B ộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
•
•
•
•
soEQca
TRẦN THỊ HƯƠNG GIANG
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT MỘT
SỐ ALCALOID TỪ LÁ DỪA CẠN
((Catharanthus roseus) LÀM NGUYÊN LIỆU
TỔNG HỢP THUỐC CHỮA UNG THƯ
KHÓA LUẬN TỚT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC
•
•
•
•
•
KHÓA 2005 - 2010
Người hướng dẫn:
ThS Nguyễn Nhị Hà
Nơi thực hiện:
Trung tâm Hóa Dược
Viện Hóa Công Nghiệp Việt Nam
Hà n ộ i, 2010
LỜI CẢM ƠN
Với ỉòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ sự cảm ơn chân
thành tới Th.s. Nguyễn Nhị Hà —Bộ môn Hóa Vô Cơ là người thầy trực tiếp
hướng dân và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa ỉuận này.
Tiếp theo tỏi xin gửi lời cảm 07ĩ chân thành tới
TSNguyễn Thế Hùng —Bộ môn Dược c ổ Truyền.
TS Trần Bạch Dương —Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa Công
Nghiệp Việt Nam
Là những người đã dành nhiều thời gian, tận tình giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài tại Trung tâm Hóa Dược, Viện Hóa Công Nghiệp, Việt
Nam.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các cán bộ nhân viên Trung tâm
Hóa Dược, Viện Hỏa Công Nghiệp, Việt Nam cũng các thầy cô trong bộ môn
Dược Cổ Truyền đã tạo điều kiện thuận lợi để tỏi hoàn thành tốt khóa luận.
Cuối cùng, tói xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm
động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quả trình học tập cũng như trong thời gian
tôi thực hiện khóa luận này.
Hà Nội ngày 17 tháng 5 năm 2010
Sinh viên
Trần Thị Hương Giang
MỤC LỤC
Nội dung
Trang
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VÁN Đ Ề ......................................................... .............................................. 1
PHẢN 1. TỔNG QUAN........................................................................................ 3
1.1 Vài nét về cây Dừa cạn....................................................................................3
1.1.1 Đặc điểm thực vật.........................................................................................3
1.1.2 Tác dụng dược lý của cây Dừa cạn..............................................................5
1.2. Các alcaloid - thành phần hóa học quan trọng nhất từ Dừa cạn................. 7
1.3. Một số phương pháp chiết tách đã được sử dụng................................. . 11
1.3.1 Trên thế giới ...............................................................................................11
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và triển khai trong nước....................................... 14
PHÀN 2. ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP.....................................................17
2.1 Đối tượng nghiên cứu và dụng cụ thiết b ị...................................................17
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu................................................................................. 17
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất..........................................................................17
2.2 Nội dung nghiên cứu....................................................................................20
2.3 Phương pháp thực nghiệm.............................................................................20
PHẦN 3. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ BÀN LU Ậ N ...............................22
3.1 Thực nghiệm và kết quả..............................................................................22
3.1.1 Độ ẩm của dược liệu.................................................................................. 22
3.1.2 Quá trình chiết “alcaloid toàn phần” ........................................................ 22
a) Chiết theo phương pháp ngấm kiệt................................................................ 23
b) Loại bỏ các chất béo và chất m àu................................................................. 24
c) Chiết phân bố.................................................................................................. 24
d) Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố trong quá trình chiết...... ................ 25
3.1.3 Sơ bộ đánh giá thành phần “alcaloid toàn phần” bằng HPLC - MS..... 29
3.1.4 Phân tách các alkaloid Dừa cạn từ “alcaloid toàn phần” bằng phương
