Tài liệu Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (taxus wallichiana zucc.) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư

“Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư” Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm Mã số: 62 73 01 01 Họ và tên nghiên cứu sinh: Vũ Bình Dương Họ và tên Người hướng dẫn: 1. GS.TSKH. Phan Đình Châu 2. TS. Triệu Duy Điệt Cơ sở đào tạo: Học viện Quân y MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt trong luận án Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………… ….1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................3 1.1. CÂY THÔNG ĐỎ .......................................................................................................3 1.1.1. Tên khoa học . ..................................................................................3 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ..........................................................3 1.1.3. Thành phần hóa học .........................................................................5 1.1.4. Tác dụng sinh học.............................................................................9 1.1.5. Các thuốc điều trị ung thư nguồn gốc từ thông đỏ...........................9 1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT ....................................11 1.2.1. Khái niệm, ưu điểm và khó khăn khi triển khai .............................11 1.2.2. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật ..........................................13 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt chất trong nuôi cấy tế bào thực vật...................................................15 1.3.1. Nhu cầu nguồn nguyên liệu paclitaxel trong điều trị ung thư........21 1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật ......22 1.3.3. Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sử dụng trong đánh giá chất lượng sinh khối tế bào thông đỏ................................ 28 1.3.4. Các phương pháp chiết xuất phân lập paclitaxel từ sinh khối tế bào thông đỏ ............................................................................................29 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.31 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ......................31 2.1.1. Nguyên liệu và hoá chất .................................................................31 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu.........................................................................31 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................32 2.2.1. Xây dựng qui trình tạo sinh khối thông đỏ.....................................32 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học và chiết xuất phân lập một số chất chính, xây dựng TCCS của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ .36 2.2.3. Phương pháp phân tích xử lý kết quả nghiên cứu ..........................41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU........................................................42 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ........42 3.1.1. Tạo callus thông đỏ ........................................................................42 3.1.2. Duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch ..............48 3.1.3. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng ........................................52 3.1.4. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít..............................64 3.1.5. Kết quả nghiên cứu thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ ..............65 3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ............................................................................................................................70 3.2.1. Xác định thành phần hóa học trong sinh khối tế bào thông đỏ......70 3.2.2. Chiết xuất phân lập và nhận dạng một số chất chính trong sinh khối tế bào thông đỏ .........................................................................81 3.2.3. Chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ.....89 3.2.4. Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ và hoạt chất .............................................97 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.............................................................................104 4.1. QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ .......................104 4.1.1. Về nuôi cấy tạo callus thông đỏ ...................................................104 4.1.2. Về duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch .......108 4.1.3. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng ....................111 4.1.4. Về nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bioreactor 5 lít..........124 4.1.5. Về quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ .......................126 4.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ ........................................................................................................................126 4.2.1. Về nghiên cứu thành phần hóa học ..............................................126 4.2.2. Về chiết xuất, phân lập và nhận dạng các chất chính có trong sinh khối tế bào thông đỏ .......................................................................129 4.2.3. Về chiết xuất, tinh chế paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ130 4.2.4. Về kết quả xây dựng TCCS của sinh khối tế bào thông đỏ .........133 KẾT LUẬN ....................................................................................................135 KIẾN NGHỊ ...................................................................................................137 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................................................................................138 TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................139 PHẦN PHỤ LỤC ...........................................................................................155 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Chú thích 10-DAB 10-deacetylbaccatin III 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ACN Acetonitril B5 Môi trường Gamborg BAP 6-Benzyl amino purin Bu (i) Isobutyl Bz Benzoyl CA Caffeic acid cs Cộng sự DCM Dichloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam FA Ferulic acid FE Fungal elicitor (elicitor từ nấm) GA Gibberelic acid HPOL Hydroperoxid lyase HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao HQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao IAA Indole – 3 acetic acid IBA Indole – 3 butyric acid JA Jasmonic acid KL Khối lượng KLK khối lượng tế bào khô Kn Kinetin LQC Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp MeOH Methanol MJ Methyl jasmonic MS Môi trường Murashige - Skoog NAA 1-Naphtalen acetic acid PhL Phenylalanin PL Phụ lục PVP Polivinyl pyrrolidon SA Salicylic acid SD Độ lệch chuẩn SH Môi trường Hildebrandt SKLM Sắc ký lớp mỏng SKTB Sinh khối tế bào Tc Taxuyunnanine C TCCS Tiêu chuẩn cơ sở USP United States Pharmacopeia (Dược điển Mỹ) Xyl Xylosyl DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Tên bảng Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn Trang 42 3.2 Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn. 43 3.3 Thành phần các loại môi trường nuôi cấy 44 3.4 Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy 45 3.5 Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus 45 3.6 Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển 47 của callus 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus 47 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus 48 3.9 Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH 50 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus 51 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào 51 3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus 52 3.13 Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào 53 3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế 55 bào 3.15 Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế bào 55 thông đỏ 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào 56 thông đỏ 3.17 Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát 57 triển tế bào 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào 57 3.19 Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào 58 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào 59 Bảng 3.21 Tên bảng Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm Trang 60 lượng paclitaxel trong tế bào 3.22 Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm 60 lượng paclitaxel trong tế bào 3.23 Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ 61 phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào 3.24 Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào 62 3.25 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose 63 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường 64 3.27 Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít 65 3.28 Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel 67 trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ 3.29 Khảo sát điều kiện pha động 71 3.30 73 Chương trình chạy sắc ký 3.31 Độ lặp lại của hệ thống 74 3.32 Sự phụ của diện tích píc vào nồng độ paclitaxel và baccatin III 75 3.33 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel 76 3.34 Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III 76 3.35 Kết quả xác định độ chính xác 77 3.36 Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III 78 3.37 Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử 78 3.38 Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ 79 3.39 Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu lá thông đỏ tự nhiên bằng HPLC 3.40 Số liệu phổ 13C-NMR của các các chất 1 – 6 81 85 Bảng 3.41 Tên bảng Số liệu phổ 1H-NMR của các chất 1 - 6 Trang 86 3.42 Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau 89 3.43 90 Kết quả chiết xuất paclitaxel với DCM 3.44 Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế 91 paclitaxel 3.45 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ n-hexan sử dụng để tinh 91 chế paclitaxel 3.46 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và 92 hiệu suất tinh chế paclitaxel 3.47 Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 93 3.48 Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 94 3.49 Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các 95 giai đoạn chiết xuất, tinh chế 3.50 Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ 3.51 Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ 3.52 Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông 97 98 98 đỏ 3.53 Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ 99 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) 4 1.2 Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ 5 1.3 Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật 14 1.4 Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian 19 1.5 Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel 23 2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định 37 tính 3.1 Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus 43 3.2 Callus trên các môi trường khác nhau 45 3.3 Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian 46 3.4 Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau 49 3.5 Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch 49 SH 3.6 Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển 53 3.7 Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy 54 3.8 Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong 66 Bioreactor 3.9 Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ 69 3.10 Sắc ký đồ mẫu sinh khối thông đỏ xử lý theo phương pháp chiết 70 lỏng -lỏng (a) và lỏng - rắn (b) 3.11 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha động III sử dụng cột Luna L43 72 3.12 Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b) 72 3.13 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b) 74 3.14 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ paclitaxel và baccatin III 75 Hình Tên hình Trang 3.15 Sắc ký đồ các mẫu phân tích 80 3.16 Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9 89 3.17 Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột 93 3.18 Sắc ký đồ các mẫu paclitaxel 95 3.19 Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ 96 3.20 Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b) 99 Bảng Tên bảng Trang 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn ....................................................42 3.2. Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn...........................................................43 3.3. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy ...................................................44 3.4. Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy ..........................................45 3.5. Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus................................45 3.6. Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển của callus...47 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus ................................47 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus ..............................48 3.9. Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH ..............50 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus .............................51 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào ..................................51 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus.........................52 3.13: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào .............53 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế bào .......55 3.15. Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ ...55 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ ... 56 3.17. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát triển tế bào.. 57 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào...................57 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào. .......................58 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào. ................59 3.21. Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào.................................................................................60 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào .............................................................................................. 60 3.23. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào...............................................61 3.24. Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào........................................62 3.25. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose.............................................63 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường .....................64 3.27. Kết quả nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít ......................................65 3.28. Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ............................................................67 3.29. Khảo sát điều kiện pha động ........................................................................71 3.30. Chương trình chạy sắc ký.............................................................................73 3.31. Độ lặp lại của hệ thống.................................................................................74 3.32. Sự phụ của diện tích píc vào nồng độ paclitaxel và baccatin III .................75 3.33. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của paclitaxel ..........................76 3.34. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của baccatin III .......................76 3.35. Kết quả xác định độ chính xác .....................................................................77 3.36. Tỷ lệ (%) tìm thấy paclitaxel và baccatin III ...............................................78 3.37. Kết quả khảo sát độ ổn định của mẫu thử ....................................................78 3.38. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hóa học SKTB thông đỏ .....................79 3.39. Kết quả định lượng paclitaxel trong sinh khối thông đỏ và mẫu lá thông đỏ tự nhiên bằng HPLC ..............................................................................81 3.40. Số liệu phổ 13C-NMR của các các chất 1 – 6...............................................85 3.41. Số liệu phổ 1H-NMR của các chất 1 - 6.......................................................86 3.42. Kết quả chiết xuất paclitaxel bằng các dung môi khác nhau .......................89 3.43. Kết quả chiết xuất paclitaxel với DCM ......................................................90 3.44. Kết quả khảo sát nồng độ than hoạt tính sử dụng trong tinh chế paclitaxel ...............................................................................................................91 3.45. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ n-hexan sử dụng để tinh chế paclitaxel .....................................................................................................91 3.46. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi tới hàm lượng và hiệu suất tinh chế paclitaxel................................................................................92 3.47. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 1 ........................................93 3.48. Kết quả tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột lần 2 ........................................94 3.49. Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua các giai đoạn chiết xuất, tinh chế ......................................................................................95 3.50. Kết quả xác định độ ẩm trong sinh khối thông đỏ .......................................97 3.51. Kết quả xác định tro toàn phần của sinh khối thông đỏ...............................98 3.52. Kết quả xác định tro không tan trong acid của sinh khối thông đỏ .............98 3.53. Kết quả định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thông đỏ ......................................................................................................99 1 DANH MỤC CÁC HÌNH 1.1. Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) ............................................................. 4 1.2. Cấu trúc các bộ khung taxan cơ bản trong thông đỏ....................................... 5 1.3. Quy trình tạo sinh khối tế bào thực vật.........................................................14 1.4. Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian............................................19 1.5. Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel .....................................................23 2.1. Sơ đồ quy trình chiết xuất SKTB thông đỏ làm phản ứng định tính ............37 3.1. Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus .........................43 3.2. Callus trên các môi trường khác nhau...........................................................45 3.3. Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian.........................................46 3.4. Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau....................................49 3.5. Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch SH ...........49 3.6. Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển........................................53 3.7. Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy..........................54 3.8. Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong Bioreactor ........66 3.9. Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ ..............................................69 3.10. Sắc ký đồ mẫu sinh khối thông đỏ xử lý theo phương pháp chiết lỏng lỏng (a) và lỏng - rắn (b)............................................................................70 3.11. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn paclitaxel và baccatin III trong hệ pha động III sử dụng cột Luna L43 ................................................................................72 3.12. Phổ hấp thụ của paclitaxel (a) và baccatin III (b) .......................................72 3.13. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn (a) và mẫu thử (b). .............................................74 3.14. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ paclitaxel và baccatin III ............................................................................................75 3.15. Sắc ký đồ các mẫu phân tích .......................................................................80 3.16. Cấu trúc hoá học của các chất 1 – 9............................................................89 3.17. Sơ đồ tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột ...................................................93 3.18. Sắc ký đồ các mẫu paclitaxel ......................................................................95 2 3.19. Sơ đồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thông đỏ.............................96 3.20. Hình ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thông đỏ (b)..............99 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) là dược liệu quý phân bố chủ yếu tại khu vực dãy núi Hymalaya. Ở Việt Nam, thông đỏ được tìm thấy tại các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và Thành phố Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m với số lượng cá thể nhỏ. Từ lâu, trong dân gian đã dùng lá của loài cây này để trị hen suyễn, viêm phế quản, nấc, tiêu hoá...; cành và vỏ dùng trị bệnh thực tích, giun đũa; nước sắc của thân non dùng trị bệnh đau đầu... Đặc biệt, trong thông đỏ có thể tìm thấy các hoạt chất có tác dụng ức chế tế bào ung thư như: paclitaxel (taxol), cephalomannin hoặc các chất có thể bán tổng hợp ra các thuốc điều trị ung thư như baccatin III, 10-deacetyl baccatin III, deacetyl taxol…. Tuy nhiên, thông đỏ là loài cây sinh trưởng chậm, trong khi hàm lượng hoạt chất trong cây thấp. Theo tính toán của các nhà khoa học, để điều trị khỏi cho một bệnh nhân cần sử dụng nguồn dược liệu tương đương với 8 cây thông đỏ 60 năm tuổi [125]. Vì vậy, nguồn nguyên liệu từ cây tự nhiên khó đáp ứng đủ nhu cầu điều trị ngày càng tăng, đồng thời việc khai thác từ cây tự nhiên dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơ tiệt chủng loại dược liệu quý hiếm này [125]. Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã nhân giống thành công và trồng rộng rãi thông đỏ tại Đà Lạt để lấy lá sử dụng chiết xuất 10-deacetyl baccatin III làm nguyên liệu bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Hiện nay, Bộ Khoa học Công nghệ đã cho phép triển khai nhiều đề tài, dự án về nghiên cứu chiết xuất phân lập cũng như sản xuất thuốc tiêm paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam nhằm mục đích tạo ra sản phẩm thuốc điều trị ung thư phục vụ cộng đồng. Bên cạnh đó việc ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các hoạt chất từ dược liệu nói chung và thông đỏ nói riêng cũng là hướng nghiên cứu mới có triển vọng [125]. 2 Công nghệ sinh khối tế bào thực vật là công nghệ nuôi cấy các tế bào trong điều kiện vô khuẩn trong ống nghiệm hay các bình nuôi cấy lớn, nhằm mục đích tạo ra khối lượng tế bào từ đó có thể sử dụng để tách chiết các hoạt chất [46], [53]. Công nghệ sinh khối tế bào có ưu điểm so với việc gieo trồng ngoài tự nhiên là: thời gian từ khi nuôi cấy tới khi thu hoạch ngắn, không chịu ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, dịch bệnh, thời vụ; chất lượng nguyên liệu ổn định, hàm lượng hoạt chất có thể được cải thiện hơn so với trồng ngoài tự nhiên. Công nghệ này rất thích hợp cho việc sản xuất các chất trong thực vật có cấu trúc hoá học phức tạp khó tổng hợp bằng con đường hoá học hoặc các chất có hàm lượng thấp trong cây tự nhiên. Từ công nghệ sinh khối tế bào thực vật, các nhà khoa học đã cung cấp cho thị trường những sản phẩm có giá trị phục vụ cho ngành công nghiệp Dược phẩm và thực phẩm [9], [53]. Với mục đích góp phần tạo thêm nguồn nguyên liệu sản xuất paclitaxel từ nguồn dược liệu thông đỏ ở Việt Nam theo hướng ứng dụng công nghệ sinh khối tế bào thực vật, đề tài: “Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) để chiết xuất hoạt chất điều trị ung thư” được tiến hành nhằm các mục tiêu: 1. Xây dựng được qui trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ qui mô phòng thí nghiệm. 2. Xác định được thành phần hoá học, chiết xuất, phân lập một số chất chính và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu sinh khối tế bào thông đỏ tạo ra. 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY THÔNG ĐỎ Cây thông đỏ (Taxus sp.) hay cây thủy tùng được phân bố khắp các vùng ôn đới của Bắc bán cầu, có tuổi đời kéo dài hàng trăm năm. Có nhiều loài thông đỏ trên thế giới trong đó 8 loài được ghi nhận bao gồm: thông đỏ Châu Âu (T. baccata); thông đỏ Thái Bình Dương (T. brevifolia); thông đỏ Canada (T. canadensis); thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis), thông đỏ Nhật Bản (T. cuspidata), thông đỏ Florida – Hoa Kỳ (T. floridana); thông đỏ Mexico (T. globosa) và thông đỏ Himalaya (T. wallichiana) – loài thấy có ở cao nguyên Đà Lạt – Lâm Đồng của nước ta. Ngoài ra, còn có hai giống lai được công nhận: Taxus × media = T. baccata × T. cuspidata và Taxus × hunnewelliana = T. cuspidata × T. canadensis. Tại Việt Nam chủ yếu là loài thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiana Zucc.) phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng (hình 1.1). Ngoài ra tại các vùng Sapa – Lào Cai, Mai Châu – Hoà Bình, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Ba Vì – Hà Nội, Sìn Hồ - Lai Châu còn có thêm loài thông đỏ Trung Quốc (T. chinensis) [1]. Trong luận án này đề cập tới loài thông đỏ Hymalaya (Taxus wallichiana Zucc.) mọc ở Đà Lạt được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu tạo sinh khối tế bào. 1.1.1. Tên khoa học: Taxus wallichiana Zucc., thuộc họ Thông đỏ-Taxaceae. 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Thông đỏ (thông đỏ lá dài, thông đỏ nam, hồng đậu sam) là cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ nhiều cành, lá thường xanh, sắp xếp theo hình xoắn ốc, thường vặn xoắn tại gốc lá tạo thành kiểu 2 hàng. Các lá có dạng thẳng hay hình mũi mác, với dải khí khổng màu lục nhạt hay trắng ở mặt dưới. Các loài phần lớn là đơn tính khác gốc, ít khi đơn tính cùng gốc. Các nón đực dài khoảng 2-5 mm, tung phấn ra vào đầu mùa xuân. Các nón cái bị suy giảm 4 mạnh, chỉ có một lá noãn và một hạt. Khi hạt chín, lá noãn phát triển thành áo hạt nhiều thịt, bao phủ một phần của hạt. Áo hạt khi chín có màu sáng, mềm, nhiều nước và ngọt, chúng bị một số loài chim ăn và nhờ đó mà hạt được phát tán khi chim đánh rơi chúng [3]. Photo by: Vu Binh Duong Hình 1.1. Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) *Nguồn: Tác giả chụp tại Đà Lạt, Lâm Đồng, tháng 5/2008 Tại Việt Nam, thông đỏ phân bố ở các huyện Đức Trọng, Đơn Dương, Lạc Dương và thành phố Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng ở độ cao từ 1.300 m đến 1.700 m (hình 1.1). Khu phân bố là các hẻm núi, cạnh khe suối, nơi cây lá rộng thường chiếm ưu thế, rất ít cây lá kim. Đây là dược liệu có trong sách đỏ. Hiện nay, do nạn phá rừng bừa bãi nên quần thể thông đỏ tự nhiên hiện chỉ còn đếm được ở con số hàng trăm cá thể. Mặt khác, vì đặc tính tái sinh hẹp và thế hệ trung gian hầu như không có nên nguy cơ diệt vong của loài cây thông đỏ rất cao. Hiện nay, tại Đà Lạt đã có nhiều dự án nghiên cứu nhân giống thành công bằng công nghệ nuôi cây mô và giâm cành. Kết quả đã phát triển được hàng chục hecta thông đỏ để thu hái lá dùng trong chiết xuất 10DAB và các dẫn chất khác để bán tổng hợp paclitaxel và docetaxel [6]. Tuy