Tài liệu Nghiên cứu quy trình tách chiết, tổng hợp dẫn xuất và xác định tính chất, hoạt tính của tinh dầu và curcumin từ cây nghệ vàng (curcuma long l.) bình dương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHAN THỊ HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, TỔNG HỢP DẪN XUẤT VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT, HOẠT TÍNH CỦA TINH DẦU VÀ CURCUMIN TỪ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONG L.) BÌNH DƢƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHAN THỊ HOÀNG ANH NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, TỔNG HỢP DẪN XUẤT VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT, HOẠT TÍNH CỦA TINH DẦU VÀ CURCUMIN TỪ CÂY NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONG L.) BÌNH DƢƠNG Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC CÁC CHẤT HỮU CƠ Mã số chuyên ngành: 62 52 75 05 Phản biện độc lập 1: PGS. TS. Trần Lê Quan Phản biện độc lập 2: TS. Trần Thị Minh Phản biện 1: PGS. TS. Trần Thu Hƣơng Phản biện 2: GS. TS. Nguyễn Minh Đức Phản biện 3: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hạnh NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. Trần Thị Việt Hoa 2. GS. TSKH. Trần Văn Sung LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dƣới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã đƣợc thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu. Tác giả luận án __________________________________ Phan Thị Hoàng Anh i TÓM TẮT LUẬN ÁN Luận án đã thực hiện đƣợc một số nội dung sau: Đã xác định hàm lƣợng, thành phần tinh dầu và curcuminoid trong củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Bình Dƣơng, khảo sát quy trình tách curcuminoid kết hợp tách tinh dầu từ củ Nghệ. Đã nghiên cứu quy trình phân lập 3 thành phần curcuminoid là: curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin từ hỗn hợp curcuminoid. Tổng hợp 30 dẫn xuất của curcuminoid, gồm 22 dẫn xuất của curcumin, 1 dẫn xuất của demethoxycurcumin và 7 dẫn xuất của bisdemethoxycurcumin. Trong số đó có 10 dẫn xuất hoàn toàn mới, chƣa từng đƣợc công bố trong các công trình trong và ngoài nƣớc. Các dẫn xuất đều đƣợc định danh và xác định cấu trúc bằng các phƣơng pháp phân tích phổ MS, IR, NMR. Đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa và kháng tế bào ung thƣ của curcuminoid và các dẫn xuất. Curcumin và các dẫn xuất thể hiện hoạt tính mạnh trong thử nghiệm gây độc tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3. Dẫn xuất 19 có hoạt tính cao gấp 38 lần curcumin và có độ chọn lọc rất tốt với chỉ số SI = 26, đồng thời cấu trúc thỏa mãn “quy tắc số 5” (rule of five) của Lipinski nên có nhiều tiềm năng nghiên cứu sâu hơn trong việc phát triển ứng dụng trong dƣợc phẩm. ii ABSTRACT In this thesis, the content and composition of essential oil and curcuminoids from Curcuma longa L. rhizomes collected in Binh Duong province were determined. The combining process for extraction of curcuminoids and essential oil from the rhizomes was studied. The separation and purification of three curcuminoid components was investigated. Thirty derivatives of curcuminoids including 22 curcumin derivatives, 1 demethoxycurcumin derivative and 7 bisdemethoxycurcumin derivatives were synthesized, characterized and determined the structure by the MS, IR, NMR spectroscopies. Among 30 synthesized compounds, there were 10 novel derivatives. Some biological activities including anti-bacterial, anti-fungal, antioxidant and cytotoxic activites of curcuminoids and their derivatives were also examined. Curcuminoids and their derivatives showed potentials in the cytotoxicity against prostate cancer PC3 cell line. Derivative 19, which exhibited thirty-eightfold higher cytotoxicity than curcumin against PC3 cell line, high selectivity index SI = 26 and satisfied Lipinski “rule of five”, promises as a good candidate for further research in finding drug for prostate cancer treatment. . iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Trần Thị Việt Hoa, GS.TSKH. Trần Văn Sung đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian công sức và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức, kinh nghiệm bổ ích trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS. Ronald J Quinn, TS. Phạm Ngọc, TS.V Hoàng (viện Eskitis, đại học Griffith, Queensland, Australia) đã giúp tôi có cơ hội đƣợc thực tập tại Eskitis, đã hƣớng dẫn, tạo điều kiện làm việc tốt nhất và dành cho tôi sự quan tâm, giúp đ to lớn trong thời gian tôi thực tập và sinh sống ở đây. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ban lãnh đạo trƣờng Đại học Bách Khoa, ph ng Sau đại học, khoa Kỹ thuật Hóa học và bộ môn Hóa Hữu cơ đã tạo cho tôi điều kiện thuận lợi để thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS. Phan Thanh Sơn Nam, ThS.Trần Đức Trọng, ThS. Lê Xuân Tiến đã hỗ trợ tôi rất nhiều, cho tôi nhiều góp qu báu trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô đồng nghiệp khác trong bộ môn Hữu cơ đã có nhiều chia s và là những ngƣời bạn luôn đồng hành c ng tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các em sinh viên đã đóng góp trong phần thực nghiệm của luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS. Phạm Thành Quân, PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh, các thầy cô trong hội đồng đánh giá luận án tiến s cấp cơ sở và các phản biện độc lập về những đóng góp qu báu để luận án này đƣợc hoàn thiện hơn. Cuối c ng, xin cảm ơn gia đình tôi, những ngƣời thân yêu đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ, động viên và luôn là điểm tựa tinh thần to lớn để tôi có thể hoàn thành luận án này. iv MỤC LỤC MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 TỔNG QUAN .................................................................................................... 3 1 1.1 Tổng quan về curcumin ...................................................................................... 3 1.2 Một số tính chất hóa l của curcumin ................................................................ 3 1.2.2 Hoạt tính sinh học của curcumin ................................................................. 7 1.2.3 Tính khả dụng sinh học của curcumin ....................................................... 13 1.2.4 Các phƣơng pháp cải thiện tính khả dụng sinh học của curcumin ............ 16 1.3 Các nghiên cứu về tổng hợp và hoạt tính sinh học của dẫn xuất curcumin ..... 18 1.3.1 Các phƣơng pháp tổng hợp một số dẫn xuất của curcumin ....................... 19 1.3.2 Hoạt tính sinh học của các dẫn xuất curcuminoid ..................................... 24 1.4 Giới thiệu về tinh dầu và các phƣơng pháp trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng ......................................................................................... 29 1.4.1 Giới thiệu về tinh dầu củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) ........................ 29 1.4.2 Tổng quan một số nghiên cứu về trích ly curcuminoid từ củ Nghệ vàng ............................................................................................................ 31 THỰC NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 34 2 2.1 Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 34 2.2 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị .......................................................................... 34 2.2.1 Nguyên liệu ................................................................................................ 34 2.2.2 Hóa chất ..................................................................................................... 34 2.2.3 Thiết bị ....................................................................................................... 35 2.3 Nội dung thực hiện ........................................................................................... 36 2.3.1 Nghiên cứu trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Bình Dƣơng .............................................................. 36 2.3.2 Nghiên cứu phân lập 3 thành phần curcumin, DMC và BDMC từ hỗn hợp curcuminoid ........................................................................................ 40 2.3.3 Tổng hợp dẫn xuất pyrazole và isoxazole của curcuminoid ...................... 41 2.3.4 Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu, curcuminoid và các dẫn xuất curcuminoid tổng hợp đƣợc ............................................................... 49 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN ................................................................................. 53 3 3.1 Kết quả nghiên cứu trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng........... 53 3.1.1 Kết quả khảo sát quy trình trích ly curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ vàng .................................................................................................. 53 v 3.1.2 Kết quả phân tích hàm lƣợng và thành phần tinh dầu, curcuminoid thu đƣợc bằng phƣơng pháp GC-MS, HPLC và LC-MS .......................... 54 3.1.3 Kết quả khảo sát trích ly curcuminoid bằng phƣơng pháp đun hồi lƣu trực tiếp có sự hỗ trợ của vi sóng ............................................................... 57 3.2 Kết quả nghiên cứu phân lập 3 thành phần curcumin, DMC và BDMC từ hỗn hợp curcuminoid ........................................................................................ 60 3.2.1 Kết quả quá trình kết tinh lại ..................................................................... 60 3.2.2 Kết quả quá trình sắc k cột phân lập 3 thành phần curcuminoid ............. 62 3.2.3 Kết quả xác định một số tính chất hóa l các thành phần curcuminoid .... 62 3.2.4 Kết quả nhận danh và xác định cấu trúc các thành phần curcuminoid ...... 64 3.3 Kết quả tổng hợp dẫn xuất của curcuminoid .................................................... 66 3.3.1 Nhận xét chung về quá trình tổng hợp ...................................................... 66 3.3.2 Kết quả định danh, xác định cấu trúc các dẫn xuất ................................... 68 3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của tinh dầu, curcuminoid và dẫn xuất ................................................................................................................. 115 3.4.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm và kháng oxy hóa của tinh dầu Nghệ vàng ..................................................................... 115 3.4.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của curcuminoid và dẫn xuất ............................................................................................... 117 3.4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của curcuminoid và dẫn xuất ........................................................................................................... 119 3.4.4 Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của curcuminoid và dẫn xuất ........................................................................................................... 124 4 KẾT LUẬN .................................................................................................... 129 5 CÁC TÀI LIỆU CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ ................................................ 131 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 132 vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [1] ................................................. 3 Hình 1.2. a) Phổ UV-Vis của curcumin. ___ dung dịch curcumin 3,09×10-5 M trong NaOH 0,5M, --- dung dịch curcumin 3,04 × 10-5M trong acetic acid băng; b) Phổ UV-Vis của dung dịch curcumin 4,99 × 10−5 M trong NaOH 0,091M theo thời gian [7] .................................................................... 4 Hình 1.3. Các sản phẩm phân hủy curcumin trong môi trƣờng kiềm [8]........................ 5 Hình 1.4. Phản ứng đóng v ng đề xuất cho curcumin khi phơi sáng (> 400 nm) [11] .................................................................................................................. 6 Hình 1.5. Sự phân hủy của curcumin trong isopropanol (> 400 nm) [11] ................... 6 Hình 1.6. Curcumin tác động vào các giai đoạn khác nhau trong quá trình phát triển ung thƣ [3]............................................................................................... 8 Hình 1.7. Cơ chế đề nghị cho phản ứng tạo phức của curcumin-Fe2+ [40] ................... 10 Hình 1.8. DHZ (4-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-buten-2-one ) – half curcumin ... 11 Hình 1.9. Phản ứng trung hòa gốc tự do của curcumin. ................................................ 13 Hình 1.10. Chuyển hóa sinh học và các sản phẩm chuyển hóa đề nghị cho curcumin trong huyết thanh chuột khi đƣa vào bằng đƣờng i.p.[63] ............ 15 Hình 1.11. 4,4’-di-O-(glycinoyl-di-N-piperoyl)curcumin, 4,4’-di-O-acetyl curcumin và 4,4’-di-O-piperoyl curcumin [107] .......................................... 24 Hình 1.12. Diester của curcumin với valine, glycine, glutamic acid và demethylenate piperic acid [108] .................................................................. 25 Hình 1.13. Các dẫn xuất của curcumin trong nghiên cứu của nhóm Chen [39] ........... 25 Hình 1.14. Sự hình thành gốc tự do ortho-hydroxyphenol [39] ................................... 26 Hình 1.15. Các dẫn xuất trong nghiên cứu của nhóm Selvam [100] ............................ 26 Hình 1.16. Các dẫn xuất trong nghiên cứu của nhóm Zang [92] .................................. 27 Hình 1.17. Các dẫn xuất (4)-(9) trong nghiên cứu nhóm Ishida [90]............................ 27 Hình 1.18. Các dẫn xuất trong nghiên cứu [94] ............................................................ 28 Hình 2.1. Quy trình 1 ..................................................................................................... 37 Hình 2.2. Hệ thống trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng..................................................... 40 Hình 2.3. Phản ứng quét gốc tự do DPPH của chất kháng oxy hoá [139] .................... 49 Hình 3.1. Sắc k đồ HPLC của mẫu curcuminoid thu đƣợc từ quy trình 1 .................. 56 Hình 3.2. Kết quả SKBM của curcuminoid ban đầu và sau kết tinh............................. 61 Hình 3.3. Sắc k đồ HPLC (phụ lục 7a ) của mẫu curcuminoid ban đầu (A) ............... 61 Hình 3.4. SKBM các phân đoạn sau chạy cột (CH2Cl2:CH3OH: 98:2 (v/v))................ 62 Hình 3.5. (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC ............................................................ 62 vii Hình 3.6. Sắc k đồ HPLC của (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC (phụ lục 8)....... 63 Hình 3.7. Phổ UV-vis (trong ethanol) của (A) curcumin, (B) DMC, (C) BDMC ........ 63 Hình 3.8. a) Cấu trúc dẫn xuất 8 (4FPHC), b) SKBM của curcumin (vết 1) và 4FPHC (vết 2) dƣới đèn UV (hệ dung môi DCM:EA 96/4, c) SKBM hiện màu bằng hơi iod. .................................................................................. 68 Hình 3.9. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH (so sánh IC50) của các curcuminoid và một số dẫn xuất............................................................................................ 120 Hình 3.10. Cơ chế đề nghị trong phản ứng trung hòa gốc tự do của curcumin .......... 120 Hình 3.11. Cơ chế trung hòa gốc tự do DPPH thông qua tách H methylene [40] ..... 121 Hình 3.12. Cấu trúc cộng hƣởng của gốc tự do curcumin khi tách H của OH phenol [56]................................................................................................. 121 Hình 3.13. Liên kết H nội phân tử giữa OH và OCH3 trên vòng phenyl của curcumin .................................................................................................... 122 viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Các thông số hoá lý của các thành phần curcuminoid [6] .............................. 4 Bảng 1.2. Tỉ lệ của các thành phần curcuminoid trong một số sản phẩm curcuminoid trên thị trƣờng (phân tích HPLC) [1] ...................................... 33 Bảng 2.1. Danh mục tác chất, điều kiện phản ứng, phƣơng pháp tinh chế từng dẫn xuất ............................................................................................................... 43 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát quy trình tách curcuminoid và tinh dầu từ củ Nghệ ......... 53 Bảng 3.2. Các chỉ số hóa lý của tinh dầu Nghệ vàng ở Bình Dƣơng ............................ 54 Bảng 3.3. Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu Nghệ vàng ở Bình Dƣơng và một số v ng khác Đồng Nai, Quảng Nam, Nghệ An (phụ lục 3) ............ 55 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát điều kiện trích ly curcuminoid có sự hỗ trợ của vi sóng ... 57 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát trích ly curcuminoid theo phƣơng pháp Soxhlet và phƣơng pháp đun hồi lƣu trực tiếp có sự hỗ trợ vi sóng............................... 60 Bảng 3.6. Kết quả quá trình kết tinh lại ......................................................................... 60 Bảng 3.7. Kết quả tính HPLC của hỗn hợp curcuminoid .............................................. 62 Bảng 3.8. Tính chất vật l đặc trƣng của các curcuminoid ........................................... 63 Bảng 3.9. Độ dịch chuyển hóa học (ppm) trong phổ 1H-NMR (dung môi DMSOd6) của curcumin, DMC và BDMC phân lập từ hỗn hợp curcuminoid ........ 64 Bảng 3.10. Độ dịch chuyển hóa học (ppm) trong phổ 13C-NMR của curcumin, DMC và BDMC phân lập từ hỗn hợp curcuminoid ................................... 65 Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất 1 ................................................................................................................... 68 Bảng 3.12. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất 2 ................................................................................................................... 70 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 3...... 72 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 4...... 74 Bảng 3.15. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 5...... 76 Bảng 3.16. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 6...... 77 Bảng 3.17. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 7...... 79 Bảng 3.18. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 8...... 81 Bảng 3.19. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 9...... 83 Bảng 3.20. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 10 ... 84 Bảng 3.21. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 11 ... 85 Bảng 3.22. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 12 ... 86 Bảng 3.23. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 13 ... 88 ix Bảng 3.24. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất 14 ................................................................................................................ 89 Bảng 3.25. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất 15 ................................................................................................................ 91 Bảng 3.26. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR(dung môi CDCl3) của dẫn xuất 16..... 93 Bảng 3.27. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất 17 ................................................................................................................ 94 Bảng 3.28. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất 18 ................................................................................................................ 96 Bảng 3.29. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 19 ... 98 Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CDCl3) của dẫn xuất 20 . 100 Bảng 3.31. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất 21 .............................................................................................................. 101 Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR(dung môi CDCl3) của dẫn xuất 22... 103 Bảng 3.33. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất 23 .............................................................................................................. 105 Bảng 3.34. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất 24 .............................................................................................................. 108 Bảng 3.35. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất 25 .............................................................................................................. 109 Bảng 3.36. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi DMSO-d6) của dẫn xuất 26 .............................................................................................................. 110 Bảng 3.37. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất 27 .............................................................................................................. 111 Bảng 3.38. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất 28 .............................................................................................................. 112 Bảng 3.39. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất 29 .............................................................................................................. 114 Bảng 3.40. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (dung môi CD3OD) của dẫn xuất 30 .............................................................................................................. 115 Bảng 3.41. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml môi trƣờng) của tinh dầu Nghệ vàng Bình Dƣơng, Đồng Nai, Quảng Nam, Nghệ An đối với một số chủng vi khuẩn, vi nấm............................................................................. 116 Bảng 3.42.Giá trị IC50 trong thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp DPPH và MDA của tinh dầu Nghệ vàng Bình Dƣơng và các vùng khác .................................................................................................. 116 Bảng 3.43. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml môi trƣờng) của curcuminoid và các dẫn xuất đối với một số chủng vi khuẩn, vi nấm ............................... 117 x Bảng 3.44. Giá trị IC50 của các curcuminoid và một số dẫn xuất trong thử nghiệm hoạt tính kháng gốc tự do DPPH .............................................................. 119 Bảng 3.45. Hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp MDA của các curcuminoid và một số dẫn xuất .................................................................................... 124 Bảng 3.46. Hoạt tính gây độc tế bào với 3 dòng tế bào Hep-G2, RD, Lu của các curcuminoid và dẫn xuất ........................................................................... 125 Bảng 3.47. Giá trị IC50(M) và SI trong thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào với dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt PC3 và tế bào lành NFF .................... 126 xi DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol ................................................................. 58 Đồ thị 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ R/L ............................................................................. 58 Đồ thị 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian trích ly................................................................. 59 Đồ thị 3.4. Hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp DPPH của các curcuminoid và một số dẫn xuất................................................................ 119 xii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Cur: curcumin DMC: demethoxycurcumin BDMC: bisdemethoxycurcumin THC: tetrahydrocurcumin IR: infrared UV-Vis: ultraviolet - visible MS: mass spectrometry NMR: nuclear magnetic resonance HPLC: high performance liquid chromatography LC-MS: liquid chromatography – mass spectrometry SKBM: sắc k bản mỏng SKC: sắc k cột DCM: dichloromethane MeOH: methanol AcOH: acetic acid EA: ethyl acetate PE: petroleum ether DMSO: dimethyl sulfoxide AAPH: 2,2′-azobis(-amidinopropane) dihydrochloride DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ABTS: 2,2′-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) tnc: nhiệt độ nóng chảy xiii MỞ ĐẦU Cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thuộc họ gừng (Zingiberaceae), đƣợc trồng nhiều ở những v ng khí hậu nóng ẩm nhƣ Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Jamaica, Peru…và Việt Nam. Củ Nghệ vàng từ lâu đã đƣợc sử dụng rộng rãi làm gia vị, chất bảo quản và chất tạo màu trong thực phẩm. Ngoài ra, củ Nghệ vàng c ng là một trong những phƣơng thuốc dân gian hiệu quả trong chữa trị nhiều loại bệnh nhƣ vàng da, các bệnh về gan, dạ dày, u nhọt, viêm khớp…Trong những thập kỷ gần đây có rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc công bố về hoạt tính sinh học và dƣợc học của củ Nghệ vàng c ng nhƣ các thành phần chiết xuất từ củ Nghệ vàng, trong đó curcuminoid và tinh dầu đã đƣợc chứng minh là những thành phần chính tạo nên dƣợc tính cao của củ Nghệ vàng. Việt Nam có nguồn Nghệ vàng phong phú, phân bố ở nhiều tỉnh thành nhƣ V nh Phúc, Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Nghệ An, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Dƣơng… Thành phần, hàm lƣợng curcuminoid và tinh dầu trong củ Nghệ vàng ở các v ng khác nhau có sự thay đổi lớn do ảnh hƣởng của điều kiện khí hậu, thổ nhƣ ng, điều kiện trồng trọt, chăm sóc...Việc nghiên cứu về đặc trƣng củ Nghệ vàng của mỗi v ng sẽ giúp đánh giá đầy đủ hơn giá trị sử dụng, từ đó có đƣợc sự định hƣớng tốt hơn cho việc phát triển nguồn Nghệ vàng trong nƣớc. Các nghiên cứu về Nghệ vàng ở trong nƣớc cho đến nay chủ yếu mới chỉ tập trung ở một số v ng Nghệ vàng phía Bắc nhƣ ở H a Bình, V nh Phúc, Hƣng Yên. Chính vì vậy, để góp phần vào việc tìm hiểu thêm về các nguồn Nghệ vàng khác trong nƣớc, trong đề tài này, chúng tôi chọn đối tƣợng nghiên cứu là củ Nghệ vàng (Curcuma longa L.) thu hái tại Bình Dƣơng, với đề tài “Nghiên cứu quy trình tách chiết, tổng hợp dẫn xuất và xác định tính chất, hoạt tính của tinh dầu và curcumin trích từ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L.) Bình Dương”. Quy trình phân lập curcuminoid từ củ Nghệ vàng đƣợc định hƣớng khảo sát là trích ly curcuminoid kết hợp tách tinh dầu và không qua giai đoạn loại béo. So với những quy trình hiện sử dụng để tách curcuminoid từ củ Nghệ vàng, quy trình này sẽ giúp tận thu đƣợc nguồn tinh dầu từ củ Nghệ, giảm lƣợng dung môi hữu cơ sử dụng mà vẫn đảm bảo thu đƣợc curcuminoid từ củ Nghệ vàng với hiệu suất và độ tinh khiết cao. Với mục tiêu trên, chúng tôi hy vọng sẽ góp phần tìm ra một quy trình mới có tính ứng dụng cao để có thể mở rộng ở quy mô sản xuất lớn hơn. 1 Một hƣớng nghiên cứu thứ hai quan trọng và trọng tâm của công trình này là tổng hợp dẫn xuất của curcuminoid và khảo sát hoạt tính sinh học. Curcumin mặc dù đã đƣợc chứng minh có rất nhiều hoạt tính mạnh và đa dạng, một trong những nhƣợc điểm lớn của curcumin là tính khả dụng sinh học (bioavailability) thấp thể hiện ở sự hấp thu kém, sự chuyển hóa nhanh và sự đào thải lớn khi vào cơ thể. Chính những yếu tố trên đã làm ảnh hƣởng lớn đến dƣợc l của curcumin. Phƣơng pháp biến đổi cấu trúc curcumin nhằm cải thiện hoạt tính và tính khả dụng sinh học là hƣớng nghiên cứu đang rất đƣợc quan tâm hiện nay. Mặc d chƣa có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ giữa sự biến đổi cấu trúc curcumin với sự cải thiện tính khả dụng sinh học của curcumin, rất nhiều dẫn xuất c ng đã đƣợc chứng minh in vitro và in vivo có hoạt tính sinh học cao hơn curcumin. Đặc biệt trong số đó, các dẫn xuất isoxazole, pyrazole curcumin và dẫn xuất của pyrazole curcumin đƣợc chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học mạnh hơn so với curcumin nhƣ hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm, ức chế chọn lọc enzyme COX-2 và đặc biệt là hoạt tính kháng ung thƣ. Việc biến đổi cấu trúc diketone của curcumin thành các dị v ng isoxazole, pyrazole đã đƣợc chứng minh giúp tăng hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của curcumin với nhiều d ng tế bào khác nhau. Chính vì vậy trong đề tài nghiên cứu này, các dẫn xuất isoxazole và pyrazole curcuminoid được định hướng tổng hợp, đồng thời khảo sát một số hoạt tính sinh học của các dẫn xuất này so với curcumin như hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư. 2 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về curcumin Cây Nghệ vàng có tên khoa học là Curcuma longa L. thuộc họ gừng (Zingiberaceae). Trên thế giới, Nghệ vàng phân bố ở các v ng nhiệt đới, cận nhiệt đới và đƣợc trồng chủ yếu ở các nƣớc châu Á nhƣ Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Bangladesh, Indonesia... và Việt Nam [1]. Thành phần hóa học chính quan trọng nhất của thân rễ Nghệ vàng là curcuminoid (~ 2-8 %), thành phần tạo màu vàng cho củ Nghệ. Hỗn hợp curcuminoid bao gồm 3 thành phần chính : curcumin (Cur), demethoxycurcumin (DMC) và bisdemethoxycurcumin (BDMC) (hình 1.1) chiếm lần lƣợt khoảng 77 %, 17 %, 3 % [1-4]. (1) R1=R2=OCH3 (Curcumin) (2) R1=OCH3, R2=H (Demethoxycurcumin) (3) R1=R2=H (Bisdemethoxycurcumin) Hình 1.1. Cấu trúc của các thành phần curcuminoid [1] Curcumin, danh pháp quốc tế 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6diene-3,5-dione, chiếm hàm lƣợng cao nhất trong 3 thành phần và c ng đƣợc chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng hơn so với 2 thành phần c n lại. 1.2 Một số tính chất hóa lý của curcumin Curcumin là chất rắn kết tinh màu vàng cam, tan trong chất béo, ethanol, methanol, dichloromethane, acetone, acetic acid băng và hầu nhƣ không tan trong nƣớc ở môi trƣờng acid hay trung tính (độ tan < 10 µg/ml ở 25oC). Trong môi trƣờng kiềm, curcumin tạo dung dịch màu đỏ [1, 4, 5]. Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bƣớc sóng từ 420-430 nm (bảng 1.1) [1]. 3 Bảng 1.1. Các thông số hoá l của các thành phần curcuminoid [6] Thông số o Điểm chảy ( C) UV-Vis λmax trong ethanol (nm) Đặc trƣng Curcumin DMC BDMC 184 429 172 424 222 419 1.2.1.1 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm Dung dịch curcumin có màu không ổn định do sự phân hủy của curcumin hoặc do thay đổi dung môi. Trong môi trƣờng acid, dung dịch có màu vàng và chuyển sang đỏ nâu và đỏ đậm trong môi trƣờng kiềm. Phổ hấp thu trong môi trƣờng acid, base thể hiện trong hình 1.2 [7] a) b) Hình 1.2. a) Phổ UV-Vis của curcumin. ___ dung dịch curcumin 3,09 × 10-5 M trong NaOH 0,5M, --- dung dịch curcumin 3,04 × 10-5M trong acetic acid băng; b) Phổ UVVis của dung dịch curcumin 4,99 × 10−5 M trong NaOH 0,091M theo thời gian [7] Độ bền của curcumin phụ thuộc vào pH môi trƣờng [8, 9], phản ứng phân hủy xảy ra nhanh hơn trong môi trƣờng trung tính – kiềm [9]. Khi tiếp xúc liên tục với môi trƣờng kiềm sẽ có sự thay đổi màu rất rõ rệt sang màu vàng nâu hoặc vàng nhạt (gần nhƣ không màu). 4 Sản phẩm ngưng tụ Hình 1.3. Các sản phẩm phân hủy curcumin trong môi trƣờng kiềm [8] Nghiên cứu của Tonnesen và cộng sự [8] cho thấy, phản ứng phân hủy curcumin trong dung dịch pH 8,5 xảy ra nhanh ngay sau 5 phút. SKBM của dung dịch curcumin bị phân hủy hoàn toàn cho 8-17 vết, phụ thuộc vào thời gian phản ứng và pH môi trƣờng. Các sản phẩm phân hủy của curcumin đƣợc nhóm tác giả xác định thông qua HPLC – MS bao gồm ferulic acid, feruloylmethane và các sản phẩm phân hủy của feruloylmethane là vanilin và acetone (hình 1.3). Màu vàng đến vàng nâu của dung dịch đƣợc dự đoán là do các sản phẩm ngƣng tụ từ thành phần feruloylmethane. Trong môi trƣờng giả sinh l (đệm phosphate, pH 7,2, 37oC ) không có huyết thanh, 90 % curcumin phân hủy trong 30 phút. Tuy nhiên khi có mặt huyết thanh, curcumin bền hơn: trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào chứa 10 % huyết thanh bào thai b và trong máu ngƣời, sau 1 giờ chỉ ít hơn 20 % curcumin bị phân hủy và sau 8 giờ, chỉ khoảng 50 % curcumin bị phân hủy. Sản phẩm chính trong phản ứng phân hủy đƣợc xác định là trans-6-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2,4-dioxo-5-hexenal, vanilin, ferulic acid và feruloylmethane [9]. 1.2.1.2 Độ bền quang hóa của curcumin Curcumin đã đƣợc WHO thông qua là chất màu trong thực phẩm [10]. Tuy nhiên curcumin không thích hợp cho mọi loại sản phẩm do nó mất màu rất nhanh khi tồn trữ trong môi trƣờng kiềm. Ngoài ra, curcumin c ng dễ bị quang phân dƣới tác dụng của bức xạ UV-Vis cả ở dạng h a tan và dạng màng rắn [11]. SKBM của dung dịch curcumin trong isopropanol (1 mg/100 ml) sau khi chiếu xạ dƣới ánh sáng 400-510 nm trong 245 phút cho 1 sản phẩm phân hủy chính có Rf 5