Tài liệu Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng

Đồ án tốt nghiệp PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết cùa đề tài Trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam, phân bón đóng vai trò quan trọng trong việc tăng năng suất cây trồng. Tuy nhiên tình hình hiện nay, để đáp ứng nhu cầu về năng suất, một lượng lớn phân hoá học đã được sử dụng, gây ra các tác động tiêu cực đến môi trường đất, không những thế mà còn ảnh hưởng đến môi trường nước, các vi sinh vật cũng như con người. Lân (phốt pho) là yếu tố rất cần thiết đối với sự tăng trưởng và năng suất của cây trồng. Đóng vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động sinh lý của cây như phân chia tế bào, quang hợp và phát triển hệ thống rễ tốt (J. Microbiol, 2011). Tuy nhiên không phải hợp chất chứa lân nào trong đất cây cũng sử dụng được. Điển hình là đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên có hàm lượng lân tổng số đạt 0,02%, nhưng lượng lân mà cây có thể sử dụng được chỉ 4,12mg/100g đất (Đoàn Triệu Nhạn, 1999). Vì vậy, để nâng cao năng suất cây trồng các nhà nông sử dụng các loại phân lân hoá học để bón cho cây, nhưng khoảng 2/3 phân lân hoá học bón vào đất bị kết tủa ở dạng khó tan cây trồng không hấp thụ được bởi nguyên tố sắt, nhôm hoặc các hợp chất canxi có trong đất (Gyaneshwar và cộng sự, 2002; Turan và cộng sự, 2006). Điều này khiến cho đất trồng ngày càng chai cứng, thiếu màu mỡ. Mặt khác lượng phân lân còn lại trong đất có thể bị rửa trôi hoặc thấm vào mạch nước ngầm gây ô nhiễm môi trường nước. Để khắc phục tình trạng trên, hiện nay Việt Nam nói riêng và các nước trên thế giới như Ấn Độ, Nhật Bản… đang tập trung nghiên cứu phân bón theo hướng thân thiện với con người và môi trường, chi phí thấp, đồng thời cải thiện môi trường đất chai cứng do sử dụng phân hoá học trước đó. Một số báo cáo khoa học cho thấy một số loài vi khuẩn khác nhau có khả năng hoà tan các hợp chất phốt pho vô cơ chẳng hạn như tricalcium phosphate, dicalcium phosphate, hydroxyapatite. Sự xuất hiện của vi khuẩn hoà tan phốt pho tập trung cao ở vùng rễ, mật độ phụ thuộc vào tính chất của đất (J. Microbiol, 2011). 1 Đồ án tốt nghiệp Dựa trên cơ sở đó, phân lân vi sinh được tập trung nghiên cứu làm giải pháp thay thế cho phân lân hoá học. Phân lân vi sinh là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống đã được tuyển chọn với mật độ theo tiêu chuẩn hiện hành có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng dễ tan mà cây trồng sử dụng được. Phân lân vi sinh là giải pháp bền vững, an toàn cho sự hướng tới nền nông nghiệp sạch hiện nay. Trong thực tế, các doanh nghiệp sản xuất phân bón vi sinh ở hai dạng rắn và lỏng. Đối với phân bón vi sinh dạng rắn có những hạn chế nhất định như thời gian bảo quản ngắn, tác dụng chậm, nhiều cơ hội bị tạp nhiễm, khả năng sống của VSV dưới điều kiện khắc nghiệt kém, chi phí vận chuyển cao…(Viveganandan và Jauhri, 2000). Trong bối cảnh đó, phân bón vi sinh dạng lỏng càng có tầm quan trọng và trở nên phổ biến với thời gian sử dụng lâu hơn từ 12 – 24 tháng, dễ tương tác với cây trồng, không gây ô nhiễm, mật độ VSV hữu ích cao, bảo vệ tốt tế bào khỏi các yếu tốt bất lợi từ môi trường… (Sridhar và cộng sự, 2004). Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng” được tiến hành nhằm tuyển chọn các vi sinh vật có khả năng phân giải lân tốt, từ đó nghiên cứu và thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân ở dạng lỏng. Nội dung nghiên cứu Tuyển chọn chủng vi sinh vật hoặc các chủng vi sinh vật phối hợp có khả năng phân giải lân khó tan tốt nhất, đồng thời có khả năng sinh tổng hợp các chất dinh dưỡng, cũng như chất kích thích tăng trưởng cây trồng để ứng dụng vào sản xuất chế phẩm. Xác định môi trường lên men chính và điều kiện nuôi cấy phù hợp với vi sinh vật. Xác định chất ổn định chế phẩm phù hợp với vi sinh vật và tạo chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng. Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân. 2 Đồ án tốt nghiệp Ý nghĩa khoa học Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân lân vi sinh dạng lỏng. Ý nghĩa thực tiễn Thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phân giải lân khó tan trong sản xuất nông – lâm nghiệp, vừa phân giải tốt lân khó tan trong đất vừa có khả năng sinh tổng hợp các chất dinh dưỡng và chất kích thích tăng trưởng cây trồng. Cải thiện môi trường đất nông nghiệp đang xuống cấp của Việt Nam. Đồng thời đóng góp vào các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh dạng lỏng hiện còn ít biết đến ở Việt Nam. 3 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các dạng lân trong đất Lân là chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự tăng trưởng của cây trồng, khi không cung cấp đủ lân, cây sẽ sinh trưởng, phát triển chậm, do đó giảm năng suất (Sawyer và Creswell, 2000). Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng lân của cây trồng không quá 25%, phần lớn lân dễ tan trong đất sẽ bị cố định ở dạng cây trồng khó hấp thụ, chiếm tới 95 – 99% tổng lượng lân có trong đất. Thành phần lân dễ tan và khó tan trong đất được quyết định bởi tính chất đá mẹ, thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữu cơ. Hoạt động của các cation kim loại (Ca, Fe, Mg…) và các hợp chất oxide của các kim loại này trong đất cũng làm lân dễ tan bị cố định. Theo Sharpley (2006), thì hàm lượng lân trung bình ở nhiều loại đất thường từ 0,02 – 0,08 %. Do quá trình tích luỹ sinh học, hàm lượng lân ở lớp đất mặt cao hơn lớp dưới. Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung cấp cho đất một nguồn lân quan trọng. Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng, lân tồn tại ở hai hình thức: vô cơ và hữu cơ (Sharpley, 2006). 1.1.1. Lân vô cơ Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối phosphate của những nguyên tố Ca, Fe, Al, Mg… Ở đất trung tính và đất kiềm thì phosphate caxi là chủ yếu, còn ở đất chua thì phosphate sắt và nhôm là chủ yếu. Phosphate canxi dễ được huy động để làm thức ăn cho cây hơn phosphate sắt và phosphate nhôm. Sự tồn tại của ion phosphate trong môi trường đất bị chi phối bởi ion phosphate bị chuyển đổi hoá trị (Võ Thị Lài, 2006). Có thể phân loại lân vô cơ theo tính tan như sau: - Lân vô cơ khó tan (Ca3(PO4)2, AlPO4, FePO4, …): là các muối phosphate khó tan trong nước, cây không thể hấp thụ được. - Lân vô cơ dễ tan (Na2HPO4, K2HPO4, MgHPO4, …): cây trồng dễ dàng sử dụng các loại muối phosphate này. 4 Đồ án tốt nghiệp Trong thực tế H2PO4- là dạng cây trồng dễ hấp thu nhất, các dạng phosphate còn lại thường là các dạng khó hoà tan, muốn cây trồng sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan (Võ Thị Lài, 2006). Trong quá trình này vi sinh vật giữ vai trò quan trọng. 1.1.2. Lân hữu cơ Lân hữu cơ trong đất chủ yếu có trong mùn, đất càng giàu mùn càng giàu lân hữu cơ. Tuỳ loại đất lân hữu cơ thường chiếm 20 – 80% lân tổng số (Trần Long Tấu, 2009). Trong lân hữu cơ của đất dạng phổ biến nhất là fytat, có thể chiếm đến 50% tổng số lân hữu cơ. Khi có sự tham gia của các vi sinh vật phân giải lân, những hợp chất hữu cơ sẽ được khoáng hoá giải phóng lân vô cơ hay lân hữu cơ, là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Có 70 – 80 tập đoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình phân giải lân (Võ Thị Lài, 2006). 1.1.3. Vòng tuần hoàn Động vật Cây xanh Ion PO4-3 trong dung dịch đất Ion PO4-3 bị hấp thụ Quá trình khoáng Hoà tan Quá trình cố định Phốt pho vô cơ Cố định tạm thời Chất hữu cơ tươi và tế bào sinh vật Chất hữu cơ mùn hoá Hình 1.1. Vòng tuần hoàn lân trong tự nhiên 5 Đồ án tốt nghiệp Lân trong tự nhiên luôn tuần hoàn chuyển hoá (Hình 1.1), nhờ vi sinh vật lân hữu cơ được vô cơ hoá thành dạng muối của acid phosphoric. Các dạng này một phần được cây trồng sử dụng biến thành lân hữu cơ, một phần bị cố định ở dạng khó tan. Trong quá trình này vi sinh vật giữ vai trò quan trọng. Trong tự nhiên, lân tham gia vào các quá trình chuyển đổi vật chất bằng cả con đường hóa học và sinh học. Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của lân trong tự nhiên diễn ra theo 3 quá trình sau: Khoáng hóa: Là quá trình chuyển hóa lân dạng hữu cơ thành lân dạng vô cơ. Cố định sinh học (Immobilization): Là quá trình tái sử dụng lân vô cơ nhờ VSV và qua đó chuyển đổi lân vô cơ thành lân hữu cơ trong protoplasm của VSV. Cố định hóa học (Fixation): Là quá trình chuyển đổi lân dạng tan sang dạng khó tan dưới tác dụng của các phản ứng hóa học giữa ion PO43- và cation kim loại. 1.1.4. Vai trò của lân đối với cây trồng Phốt pho là một trong những yếu tố quan trọng trong nông nghiệp hiện nay, nằm trong nhóm ba nguyên tố đa lượng chính của cây trồng (N, P, K). Tầm quan trọng của phốt pho đối với sản lượng mùa vụ được minh hoạ bằng tổng lượng phân lân được sử dụng trong suốt 35 năm gần đây, ổn định ở khoảng dưới 20 triệu tấn/năm trong 10 năm gần đây. Phốt pho có nhiều chức năng quan trọng đối với thực vật, chức năng cơ bản là lưu trữ và vận chuyển năng lượng trong thực vật. Adenosine diphosphate (ADP) và adenosine triphosphate (ATP) là những hợp chất phốt pho năng lượng cao, điều khiển hầu hết những tiến trình trong thực vật bao gồm quang hợp, hô hấp, tổng hợp acid nucleic và protein và vận chuyển dinh dưỡng thông qua những tế bào thực vật. Ngoài ra còn đẩy mạnh sự phát triển của rễ, tăng khả năng hấp thu nước và khoáng chất. Thúc đẩy quá trình sinh nhánh, nảy chồi cho ra hoa tạo quả sớm (Lê Văn Căn, 1968). 1.2. Tổng quan về vi sinh vật phân giải lân VSV phân giải lân - VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms - PSM) hay còn được gọi là VSV huy động lân (Phosphate 6 Đồ án tốt nghiệp mobilizing Microorganisms) là các VSV có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Các VSV phân giải hợp chất phốt pho khó tan được biết đến nay gồm cả vi khuẩn, nấm mốc và nấm men. VSV phân giải lân không chỉ là các VSV chuyển hoá photphate vô cơ, mà bao gồm cả các VSV có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo nguồn lân dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng (Vũ Thuý Nga, 2003). VSV phân giải lân được chia làm 2 nhóm: nhóm VSV phân giải lân vô cơ và nhóm VSV phân giải lân hữu cơ. 1.2.1. VSV phân giải lân hữu cơ Như ta đã biết, lân hữu cơ cũng là nguồn dự trữ lân trong đất đáng kể cho sự phát triển của thực vật. Tuy nhiên, để thực vật sử dụng được thì nguồn lân hữu cơ này cần phải được vô cơ hóa (khoáng hóa) dưới dạng dễ tan. Quá trình khoáng hóa của hầu hết các hợp chất lân hữu cơ được thực hiện nhờ hệ enzyme phosphatase của các vi sinh vật đất. Càng gần vùng rễ cây thì hoạt động của các vi sinh vật phân giải lân hữu cơ càng mạnh mẽ (Tarafdar và Junk, 1987). Rõ ràng, sự tồn tại hệ vi sinh vật vùng rễ này đã góp phần đáng kể tăng lượng lân khả dụng cho cây trồng (Garcia và cộng sự, 1992; Xu và Johnson, 1995). VSV phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus (Skrary và Cameron, 1998) và Pseudomonas (Gügi và cộng sự, 1991), ngoài ra còn một số xạ khuẩn và nấm khác. Đáng chú ý là B.megaterium var phosphatsum có khả năng phân giải lân hữu cơ cao. Đồng thời B. megaterium còn có khả năng hình thành bào tử nên sức sống rất mạnh (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009). Qua nghiên cứu hoạt động phân giải lân hữu cơ của các enzyme phosphatase khác nhau ở vùng rễ ngô, lúa mạch, lúa mì, Burn (1983) đã nhận thấy hoạt tính của các phosphatase mạnh nhất ở đất chua đến trung tính. Tất cả những nghiên cứu trên đã khẳng định vi khuẩn đất có vai trò quan trọng trong việc cung cấp lân khả dụng cho cây trồng từ các nguồn lân vô cơ và hữu cơ sẵn có trong đất mà cây trồng không sử dụng được. 1.2.2. VSV phân giải lân vô cơ 7 Đồ án tốt nghiệp Nhiều vi khuẩn như B.megaterium, B.mycoides, B.butyricus, Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn hệ rễ, xạ khuẩn có khả năng phân giải Ca3(PO4)2 và bột apatit. Khả năng phân giải lân vô cơ có liên quan mật thiết tới sự sản sinh acid của vi sinh vật. Quá trình lên men tạo ra acid carbonic, là acid chủ yếu thúc đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ. Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O  Ca(PO4)2H2O + Ca(HCO3)2 Trong đất vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụng trong việc phân giải Ca3(PO4)2. Vì trong quá trình sống các vi khuẩn này tích lũy HNO3 và H2SO4 trong đất. 1.2.3. Khả năng kích thích sự phát triển cây trồng của VSV phân giải lân Trong tự nhiên tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn mà đa phần là các vi khuẩn liên quan đến rễ cây, có tác dụng kích thích tăng trưởng cây trồng. Nhóm vi khuẩn này gọi là PGPB (plant growth promoting bacteria). Theo Ahmed và Shahab (2011), PGPB sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp một hoặc nhiều cơ chế để cải thiện mức độ tăng trưởng và sức khoẻ cây trồng. Những cơ chế này có thể hoạt động đồng thời hoặc hoạt động tuần tự ở các giai đoạn khác nhau của sự phát triển thực vật. Chúng bao gồm: - Hoà tan lân. - Cố định đạm. - Kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng. - Tăng cường sự hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết khác. - Sản xuất phytohormone như acid indole-3-acetic và acid butyric indol. Trong số đó vi khuẩn phân giải lân khó tan (PSB) đã được sử dụng như phân bón sinh học thương mại để cải thiện tình trạng nông nghiệp (Subba-Rao, 1993; Rodríguez và Fraga, 1999). Nhóm vi khuẩn phân giải lân được coi là phân bón sinh học có triển vọng nhất vì rất nhiều loại đất giàu lân tổng số nhưng lại thiếu hụt trầm trọng lân dễ tan cung cấp cho cây trồng. Tác động có lợi của vi khuẩn phân giải lân đã được nhiều tác giả mô tả (Antoun và cộng sự, 1998; Chabot và cộng sự, 1998; Pal, 1998; Peix và cộng sự, 8 Đồ án tốt nghiệp 2001; Sarawgi và cộng sự, 1999; Tomar và cộng sự, 1996). Hơn nữa, các vi khuẩn phân giải lân lại rất có tiềm năng để sản xuất phân vi sinh đa chức năng vì có thể tương tác kết hợp tốt với các vi khuẩn có lợi khác như Azospirillum (Gaur và Alagawadi, 1992; Belimov và cộng sự, 1995) và Azotobacter (Kundu và Gaur, 1984). Ngoài vai trò cung cấp lân dễ tan cho cây trồng, các vi khuẩn hòa tan lân còn có khả năng sinh các yếu tố có vai trò nâng cao hiệu suất tăng trưởng như cố định đạm, sinh tổng hợp các phytohormone, kháng sinh, hay các enzyme chitinase, cellulase, pectinnase,... giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài. 1.2.4. Cơ chế hòa tan lân của VSV 1.2.4.1. Cơ chế hòa tan lân vô cơ Một số lý thuyết giải thích các cơ chế hoà tan lân của VSV như lý thuyết acid hữu cơ và lý thuyết acid hóa bằng cách giải phóng H+ (Ahmed và Shahab, 2011). Lý thuyết acid hữu cơ Lý thuyết acid hữu cơ được chấp nhận bởi nhiều nhà nghiên cứu. Trong lý thuyết này, các nguồn lân vô cơ không hòa tan trong môi trường được hòa tan bởi VSV phân giải lân, đi kèm với sản xuất các acid hữu cơ, làm giảm pH và làm tăng sự tạo phức của các ion dương liên kết với nhóm phosphate (Puente và cộng sự, 2004).Việc giảm độ pH của dịch nuôi cấy VSV từ giá trị ban đầu của môi trường là 7.0 đến giá trị cuối cùng 2.0 được ghi lại bởi nhiều nghiên cứu (Gaur và Gaind 1999; Illmer và Schinner, 1992). Việc sản xuất các acid hữu cơ dẫn đến hiện tượng acid hóa các tế bào VSV và môi trường xung quanh. Do đó, việc giải phóng các ion P trong các khoáng P-Ca là do sự thay thế H+ bằng Ca2+. Phân tích dịch nuôi cấy của các VSV có khả năng hòa tan lân đã cho thấy sự hiện diện của số lượng các acid hữu cơ như malic, glyoxalic, succinic, fumaric, tartaric, alpha keto butyric, oxalic, citric, acid 2-ketogluconic và gluconic (Lapeyrie và cộng sự, 1991; Cuningham và Kuaick, 1992; Illmer và cộng sự, 1995; Fasim và 9 Đồ án tốt nghiệp cộng sự, 2002; Kim và cộng sự, 1997). Trong số đó, acid gluconic có vẻ là tác nhân thường gặp nhất của quá trình hòa tan lân vô cơ. Các vi khuẩn sinh acid gluconic đã được báo cáo là Pseudomonas sp (Illmer và Schinner, 1992), Erwinia herbicola (Liu và cộng sự, 1992), Pseudomonas cepacia (Goldstein và cộng sự, 1993). Chủng vi khuẩn Bacillus liqueniformis và Bacillus amyloliquefaciens đã được xác định là có khả năng sản xuất hỗn hợp các acid lactic, isovaleric, isobutyric, và acit acetic có vai trò tham gia vào quá trình hòa tan lân vô cơ khó tan (Rodríguez và Fraga, 1999). Goldstein (1995) đã chứng minh rằng kết quả của sự oxy hóa glucose sản sinh ra acid gluconic và acid 2-ketogluconic là cơ sở của quá trình hòa tan lân vô cơ khó tan của một số vi khuẩn Gram âm. Bên cạnh các acid hữu cơ, acid vô cơ như acid nitric và acid sulfuric cũng được sản xuất bởi các vi khuẩn nitrat và các Thiobacillus trong quá trình oxy hóa của các hợp chất vô cơ có chứa nitơ hoặc lưu huỳnh. Các acid vô cơ này phản ứng với canxi phosphat và chuyển đổi chúng thành các dạng hòa tan (Gaur và Gaind, 1999). Hàm lượng và loại acid hữu cơ được các VSV tiết vào dịch nuôi cấy rất đa dạng. Lượng lân được VSV hòa tan phụ thuộc vào cường độ và loại acid. Acid béo được đánh giá là có hiệu quả hơn acid phenolic và acid citric khi hòa tan lân. Acid fumaric có khả năng hòa tan lân tốt nhất. Tribasic acid và dibasic acid cũng có hiệu quả hơn acid monobasic (Gaur và Gaind, 1999). Goldstein (1994) đề xuất rằng quá trình oxy hóa trực tiếp periplasmic glucose thành acid gluconic, thường là acid 2-ketogluconic, hình thành cơ sở trao đổi chất của chất khoáng trong một số vi khuẩn gram âm phân giải lân. Mặc dù nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ giả thuyết acid hữu cơ, nhưng rất khó khăn trong việc định lượng lân hòa tan tương ứng với từng loại acid hữu cơ xuất hiện trong môi trường chất lỏng. Lý thuyết acid hóa Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật vẫn có khả năng hòa tan lân mà không hề sản sinh bất cứ loại acid hữu cơ nào trong quá trình sinh trưởng. Việc hòa 10 Đồ án tốt nghiệp tan lân mà không sản xuất acid được giải thích là do việc phát hành các proton kèm theo quá trình hô hấp hoặc đồng hóa amoni (Taha và cộng sự, 1969; Kucey, 1983; Dighton và Boddy, 1989; Parks và cộng sự, 1990). Illmer và Schinner (1995) đã giải thích sự hòa tan lân nhờ giải phóng H+ làm giảm pH của môi trường. Họ đã sử dụng Pseudomonas aurantiogriseum và Pseudomonas sp. phân lập từ đất rừng để phân giải 2 hợp chất Ca-P là hydroxyapatite và brushite. Tác giả quan sát thấy rằng nồng độ lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy lỏng tăng lên tương ứng với mức tiêu thụ apatit (Ca5(PO4)3(OH, F, Cl)) và brushite (CaHPO4.2H2O). Nồng độ lân hòa tan cũng đạt mức cao nhất ở một số thời điểm nhất định trong suốt quá trình nuôi cấy. Họ cho rằng các hợp chất hữu cơ đã được đồng hóa như các chất dinh dưỡng bởi hai chủng sinh vật này khi môi trường chất lỏng chứa ít chất vô cơ. Việc giải phóng H+ được cho là liên kết với đồng hóa cation, như ion amoni (NH4+). Giải phóng H+ đi kèm đồng hoá NH4+ chịu trách nhiệm hòa tan lân. Họ đã chứng minh rằng Pseudomonas aurantiogriseum và Pseudomonas sp. Đã tạo H+ để hòa tan hydroxyapatite một cách hiệu quả mà không cần sự liên kết với brushite giữa các tế bào và các chất nền, đồng thời giảm độ pH. Vi khuẩn huy động lân để giải phóng H+ tại bề mặt tế bào. Hoạt động giải phóng H+ đi kèm với giảm pH tạo thành một điều kiện thích hợp cho sự hòa tan lân. Bên cạnh đó, các chất dễ tạo phức, CO2, H2S cũng tăng cường quá trình phân giải lân vô cơ khó tan (Luo và cộng sự, 1993; Kapoor và cộng sự, 1989). 1.2.4.2. Cơ chế hòa tan lân hữu cơ Tương tác emzyme – cơ chất là cơ sở của quá trình hòa tan lân hữu cơ. Các enzyme phosphatase đóng vai trò phân giải hầu hết các dạng lân hữu cơ trong đất. Một số loại enzyme có hoạt tính phosphatase có thể kể đến như acid phosphatase, phytase, lecithinase, D-α-Glycerophosphatase, phosphonoacetate hydrolase … 1.3. Phân bón vi sinh phân giải lân 1.3.1. Định nghĩa 11 Đồ án tốt nghiệp Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất phốt pho khó tan (tên thường gọi là phân lân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng xuất và (hoặc) chất lượng nông sản. Phân lân vi sinh và các chủng vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. 1.3.2. Quy trình sản xuất Qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh tổng quát bao gồm 2 phần: từ giống gốc ban đầu tiến hành nhân giống thu sinh khối và tạo chế phẩm. Giống gốc Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Chất mang Lên men chính thu sinh khối Xử lý Phối trộn Chế phẩm dạng rắn Chế phẩm dạng lỏng Hình 1.2. Qui trình sản xuất tổng quát phân bón vi sinh 1.3.2.1. Phân lập tuyển chọn chủng VSV phân giải lân (PSM) Trong quy trình sản xuất chế phẩm PSM, công tác đầu tiên là phân lập và tuyển chọn những chủng VSV tốt. Chủng VSV phân giải lân được phân lập từ đất hoặc từ vùng rễ cây trồng 12 Đồ án tốt nghiệp trên các loại đất hay cơ chất giàu hữu cơ theo phương pháp nuôi cấy pha loãng trên môi trường đặc Pikovskaya (Pikovskaya, 1948). Trong quá trình nuôi cấy các chủng VSV phân giải lân sẽ tạo vòng phân giải, tức là vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc. Vòng phân giải được hình thành nhờ khả năng hoà tan phosphate khó tan được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Căn cứ vào đường kính vòng phân giải, thời gian hình thành và độ trong của vòng phân giải người ta có thể đánh giá định tính khả năng phân giải mạnh hay yếu của các các chủng VSV phân lập. Để đánh giá chính xác mức độ phân giải các hợp chất lân khó tan của VSV, người ta phải định lượng hoạt tính phân giải của chúng bằng cách phân tích hàm lượng lân dễ tan trong môi trường nuôi cấy VSV có chứa loại phosphate không tan. Hình 1.3. VK phân giải lân trên MT P Hình 1.4. VK phân giải lân trên MT P bổ sung Bromophenol blue Để sản xuất phân lân VSV người ta cố gắng tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phân hu nhiều loại hợp chất lân hữu cơ và vô cơ khác nhau và có ảnh hưởng tốt đến cây trồng. Vì ngoài hoạt tính phân giải lân, nhiều chủng VSV còn có các hoạt tính sinh học khác gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng. Do vậy cần chọn những nguồn phân lập an toàn sinh học hoặc sau khi phân lập cần được đánh giá ảnh hưởng đến đối tượng cây trồng sử dụng. Chỉ sử dụng chủng VSV vừa có hoạt tính phân giải lân cao, sức cạnh tranh lớn, thích ứng ở pH rộng, phát huy được ở nhiều vùng sinh thái khác nhau và đặc biệt không gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng và môi trường sinh thái, tốt hơn nếu chủng VSV đó sinh tổng hợp các hợp chất có lợi cho cây trồng. 13 Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2. Nhân sinh khối VSV Từ các chủng VSV tuyển chọn, sinh khối VSV được nhân giống cấp 1, nhân giống cấp 2 và lên men chính để thu sinh khối (Hình 1.2), trong đó các yếu tố ảnh hưởng như môi trường nhân sinh khối, nồng độ ô xy, nhiệt độ và pH cần được đặc biệt chú ý. Môi trường nhân sinh khối VSV cần đáp ứng đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cho VSV sinh trưởng phát triển, đồng thời phải rẻ và luôn sẵn có. Theo Wang JinLing và cộng sự (2013), để xác định môi trường nuôi cấy tốt nhất cần tiến hành thí nghiệm bề mặt phản ứng tối ưu hoá. Thí nghiệm được tiến hành đối với chủng vi khuẩn hoà tan phosphate Bacillus megaterium, OD600 được xem như tiêu chuẩn để đánh giá số lượng tế bào. Các yếu tố trong môi trường được tiến hành tối ưu như nguồn carbon, nguồn nitơ, nồng độ muối vô cơ và đạt được các giá trị tốt nhất của từng yếu tố. Từ đó thiết kế đồ thị bề mặt phản ứng nhằm xác định môi trường tối ưu hoá. Kết quả cho thấy các thành phần môi trường tối ưu bao gồm: Lactose 6g/L, Pepton 7,45g/L, NaCl 5g/L, MgSO4.7H2O 2,46g/L, CaCl2 1,22g/L, K2SO4 0,087g/L. Với môi trường nuôi cấy tối ưu này, số lượng tế bào sống của vi khuẩn Bacillus megaterium trong dịch lên men có thể đạt 2,0 109 cfu/ml. Có thể cung cấp mật độ cao vi khuẩn hoà tan phosphate cho sản xuất công nghiệp. Hầu hết các VSV sử dụng trong sản xuất phân bón được nhân sinh khối bằng phương pháp lên men chìm trong các nồi lên men (J. F. Walter và A. S. Paau, 1996). 1.3.2.3. Tạo chế phẩm Phân bón VSV được sản xuất bằng cách phối trộn sinh khối VSV ở một mật độ nhất định vào chất mang vô trùng hoặc không vô trùng. * Chất mang và xử lý chất mang Chất mang là cơ chất để VSV trú ngụ và duy trì mật độ trong thời gian từ khi sản xuất đến khi sử dụng. Ngoài các yêu cầu về đặc tính vật lý, cảm quan, chất mang phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến VSV, thực vật và môi trường. 14 Đồ án tốt nghiệp Chất lượng phân VSV trên nền chất mang khử trùng phụ thuộc rất lớn vào mật độ VSV hữu ích và khả năng tồn tại của chúng trong sản phẩm. Nhằm hạn chế tối đa sự cạnh tranh của các VSV tạp trong phân bón, chất mang được khử trùng bằng các phương pháp khác nhau. Phương pháp thông dụng đang được sử dụng rộng rãi hiện nay là khử trùng bằng hơi nước bão hòa. Nhằm giảm giá thành, tạo điều kiện thuận lợi cho người sử dụng sản phẩm phân bón VSV trên nền chất mang không khử trùng cũng đã được nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất. Phân VSV trên nền chất mang không khử trùng là sản phẩm phân VSV, trong đó chất mang sau xử lý được phối trộn trực tiếp với sinh khối VSV không thông qua khử trùng. Ưu và nhược điểm của 2 loại phân bón VSV trên nền chất mang khử trùng và không vô trùng được tổng kết trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Ưu điểm và hạn chế của phân bón VSV trên nền chất mang khử trùng và không khử trùng Ưu điểm Chất mang Khử trùng Hạn chế - Có thể pha loãng, qua đó giảm chi - Cần đầu tư lớn ban đầu và phí đầu tư nồi lên men, môi trường. đòi hỏi đặc biệt cho điều - Có chất lượng cao, thời gian tồn kiện khử trùng chất mang. tại của VSV lâu. - Cần có kỹ thuật và cán bộ - Dễ đánh giá và kiểm tra chất lượng. có kinh nghiệm. - Thuận lợi cho việc sử dụng. - Kỹ thuật phối trộn đơn giản - Cần lượng sinh khối VSV - Có thể sử dụng các vật liệu địa lớn. Không phương. - Chất lượng không ổn định, khử trùng - Đầu tư ít, không cần kỹ thuật đặc khó đánh giá và kiểm tra chất lượng, không bảo quản biệt. được lâu. (Phạm Văn Toản, 2002) 15 Đồ án tốt nghiệp * Chủng sinh khối VSV vào chất mang, tạo sản phẩm Sinh khối VSV sau lên men được ly tâm hay vi lọc, rửa tế bào để thu sinh khối. Chủng sinh khối vào chất mang vô trùng theo mật độ nhất định tạo ra phân VSV trên nền chất mang vô trùng, trong đó sinh khối VSV được chủng trong điều kiện vô trùng bằng bơm tiêm hoặc hệ thống tiêm dịch tự động, bán tự động, sau đó đưa vào buồng sinh trưởng ở nhiệt độ phù hợp với từng giống VSV. Sau thời gian sinh trưởng 1 tuần sản phẩm có thể mang đi sử dụng. Đối với phân VSV trên nền chất mang không khử trùng, ngoài công đoạn khử trùng chất mang, các công đoạn sản xuất phân bón hoàn toàn đồng nhất với qui trình sản xuất phân VSV trên nền chất mang khử trùng. Trong thực tế, nhiều doanh nghiệp sản xuất phân bón VSV dạng lỏng và dạng bột sinh khối VSV đông khô. Để sản xuất phân bón VSV dạng lỏng, trong quá trình chuẩn bị môi trường người ta bổ sung vào môi trường chất bảo quản, đó là hợp chất polyme (PB 40, Gum arabic v.v...) với liều lượng 0,5% so với thể tích môi trường nuôi cấy. Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được bảo quản lạnh, ly tâm thu sinh khối và tiến hành phối trộn vào chất mang. Cuối cùng đóng gói tạo sản phẩm phân bón vi sinh vật dạng lỏng. Phân VSV dạng bột đông khô là sản phẩm trong đó sinh khối VSV sau lên men được ly tâm loại bỏ nước tự do và đông khô trong thiết bị đông khô. Sản phẩm tạo ra được đóng gói với chất mang hoặc không có chất mang. 1.3.2.4. Yêu cầu chất lượng và công tác kiểm tra chất lượng Để đảm bảo chất lượng phân bón trong quá trình sản xuất cần thiết phải kiểm tra chất lượng ở các công đoạn sản xuất sau: - Giống gốc và chất lượng giống lên men cấp 1. - Chất mang. - Sinh khối VSV sau khi kết thúc lên men. - Sản phẩm sau phối trộn sinh khối, sau thời gian sinh trưởng và bảo quản. Phân VSV phân giải lân phải có hiệu quả đối với đất và cây trồng, ngh a là có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng phát triển của cây trồng, đến năng suất, chất 16 Đồ án tốt nghiệp lượng nông phẩm hoặc độ phì nhiêu của đất. Mật độ VSV trong sản phẩm phải bảo đảm các tiêu chuẩn ban hành. Phân lân vi sinh được coi là có chất lượng tốt khi có chứa một hay nhiều loại VSV có hoạt tính phân giải lân cao, có ảnh hưởng tốt đến cây trồng. Mật độ vi sinh vật trong sản phẩm phải bảo đảm các tiêu chuẩn ban hành. Bảng 1.2. Chỉ tiêu mật độ VSV trong phân bón vi sinh. Mật độ vi sinh vật (cfu/g hay cfu/ml phân bón) Tên chỉ tiêu Chất mang thanh trùng Chất mang không thanh trùng VSV hữu ích không nhỏ hơn 108 106 – 107 VSV tạp, không lớn hơn 106 (Nguồn: TCVN 6169:1996) 1.3.3. Phân bón vi sinh dạng lỏng Phân bón VSV dạng rắn có những hạn chế nhất định như: thời gian sử dụng ngắn (3 tháng), khả năng sống của VSV trong điều kiện khắc nghiệt kém, nhiều cơ hội bị tạp nhiễm làm ảnh hưởng mật độ tế bào VSV có lợi, thời gian tác dụng lâu, chi phí vận chuyển cao. Vì thế chế phẩm lỏng ngày càng quan trọng và phổ biến với thời gian sử dụng lâu hơn, khả năng tồn tại trong điều kiện bất lợi cao. Từ những hạn chế của phân bón vi sinh dạng rắn, năm 1998 tiến s Krishan Chandra giám đốc trung tâm RCOF, đã xây dựng công nghệ phân bón sinh học dạng lỏng tại trụ sở Bangalore. Công nghệ này là giải pháp thay thế các chế phâm phân bón sinh học trước đây. Chế phẩm phân bón vi sinh vật dạng lỏng là một chế phẩm đặc biệt không những bao gồm các vi sinh vật có lợi mà còn chứa các chất có thúc đẩy VSV phát triển và bảo vệ chúng dưới các điều kiện bất lợi giúp cho thời hạn sử dụng chế phẩm lâu hơn. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các loại polyme được sử dụng để sản xuất chế phẩm bởi khả năng hạn chế sự truyền nhiệt, giúp chế phẩm phân bố đều không bị kết 17 Đồ án tốt nghiệp cặn, bảo vệ tế bào VSV khỏi những yếu tố bất lợi từ môi trường. Chẳng hạn như Sodium alginate, Carboxyl methyl cellulose (CMC), Polyvinyl pyrrolidone (PVP), Xanthan gum… Theo Mahdi (2010), polysorbate 20 thương mại được gọi là Tween 20 ở nồng độ 0,025% được tìm thấy là chất hoạt động bề mặt cho quần thể tế bào tốt hơn. Polysorbate là một chất bề mặt không ion có tính ổn định và không độc tính cho phép nó được sử dụng như một chất tẩy rửa và chất nhũ hóa trong một số ứng dụng trong nước, khoa học, và dược lý. Được biết Glycerol có khả năng bảo vệ các tế bào chống lại điều kiện bất lợi từ môi trường, chống sự mất nước của chế phẩm lỏng trong thời gian bảo quản dài (Somasegaran và Hoben, 1985). Ngoài ra còn hoạt động như một nguồn carbon thay thế (Lorda và Balatti, 1996). Việc sản xuất phân bón VSV dạng lỏng tạo ra một bước ngoặc lớn trong việc sản xuất phân bón vi sinh vật vì nó được thiết lập dựa vào bốn đặc điểm yêu cầu sau: - Ổn định sinh vật trong quá trình sản xuất phân bón và lưu trữ. - Dễ dàng phối trộn VSV vào các chế phẩm lỏng thích hợp. - Bảo vệ VSV khỏi các yếu tố bất lợi từ môi trường từ đó tăng khả năng sống sót của VSV có lợi. - Giữ được hoạt tính sinh học của VSV, dễ dàng tương tác với cây trồng. Theo Chandra và cộng sự (1999), để việc sản xuất chế phẩm phân bón dạng lỏng có hiệu quả cao cần quan tâm đến các yếu tố ảnh hưởng sau: a) Nhiệt độ Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong sản xuất, vì ảnh hưởng của nhiệt độ là khác nhau đối với các giống vi sinh vật khác nhau. Thông thường chủng VSV phối vào trong chế phẩm lỏng tăng trưởng bình thường ở 370C và có khả năng chịu đựng nhiệt độ lên tới 450C trong 2 năm hoặc nhiều hơn. b) Môi trường 18 Đồ án tốt nghiệp Chế phẩm phân bón vi sinh vật có hiệu quả gần như là giống nhau trong tất cả môi trường, nhưng hiệu quả có thể giảm 20 – 25% trong điều kiện môi trường khí hậu khác nhau. Thông thường, VSV vẫn sẽ hoạt động trong suốt thời gian bảo quản và khi bón xuống đất vẫn sẽ duy trì hoạt động trong suốt mùa vụ hoặc trong suốt chu kỳ cây trồng. Tuy nhiên, VSV có thể bị bất hoạt do một số yếu tố môi trường như nhiệt độ cao, thậm chí là các VSV cạnh tranh. Không những thế nó còn bị mất đi do quá trình rửa trôi, mưa, gió. Tầm quan trọng tương đối của yếu tố này là cần phải lựa chọn việc sử dụng phân bón ở đâu, điều đó làm hạn chế việc sử dụng phân bón VSV. Vì vậy, việc tạo chế phẩm phân bón VSV dạng lỏng có thể chứa các chất phụ gia để bảo vệ VSV chống lại điều kiện bất lợi từ môi trường. c) Ảnh hưởng pH Độ pH đóng vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy, nó phải đảm bảo ổn định trong phạm vi nhất định. Ngoài ra, các chất hóa học có trong đất như magie, mangan, canxi,… làm tăng giá trị pH, khi bị ướt sương hoặc phun nước, có thể ức chế, vô hiệu hóa môt số sinh vật. Điều kiện pH rất cao hoặc rất thấp sẽ làm bất hoạt VSV. Vì vậy, cần phải duy trì pH bằng một chất đệm phụ gia làm cho thời gian sử dụng tốt hơn. Duy trì pH tối ưu nâng cao tuổi thọ của một số các vi sinh vật như Azospirillum, Azotobacter, vi khuẩn phospho hòa tan (PSM),... d) Ổn định VSV trong chế phẩm chất lỏng Đây là giai đoạn bảo quản chế phẩm sau sản xuất. Giai đoạn này có thể kéo dài vài tuần đến nhiều năm. Vi sinh vật có lợi được lưu trữ trong chất lỏng chế phẩm thích hợp cho sự ổn định và tăng trưởng của chúng. Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu sử dụng chất mang để cải thiện sự ổn định của VSV trong suốt thời gian bảo quản. e) Ảnh hưởng ánh sáng mặt trời Các yêu cầu trong quá trình bảo quản trong đó luôn là phải bảo quản các sản phẩm nơi mát tránh xa ánh sáng mặt trời. Bởi vì, trong ánh sáng mặt trời có các tia có hại là tia UVB có bước sóng 280 – 320 nm và tia UVA có bước sóng 320 – 400 19 Đồ án tốt nghiệp nm những tia này có thể gây hại đến VSV có trong chế phẩm. Người ta có thể khắc phục bằng cách có thể bổ sung các chất phản xạ ánh sáng, tán xạ hay sử sử dung các chất hấp thụ bức xạ, chuyển đổi thành những bước sóng ngắn để gây vô hại đến VSV. Tuy nhiên, việc tìm ra những vật liệu hay những chất như thế rất khó khăn và chưa có cơ sở vững chắc cho việc tránh ảnh hưởng của mặt trời đến chế phẩm tạo ra. f) Xử lý và sử dụng chế phẩm phân bón dạng lỏng Chế phẩm phân bón sinh học dạng lỏng đảm bảo dễ dàng xử lý và sử dụng. Điển hình, chế phẩm phân bón lỏng có thể giúp việc duy trì phân bố VSV tránh hiện tượng vón cục nên có thể sử dụng ngay sau thời gian bảo quản. Còn các chế phẩm dạng bột hay viên không thể duy trì tính đồng nhất VSV. Ví dụ như trong tường hợp của Azospirillum mật độ tế bào đi xuống 105 cfu/ml sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng trong khi bảo quản bằng chế phẩm lỏng trong suốt 2 năm mà vẫn duy trì mật độ tế bào 108cfu/ml. Tương tự như vậy, trong khi Azotobacter, Rhizobium ở dạng chế phẩm rắn duy trì hạn sử dụng là 6 tháng, PSM đến 8 tháng, nhưng trong trường hợp bảo quản trong chế phẩm lỏng Azotobacter, PSM và KMB sử dụng đến 2 năm sau, Rhizobium lên đến 14 tháng. Điều này cho thấy sự vượt trội của chế phẩm lỏng so với chế phẩm dạng rắn. 1.3.4. Ưu điểm của phân bón sinh học dạng lỏng Theo Dr. Krishan Chandra và cộng sự (1999), chế phẩm phân bón dạng lỏng có các ưu điểm sau: - Thời gian sử dụng kéo dài hơn từ 12 – 24 tháng. - Không gây ô nhiễm môi trường. - Dễ tương tác với cây trồng. - Có khả năng chịu được nhiệt độ lên đến 450C trong 2 năm. - Kiểm soát chất lượng dễ dàng. - Hiệu quả kinh tế cao. - Dễ dàng xử lý và lưu trữ. 20