa để tấn công và tiêm những chất làm phân hủy tế bào đích. Cho dù nhỏ hơn tế bào ung thƣ hay thể virus, tế bào NKT thƣờng có thể tiêu diệt cùng lúc 2 hoặc nhiều tế bào ung thƣ. Ngoài ra IL- 2 còn kích thích tăng sinh một số tế bào khác nhƣ tế bào T gây độc CTL, NK và LAK,… Các tế bào này tấn công và phá hủy các mầm bệnh, bao gồm cả ung thƣ [42]. Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của Interleukin-2 1.3.3. Vai trò của Interleukin-2 trong điều trị ung thư 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Interleukin-2 đóng vai trò rất quan trọng trong việc hỗ trợ và điều trị các bệnh ung thƣ. Cho đến nay, IL-2 đã đƣợc công nhận là có hiệu quả trong việc điều trị các bệnh ung thƣ nhƣ: ung thƣ bạch cầu, ung thƣ phổi, ung thƣ buồng trứng, ung thƣ vú,... đặc biệt là ung thƣ hắc tố ác tính (Malignant melanoma) và ung thƣ biểu mô thận (Renal cell carcinoma, RCC) [41]. Bên cạnh đó, IL-2 đã đƣợc chứng minh khi sử dụng với liều lƣợng thấp có khả năng ngăn ngừa chứng rối loạn tăng sinh các tế bào lympho [7]. Năm 1992, IL-2 đã chính thức đƣợc FDA cho phép sử dụng trong điều trị hai loại ung thƣ biểu mô thận và u hắc tố ác tính [35]. Ung thƣ biểu mô tế bào thận là một dạng ung thƣ niêm mạc “ống lƣợn gần” trong thận [47]. RCC chiếm khoảng 90 – 95% các trƣờng hợp ung thƣ thận, bệnh thƣờng xuất hiện nhiều nhất trong độ tuổi 50 – 70 và điển hình là nam giới [23]. Nguyên nhân của ung thƣ thận là do đột biến gen, sử dụng thuốc lá, béo phì, sự phơi nhiễm trong nghề nghiệp, tia xạ,… Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, mỗi năm ở Mỹ có khoảng 31.200 trƣờng hợp ung thƣ thận đƣợc phát hiện, trong đó 11.900 trƣờng hợp tử vong (năm 2006). Mặc dù ở Việt Nam chƣa có số liệu thống kê đầy đủ nhƣng ung thƣ thận đƣợc xếp hàng thứ 3 trong các loại ung thƣ của hệ tiết niệu[55]. Nó có thể di căn trực tiếp sang mô mỡ quanh thận hay dây chằng bao quanh thận, di căn sang các cơ quan khác qua máu hay mạch bạch huyết đến phổi, xƣơng hoặc não. Hình 1. 5: Sự phát triển của tế bào ung thƣ biểu mô thận [56] Ung thƣ thận không phải là một bệnh không thể điều trị, tuy nhiên nếu không đƣợc phát hiện và chẩn đoán sớm bệnh sẽ để lại những hậu quả nghiêm trọng. Từ năm 1994, nghiên cứu của Rosenberg đã sử dụng Interleukin-2 liều cao (High-Dose Interleukin-2, HD IL-2) truyền tĩnh mạch (mỗi liều 720.000 IU/kg, các liều tiêm 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn cách nhau 8 giờ) trong điều trị ung thƣ biểu mô thận trên 283 bệnh nhân. Trong đó, một liệu trình gồm tối đa 15 liều, kết thúc liệu trình nếu bệnh nhân đáp ứng đƣợc sẽ tiếp tục đƣợc điều trị liệu trình thứ hai, kết quả cho thấy 7% bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn với IL-2 và tế bào ung thƣ đƣợc kiểm soát và biến mất toàn bộ, 13% số bệnh nhân có đáp ứng một phần, 76% trong số các bệnh nhân có đáp ứng hết ung thƣ với thời gian trên 7 năm [34]. Hiện nay, liệu pháp điều trị ung thƣ thận bằng IL2 vẫn đƣợc áp dụng rộng rãi trên thế giới. Ung thƣ hắc tố ác tính là một loại ung thƣ da xảy ra khi các tế bào da đặc biệt đƣợc gọi là melanocytes (tế bào biểu bì tạo hắc tố) bị thƣơng tổn do các yếu tố nhƣ mẫn cảm với ánh nắng mặt trời, cháy nắng, từ các vết bỏng rộp, từ các nốt dị thƣờng trên cơ thể hoặc do tiền sử gia đình [48][49]. Nếu các thƣơng tổn này không đƣợc loại bỏ sớm, các tế bào này sẽ phát triển trên bề mặt da và lan sang các mô khỏe (di căn), lúc này việc điều trị sẽ trở nên khó khăn hơn. Hình 1. 