pháp sắc ký lỏng trung áp................................................................................... 30
a) Giai đoạn tách thô bằng Sephadex.................................................................30
b) Giai đoạn làm giàu và tách chất.....................................................................32
c) Tinh chế lại bằng sắc ký cột nhanh................................................................ 34
3.1.5 Kết tinh làm sạch và xác định cấu trúc của các chất phân lập được..... 35
3.1.6 Phản ứng tạo muối Catharanthine sulphat............................................ .40
a) Khảo sát một số phương pháp sulfat hóa Catharanthine base......................40
b) Tạo nguyên liệu Catharanthine sulfat............................................................ 43
3.2
Bàn luận..................................................................... .............................. 44
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ X UẤT................................................................ 45
4.1 Kết luận.......................................................................................................... 46
4.2 Đề xuất........................................................................................................... 47
Danh mục các chữ viêt tăt
DL:
Dược liệu
SKLM:
Sắc ký lớp mỏng
Vind. :
Vindoline
Cath. :
Catharanthine
VLB:
Vinblastine
VCR:
Vincristine
RPLC:
Reversed Phase Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng pha đảo
IELC:
lon - Exchange Liquid Chromatography
Sắc ký trao đổi ion
NPLC:
Normal Phase Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng pha thuận
GPLC:
Gas Pressure Liquid Chromatography
Sắc ký khí lỏng
MPLC:
Medium Pressure Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng trung áp
FC:
Fast Chromatography
Sắc ký cột nhanh
HPLC-MS:
High - Pressure Liquid Chromatography Mass Spectroscopy
Sắc ký lỏng cao áp kết nối phổ khối
TLC:
Thin Layer Chromatography
Sắc ký lớp mỏng
HMQC:
Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
HMBC:
Heteronuclear Multiple Bond Connectivity
NMR :
Nuclear Magnetic Resonance
Danh muc các hình
Hình 1.1: Cây Dừa cạn
4
Hình 1.2: Nguyên liệu Dừa cạn
4
Hình 1.3: cấu trúc phân tử của Vindoline
8
Hình 1.5: cấu trúc phân tử của Vinblastine và Vincristine
8
Hình 1.6 : Công thức hóa học của Vindesine,Vinorelbine, Vinflunine
Anhydrovinblastine
9
Hình 1.7: Sơ đồ tóm tắt các quy trình tách chiết và phân lập acaloid
12
Hình 2.1: Thiết bị MPLC
18
Hình 2.2: Thiết bị TC
19
Hình 3.1: Quy trình chiết tách các Vinca alcaloid từ lá Dừa cạn
23
Hình 3.2 : Tỷ lệ acid acetic/ethanol và tỷ lệ alcaloid thu được
26
Hình 3.3 : Lượng alcaloid thu nhận được sau mỗi đợt chiết
28
Hình 3.4: Sơ đồ tách các alcaloid bằng phương pháp sắc ký
30
Hình 3.5: Công thức phân tử VI1+V21 - Vindoline
38
Hình 3.6: Công thức phân tử của V22 - Catharanthine
40
Hình 3.7: Catharanthine sulfat thử (T) và chuẩn (C)
43
4
9cm dài và 1 - 3,5cm rộng, xanh bóng, không lông, với gân lá giữa nhạt màu
hơn và cuống lá ngắn (dài 1 - l, 8 em); mọc thành các cặp đối. Hoa có màu từ
trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu đỏ hơn, ống tràng dài 2,5 - 3cm và
tràng hoa đường kính 2 - 5cm có 5 thùy tương tự như cánh hoa. Quả là một
cặp quả đại dài 2 - 4cm, rộng 3mm chứa 1 2 - 2 0 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình
trứng. [38]
Hình 1.1: Cây Dừa cạn
Hình 1.2: Nguyên liệu Dừa cạn
Trồng cấy và thu hải
Ở Việt Nam, cây Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam và cũng
được trồng vì cho hoa đẹp. Đây là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và
có thời gian canh tác ngắn. Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm nghiên cứu
giống và chế biến thuốc Đà Lạt cho thấy cây Dừa cạn Catharanthus roseus có
thể phát triển tốt trên đất cát khô hạn, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và
tích luỹ đủ hàm lượng alcaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu. Công ty Vimedimex
II kết hợp với Trung tâm Nghiên cứu giống và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã
thử nghiệm canh tác cây Dừa cạn trên các vùng đất cát ven biển các tỉnh miền
Trung để thu hoạch rễ và ỉá phục vụ xuất khẩu với sản lượng hàng trăm tấn
một năm. [2 ]
5
1.1.2 Tác dụng dược ỉý của cây Dừa cạn.
Tác dunz trong dân gian.
Trong dân gian, người ta thường sử dụng nước sắc Catharanthus
roseus với tác dụng lợi tiểu, hạ đường huyết, chữa bệnh lỵ, bệnh xuất huyết
hoặc chữa vết thương hở. Ở Châu Âu, Bắc Phi và Trung Phi, nước sắc của
Dừa cạn được sử dụng làm thuốc lợi tiểu, giảm xung huyết phổi, chữa viêm
họng. Ở Mỹ, Dừa cạn được dùng dưới dạng thuốc đắp để cầm máu. Người Ấn
Độ sử dụng cây này trong trường hợp bị côn trùng cắn. Ngoài ra Dừa cạn còn
được dùng làm thuốc chống viêm mắt ở Caribe và thuốc chữa ho ở Trung
Quốc. [6 ]
Hiện nay, Dừa cạn đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới
nghiên cứu tìm hiểu. Nhiều thử, nghiệm lâm sàng đã và đang được thực hiện
nhằm chứng minh các tác dụng chống ung thư của các alcaloid từ Dừa cạn.
Tác dung chốn2 ung thư của alcaỉoid từ Dừa can. [5-11,14,16,22,26]
Đầu những năm 1950, Noble tại phòng thí nghiệm Collipv - Đại học
Western Ontario - Canada đã nghiên cứu lá Dừa cạn với mục đích tìm hiểu
tác dụng của cây này trên lượng đường huyết trong cơ thể. Thay vì các hoạt
tính trên, ông nhận thấy trong lá Dừa cạn có những chất tác dụng mạnh đến tế
bào bạch cầu và tủy xương. Từ đó, theo hướng nghiên cứu các chất gây độc tế
bào hoặc ức chế phân bào bạch cầu ác tính, cùng với các nhà khoa học khác là
Beer và Cutts, Noble đã chiết ra được chất có hoạt tính chống ung thư đặt tên
là Vincaleukoblastine vào năm 1958, sau đó đổi tên thành Vinblastine. [16]
Cũng đồng thời trong khoảng thời gian đó, một nhóm các nhà khoa học
khác bao gồm Svoboda, Johnson, Neuss và Gorman tại phòng thí nghiệm
Lilly đã nghiên cứu và chứng minh rằng những phân đoạn alcaloid từ Dừa cạn
6
có tác dụng kéo dài khả năng sinh sản của tế bào DBA trên 2 chuột được cấy
tế bào lympho ung thư cấp tính (bệnh bạch cầu P-1534).[16]
Phát hiện ra hoạt tính chống lại bạch cầu P-1534 của Dừa cạn có ý
nghĩa rất quan trọng. Trong một nghiên cứu chuyên sâu về Leurosine,
Svoboda đã tìm ra một alcaloid cấu trúc đôi phân tử (dimeric alcaloid) có cấu
trúc tương tự như Vinblastine. Tác dụng chống tế bào bạch cầu P-1534 của tất
cả những aicaioid trên ỉần đầu tiên được chứng minh tại phòng thí nghiệm
Lilly. [16]
Ke từ sau những thử nghiệm lâm sàng đầu tiên vào thập niên 1960, các
alcaloid từ Dừa cạn như Vinblastine (biệt dược là Velban ® hoặc Velbe ®) và
Vincristine (biệt dược là OncoVin ®), đã được sử dụng rộng rãi như các hóa
trị liệu cho nhiều loại ung thư khác nhau: ung thư máu, ung thư mô bạch
huyết, ung thư tinh hoàn và ung thư vú. [ 1 0 ]
Có thể nói, việc phát hiện ra Vinblastine là một cột mốc quan trọng
trong sự phát triển của hóa trị liệu ung thư. Nó đã mở ra nhiều con đường
nghiên cứu khác như hóa học, sinh học, và lâm sàng nhằm phát hiện và chứng
minh các hoạt tính chống ung thư mới của các alcaloid từ Dừa cạn.
Cơ chế chống uns thư của Dừa can r8,13,16,24-26,361
Ngay sau khi phát hiện ra đặc tính kháng ung thư in vivo của các
alcaloid từ Dừa cạn, đã có rất nhiều thí nghiệm nghiên cứu tập trung vào giải
thích cơ chế tác dụng của chúng. Vinblastine liên kết đặc hiệu với tubulin protein heterodimeric phổ biến trong tất cả các tế bào nhân thật. Tubulin và
dạng polymer của nó là microtubules có vai trò quan trọng trong việc duy trì
hình thái tế bào, vận chuyển nội bào và xây dựng các thoi phân bào trong quá
trình phân chia tế bào. Các alcaloid ức chế sự kết hợp của tubulin vào
microtubules do đó ngăn chặn quá trình phân chia tế bào. Chúng liên kết với
7
p-tubulin tại các vị trí khác nhau (được gọi là miền Vinca của tubulin - miền
này chưa xác định chính xác vị trí). Vì vậy, hoạt tính chống tăng sinh của các
alcaloid Dừa cạn được cho là kết quả của sự tương tác của chúng với các thoi
phân bào. [8,13,36]
Trong các nghiên cứu in vỉữo, tác dụng của Vinca alcaloid trên tubulin
phụ thuộc vào nồng độ. Ở nồng độ thấp (submicromolar), chúng ức chế chức
năng và sự hình thành của microtubules từ tubulin. Ở nồng độ cao nó diệt
được cả tế bào.[25]
Gần đây, Knossow và cộng sự đã công bố tìm ra vị trí gắn kết chính
xác của các alcaloid Dừa cạn trên tubulin. Họ cũng đồng thời công bố các
hình ảnh thu được bằng nhiễu xạ tia X cho thấy vị trí gắn kết này bị xen phủ
một phần với vị trí gắn kết của phomopsin A, một peptit mạch vòng được
phân lập từ loài nấm Phomopsỉn leptostromỉ/omỉs cũng có tác dụng ức chế sự
trùng hợp của các tubulin. [24,25]
1.2. Các alcaloid —thành phần hóa học quan trọng nhất từ Dừa cạn
Phần ở trên mặt đất của cây chứa 0,2 - 1% alcaloid. Đã có khoảng 150
alcaloid được phân lập từ Catharanthus. Nhờ sự phát triển của việc nghiên
cứu tế bào và các phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp mà số
lượng các chất được phát hiện ra ngày càng nhiều hơn. [7]
Xét về mặt cấu trúc, các alcaloid chứa trong loài Catharanthus tồn tại
dưới hai dạng monomer và dimer. Theo I.s. Johnson và cộng sự thì có thể
sắp xếp các alcaloid này vào 3 nhóm lớn:[3]
1. Các alcaloid monomer ( như Vindoline, Catharanthine...)
2. Nhóm các alcaloid dimer indole - dihydroindole (loại Vinblastine)
3. Các alcaloid dimer loại không phải Vinblastine
8
Vindoline (C25H32N 2O6) được Kamat và cộng sự phân lập từ năm 1958,
Gorman và cộng sự xác định cấu trúc năm 1962, được nghiên cứu là có tác
dụng hạ đường huyết.[3] Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy Vindoline là một
dihydroindol alcaloid có thể dùng làm nguyên liệu để sinh tổng họp và tổng
hợp hoá học lên các dimer alcaloid. Pierre Fabre là hãng dược phẩm đầu tiên
đã thương mại hóa sản phẩm Vinblastine bán tổng hợp từ Vindoline và
Catharanthine. [7]
- Vindoline có nhiều trong lá Dừa cạn khoảng 3 tháng tuổi.
- Là tinh thể có điểm chảy 150-155°c [ a] 26D= -18°/CHC13
- ƯVmax 212, 254, 304nm.
Catharanthine
(C 2 1H 2 4 N 2 O 2 ),
được N. Neuss và M. Gorman phân lập và
xác định cấu trúc năm 1961, là alcaloid nhân indol tham gia vào cấu trúc của
Vinblastine. Catharanthine được nghiên cứu là có tác dụng lợi tiểu.[3,7]
- Là tinh thể có điểm chảy 126-128°c, [a]26D= +298°/CHCl3
- ƯVmax 226, 284, 292nm
COOCH3
Hình 1.4: cấu trúc phân tử của Catharanthine (2)
9
Phần được nhiều nhà khoa học quan tâm hơn cả là nhóm 20 alcaloid
cấu trúc đôi phân tử có khả năng chống ung thư, đáng chú ý là Vinblastine và
Vincristine. Các alcaloid này được cấu tạo từ hai phần: một vòng indole và
một vòng dihydroindole. Vì vậy chúng được gọi ỉà các alcaloid đôi phân tử
hay “ bis-indole alcaloid” (thuộc nhóm 1).[3]
Vinblastine được cấu tạo bởi hai alcaloid đơn phân tử là Catharanthine
( ín rlr\1
và ^indolin** ^HiVivHrninHnle^ r*ả hai rViật r»ậy
- Xem thêm -