6: Ung thƣ hắc tố ác tính [66] Ở Việt Nam, tỷ lệ ngƣời mắc ung thƣ da rất thấp, tuy nhiên trên thế giới tỷ lệ này là không nhỏ. Trong đó, New Zealand là nƣớc có tỷ lệ ung thƣ da cao nhất và là loại ung thƣ phổ biến thứ 4 ở Australia [50]. Năm 2010, Viện ung thƣ Quốc gia đã thống kê ở Mỹ có 68.130 ca mắc ung thƣ mới và có 8.700 ngƣời tử vong vì ung thƣ này; ở Anh, mỗi năm có khoảng 10.000 ngƣời phát hiện mắc ung thƣ da và có 2.000 ngƣời tử vong. Mặc dù, tỷ lệ số ngƣời mắc ung thƣ da là không cao, nhƣng nó lại là bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong rất cao tới 79% [57]. Vì vậy, việc tìm ra một loại thuốc và liệu pháp điều trị phù hợp là vô cùng cần thiết. 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Với hầu hết các loại ung thƣ nếu đƣợc phát hiện kịp thời thì dễ dàng đƣợc loại bỏ bằng phẫu thuật, xạ trị và hóa trị. Đối với u hắc tố, cắt bỏ khối u là lựa chọn tốt nhất, sau khi phẫu thuật bệnh nhân đƣợc chỉ định dùng các chất hỗ trợ điều trị nhƣ interferon-α, Interleukin-2 nhằm ngăn ngừa hiện tƣợng di căn. Đối với ung thƣ da ác tính nếu bệnh nhân có đáp ứng với IL-2 thì bệnh nhân kéo dài thời gian sống ít nhất 10 tháng, trong đó tỷ lệ sống trên 5 năm là hơn 10% [22]. Tuy nhiên, với ung thƣ da ở giai đoạn cuối thì việc điều trị là vô cùng khó khăn. Theo trung tâm kiểm soát và phòng chống dịch bệnh (Centers for Disease Control and Prevention, CDC), tại Mỹ, ung thƣ hắc tố ác tính là bệnh nguy hiểm đứng thứ 3 trong số các bệnh ung thƣ di căn đến não. Nghiên cứu gần đây của Melinda B. Chu đã sử dụng HD IL-2 điều trị các bệnh nhân ung thƣ và theo dõi tại Đại học Saint Louis. Trong quá trình điều trị, bệnh nhân đƣợc truyền IL-2 để kích thích hệ thống miễn dịch nhận diện và tiêu diệt tế bào ung thƣ. Các bệnh nhân đƣợc điều trị từ 2 đến 4 liệu trình là tối đa, mỗi liệu trình gồm có 14 liều HD IL-2. Kết quả cho thấy không có trƣờng hợp nào tử vong khi điều trị, tỷ lệ sống trung bình của các bệnh nhận bị di căn não là khoảng 4 tháng và của bệnh nhân chƣa di căn là 8,7 tháng. Những phát hiện của nghiên cứu mở ra một lựa chọn điều trị mới, sử dụng HD IL-2 cho những bệnh nhân ung thƣ hắc tố di căn não [8]. Ngoài hai ứng dụng chính của IL-2 trong điều trị ung thƣ thận và u hắc tố da, nhờ khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch, IL-2 còn đƣợc nghiên cứu để chống bệnh HIV. Kết quả ban đầu cho thấy đây là dƣợc phẩm an toàn và có hiệu quả khi phối hợp với các liệu pháp khác trong điều trị chống HIV. Cơ chế của IL-2 trong điều trị bệnh nhân nhiễm HIV có thể theo hai hƣớng: (i) giúp bảo vệ hệ miễn dịch khỏi sự tấn công của virus HIV, (ii) giúp cho hệ miễn dịch ức chế sự nhân lên của HIV. Bên cạnh đó, IL-2 còn giúp tăng sinh dòng tế bào CD4+ không bị nhiễm HIV, kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân [40]. 1.4. Hệ biểu hiện E. coli E. coli là một hệ biểu hiện lý tƣởng, dễ thao tác, có thể sản xuất dạng protein tái tổ hợp từ nhiều nguồn gốc khác nhau đồng thời có khả năng thu nhận các vector bản chất là plasmid. Vi khuẩn E. coliđáp ứng đƣợc hầu hết các yêu cầu của một hệ 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn