Tài liệu Nghiên cứu quy trình chế tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng (polymer drug fe3o4 folate) lên tế bào ung thư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ THU HƢƠNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC ĐỘNG CỦA HỆ NANO ĐA CHỨC NĂNG (POLYMER-DRUG- Fe3O4-FOLATE) LÊN TẾ BÀO UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SỸ KHOA HỌC VẬT LIỆU HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NA HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- LÊ THỊ THU HƢƠNG NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC ĐỘNG CỦA HỆ NANO ĐA CHỨC NĂNG (POLYMER-DRUG- Fe3O4-FOLATE) LÊN TẾ BÀO UNG THƢ LUẬN ÁN TIẾN SỸ KHOA HỌC VẬT LIỆU Chuyên ngành: Vật liệu điện tử Mã số: 9440123 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Hà Phƣơng Thƣ 2. GS.TSKH. Nguyễn Xuân Phúc Hà Nội – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam Ďoan Ďây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Hà Phƣơng Thƣ và GS.TSKH. Nguyễn Xuân Phúc và không trùng lặp với bất kỳ công trình khoa học nào khác. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, Ďƣợc các Ďồng tác giả cho phép sử dụng và chƣa Ďƣợc sử dụng Ďể bảo vệ một học vị nào, chƣa từng Ďƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Hà Nội, tháng năm 2018 Tác giả luận án Lê Thị Thu Hƣơng LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc Ďến tập thể giáo viên hƣớng dẫn, TS. Hà Phƣơng Thƣ và GS. TSKH. Nguyễn Xuân Phúc Ďã tận tình hƣớng dẫn, hỗ trợ và Ďịnh hƣớng cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Ďề tài KHCN mã số 106-YS.06-2015.14 (HPT) và Ďề án 911. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh Ďạo Khoa Khoa học vật liệu và năng lƣợng Học viện Khoa học và Công nghệ và Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Phòng thí nghiệm trọng Ďiểm - Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn làm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Ďã tạo Ďiều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất cho tôi trong suốt quá trình thí nghiệm và Ďóng góp các ý kiến về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện và bảo vệ Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Ďốc, BCN Khoa Môi trƣờng và tập thể Bộ môn Hoá học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ďã tạo Ďiều kiện và giúp Ďỡ tôi trong quá trình công tác Ďể tôi hoàn thành luận án này. Xin cảm ơn Ban lãnh Ďạo và bộ phận Đào tạo Viện Khoa học Vật liệu Ďã hỗ trợ tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết khác trong quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc Ďến gia Ďình, Ďã luôn chia sẻ, Ďộng viên tinh thần và là nguồn cổ vũ, giúp Ďỡ tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Luận án. Hà nội, ngày ..... tháng ...... năm 2018 Nghiên cứu sinh Lê Thị Thu Hƣơng i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................v DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ .....................................................................x MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................4 1.1. Khái quát về hệ vật liệu nano y sinh ....................................................................4 1.1.1. Cấu trúc của hệ nano y sinh ......................................................................4 1.1.2. Các chức năng y sinh của hệ .....................................................................6 1.2. Phƣơng pháp tổng hợp hạt nano Fe3O4 ................................................................7 1.2.1. Phƣơng pháp Ďồng kết tủa .........................................................................7 1.2.2. Phƣơng pháp thuỷ nhiệt ............................................................................9 1.2.3. Phƣơng pháp phân huỷ nhiệt .....................................................................9 1.2.4. Sử dụng kĩ thuật vi sóng trong tổng hợp Fe3O4 ......................................10 1.3. Tính chất và ứng dụng của hạt nano Fe3O4 trong y sinh học ............................11 1.3.1. Một số tính chất từ cơ bản của hạt nano oxit sắt từ Fe3O4 ......................11 1.3.2. Mang thuốc hƣớng Ďích ..........................................................................13 1.3.3. Nhiệt trị và phóng thích thuốc dựa trên hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng từ .15 1.3.4. Tăng cƣờng Ďộ tƣơng phản ảnh cộng hƣởng từ hạt nhân .......................18 1.3.5. Hệ nano Ďa chức năng .............................................................................20 1.4. Vấn Ďề của hạt nano oxit sắt từ cho các ứng dụng y sinh ..................................23 1.5. Chức năng hoá bề mặt hạt Fe3O4 .......................................................................25 1.5.1. Bền hoá hạt nano Fe3O4 bằng polime tổng hợp ......................................25 1.5.2. Bền hoá hạt nano Fe3O4 bằng polime tự nhiên .......................................26 1.5.3. Kết hợp các thuốc chống ung thƣ ...........................................................29 1.5.4. Yếu tố hƣớng Ďích folate .........................................................................31 Kết luận chƣơng 1 .....................................................................................................33 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................34 2.1. Tổng hợp vật liệu ...............................................................................................34 2.1.1. Nguyên vật liệu .......................................................................................34 2.1.2. Tổng hợp hạt nano oxit sắt từ bằng phƣơng pháp Ďồng kết tủa ..............34 ii 2.1.3. Tổng hợp hạt nano Fe3O4 theo phƣơng pháp Ďồng kết tủa sử dụng kĩ thuật vi sóng ......................................................................................................34 2.1.4. Bọc hạt nano Fe3O4 bằng polime sinh học ..............................................36 2.1.5. Mang thuốc Curcumin và Doxorubicin lên hệ ........................................36 2.1.6. Gắn yếu tố hƣớng Ďích folate ..................................................................37 2.1.7. Kết hợp chấm lƣợng tử CdTe..................................................................38 2.2. Các phƣơng pháp Ďặc trƣng tính chất của hệ.....................................................39 2.2.1. Nhiễu xạ tia X .........................................................................................39 2.2.2. Phổ hấp thụ hồng ngoại ...........................................................................40 2.2.3. Phổ UV-Vis và huỳnh quang ..................................................................40 2.2.4. Phân tích nhiệt .........................................................................................41 2.2.5. Hiển vi Ďiện tử .........................................................................................42 2.2.6. Các phƣơng pháp Ďo từ ...........................................................................42 2.2.7. Phổ tán xạ ánh sáng Ďộng ........................................................................42 2.2.8. Đốt nóng cảm ứng từ ...............................................................................43 2.2.9. Xác Ďịnh hiệu suất và dung lƣợng mang thuốc .......................................43 2.2.10. Quá trình giải phóng thuốc in vitro .......................................................43 2.2.11. Giải phóng thuốc bằng Ďốt nóng cảm ứng ............................................44 2.3. Thử nghiệm sinh học .........................................................................................44 2.3.1. Thử nghiệm khả năng nhập bào và Ďộc tính tế bào của FOC và FOCF .44 2.3.2. Xác Ďịnh phân bố của hệ nano mang curcumin tại các cơ quan trên chuột ...........................................................................................................................45 2.3.3. Xác Ďịnh Ďộc tính tế bào của FAD, FADF, FAQ và FADQ ...................46 2.3.4. Thí nghiệm xác Ďịnh khả năng Ďiều trị in vivo của các hệ Ďa chức năng mang Dox kết hợp với Ďốt nóng cảm ứng từ ....................................................46 2.4. Phƣơng pháp xử lí số liệu ..................................................................................48 CHƢƠNG 3: HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG OCMCS MANG CURCUMIN ....49 3.1. Tổng hợp hạt nano Fe3O4 ...................................................................................49 3.1.1. Hạt nano Fe3O4 tổng hợp theo phƣơng pháp Ďồng kết tủa thông thƣờng ...........................................................................................................................49 3.1.2. Hạt nano Fe3O4 tổng hợp theo phƣơng pháp Ďồng kết tủa có hỗ trợ của vi sóng ...................................................................................................................50 iii 3.2. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng curcumin lên tính chất các hệ mang Curcumin (FOC1-FOC5) ...........................................................................................................55 3.3. Hệ nano mang curcumin (FOC) và mang Curcumin gắn folate (FOCF) ..........57 3.3.1. Phổ hồng ngoại ........................................................................................57 3.3.2. Phổ huỳnh quang .....................................................................................58 3.3.3. Ảnh hiển vi Ďiện tử quét (FeSEM) ..........................................................59 3.3.4. Phân tích nhiệt .........................................................................................60 3.3.5. Giản Ďồ nhiễu xạ tia X và Ďƣờng cong từ trễ ..........................................61 3.3.6. Kết quả Ďốt nóng cảm ứng từ ..................................................................62 3.3.7. Độ bền của FOC và FOCF trong môi trƣờng sinh lí...............................64 3.3.8. Quá trình giải phóng thuốc in vitro .........................................................64 3.3.9. Độc tính tế bào ........................................................................................66 3.3.10. Phân bố sinh học ...................................................................................68 Kết luận chƣơng 3:....................................................................................................71 CHƢƠNG 4: HẠT NANO Fe3O4 BỌC BẰNG ALGINATE MANG DOXORUBICIN .......................................................................................................72 4.1. Ảnh hƣởng của nồng Ďộ alginate Ďến khả năng mang Dox và các tính chất của hệ nano ......................................................................................................................72 4.1.1. Phổ hồng ngoại và phổ huỳnh quang ......................................................72 4.1.2. Dung lƣợng thuốc và hiệu suất mang thuốc............................................73 4.1.3. Phân bố kích thƣớc và ảnh TEM .............................................................74 4.1.4. Giản Ďồ nhiễu xạ tia X và Ďƣờng cong từ trễ .........................................76 4.1.5. Kết quả Ďốt nóng cảm ứng từ ..................................................................77 4.1.6. Phân tích nhiệt .........................................................................................80 4.1.7. Quá trình giải phóng thuốc in vitro .........................................................81 4.1.8. Độc tính tế bào ........................................................................................83 4.2. Ảnh hƣởng của lõi Fe3O4 tổng hợp vi sóng tới tính chất hệ nano .....................86 4.2.1. Một số Ďặc trƣng vật liệu và kết quả Ďốt nóng cảm ứng từ .....................86 4.2.2. Độc tính tế bào ........................................................................................88 4.3. Hệ nano mang Dox gắn folate (FADF) hoặc CdTe (FADQ) ............................88 4.3.1. Phổ hồng ngoại ........................................................................................89 iv 4.3.2. Phổ huỳnh quang .....................................................................................89 4.3.3. Kích thƣớc hạt và thế Zeta ......................................................................91 4.3.4. Giản Ďồ XRD...........................................................................................91 4.3.5. Tính chất từ và khả năng Ďốt nóng cảm ứng ...........................................92 4.3.6. Quá trình giải phóng Dox thụ Ďộng và chủ Ďộng nhờ hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng .............................................................................................................93 4.3.7. Độc tính tế bào ........................................................................................96 4.3.8. Độ bền của FAD, FADF và FADQ trong môi trƣờng sinh lí .................99 4.3.9. Kết quả thử nghiệm in vivo ...................................................................100 Kết luận chƣơng 4 ...................................................................................................105 KẾT LUẬN .............................................................................................................107 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................................109 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ....................110 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................112 v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Alg: alginate CS% (% cell survival): chỉ số tế bào sống sót (%) Cur: Curcumin DLS (dynamic light scattering): tán xạ ánh sáng Ďộng Dox: Doxorubicin Drug: thuốc DrTGA: tốc Ďộ mất khối lƣợng DTA (differential thermal gravity analysis): phân tích nhiệt vi sai EE (encapsulating efficiency): hiệu suất mang thuốc EPR (enhanced permeability and retention effect): Hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lƣu FA: mẫu Fe3O4 tổng hợp vi sóng bọc bằng alginate nồng Ďộ 4 mg/ml FA2D-FA10D: các mẫu Fe3O4 bọc bằng alginate nồng Ďộ khác nhau mang doxorubicin FA2-FA10: các mẫu Fe3O4 bọc bằng alginate nồng Ďộ khác nhau FAD: mẫu Fe3O4 tổng hợp vi sóng bọc bằng alginate nồng Ďộ 4 mg/ml mang doxorubicin FADF: mẫu Fe3O4 tổng hợp vi sóng bọc bằng alginate nồng Ďộ 4 mg/ml mang doxorubicin gắn folate FADQ: mẫu Fe3O4 tổng hợp vi sóng bọc bằng alginate nồng Ďộ 4 mg/ml mang doxorubicin gắn CdTe FeSEM (field emission Scanning electron mỉctoscopy): hiển vi Ďiện tử quét phát xạ trƣờng FL: tế bào ung thƣ cơ vân tim FOC (hoặc FOC3): Fe3O4 bọc bằng OCMCS mang curcumin với lƣợng curcumin tham gia phản ứng là 60 mg FOC1-FOC5: Fe3O4 bọc bằng OCMCS mang curcumin với lƣợng curcumin tham gia phản ứng khác nhau (từ 20-100 mg) vi FOCF: Fe3O4 bọc bằng OCMCS mang curcumin gắn folate (với lƣợng curcumin tham gia phản ứng là 60 mg) Fol: folate FR (folate receptor): thụ thể folate H: cƣờng Ďộ từ trƣờng Hc: lực kháng từ Hela: tế bào ung thƣ cổ tử cung Hep-G2: tế bào ung thƣ gan HT-29: tế bào ung thƣ ruột kết IC50 (inhibition concentration): nồng Ďộ ức chế 50% số tế bào ILP (intrinsic loss power): công suất tổn hao nội tại LC (loading content): dung lƣợng thuốc LU-1: tế bào ung thƣ phổi không phải tế bào nhỏ M (magnetization): từ Ďộ Ms (satutation magnetization): từ Ďộ bão hòa Mr (magnetic remanance): từ dƣ M1-M11: các mẫu Fe3O4 tổng hợp vi sóng MIH (magnetic inductive heating): Ďốt nóng cảm ứng từ MNP (magnetic nanoparticles): hạt nano từ MRI (magnetic resonance image): ảnh cộng hƣởng từ OCMCS: O- Cacboxylmetyl chitosan QD (quantum dots): chấm lƣợng tử SAR (specific absorption rate): tốc Ďộ hấp thụ riêng SD (standard deviation): Ďộ lệch chuẩn SLP (specific loss power): công suất tổn hao riêng TEM (transmission electron microscopy): hiển vi Ďiện tử truyền qua TGA (thermal gravity analysis): phân tích nhiệt Vero: tế bào biểu mô thận khỉ vii VSM (vibration sample magnetometry): từ kế mẫu rung XRD (X-ray Diffraction): nhiễu xạ tia X viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Điều kiện thực nghiệm chế tạo Fe3O4 trong lò vi sóng ............................35 Bảng 2.2: Kí hiệu và mô tả mẫu ................................................................................38 Bảng 3.1: Điều kiện phản ứng và thông số từ của các mẫu Fe3O4 tổng hợp bằng kĩ thuật vi sóng ..............................................................................................................51 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát hàm lƣợng curcumin .....................................................55 Bảng 3.3: Số liệu từ Ďộ bão hoà của lõi Fe3O4 trong 2 hệ nano mang curcumin ......62 Bảng 3.4: Thông số Ďốt nóng cảm ứng của các mẫu mang curcumin ......................63 Bảng 3.5: Thế Zeta (mV) của FOC và FOCF trong các dung dịch nồng Ďộ NaCl 0,2 M và có pH khác nhau ..............................................................................................64 Bảng 3.6: Kết quả giải phóng curcumin theo thời gian ............................................65 Bảng 4.1: Giá trị EE và LC của FA2D-FA10D ........................................................74 Bảng 4.2: Các thông số từ của các mẫu bọc bằng alginate .......................................77 Bảng 4.3: Số liệu Ďốt nóng cảm ứng từ của các mẫu FA4, FA4D, FA8 và Fe3O4 ..79 Bảng 4.4: Từ Ďộ bão hoà của lõi Fe3O4 trong hệ FA4 và FA4D ..............................80 Bảng 4.5: %Dox giải phóng từ FA4 ở pH 7,4 và pH 5 .............................................82 Bảng 4.6: Nhiệt Ďộ bão hoà (oC) trong quá trình Ďốt nóng cảm ứng từ của FA và FAD ...........................................................................................................................87 Bảng 4.7: IC50 của hệ mẫu vi sóng so với mẫu Ďồng kết tủa thông thƣờng..............88 Bảng 4.8: Tính chất từ và nhiệt Ďộ bão hoà của quá trình Ďốt nóng cảm ứng của FAD, FADF, FAQ, FADQ ........................................................................................92 Bảng 4.9: Thông số giải phóng Dox khi Ďốt nóng với từ trƣờng khác nhau ............95 Bảng 4.10: Chỉ số tế bào sống sót (CS% ± SD) của các mẫu chứa CdTe trên các dòng tế bào tại nồng Ďộ khác nhau ............................................................................97 Bảng 4.11: Giá trị IC50 (µg/ml) của các mẫu chứa CdTe trên các dòng tế bào ........98 ix Bảng 4.12: Thế Zeta (mV) của FAD, FADF và FADQ trong dung dịch có nồng Ďộ NaCl 0,2 M và các pH khác nhau .............................................................................99 Bảng 4.13: Phân bố Fe trên các cơ quan của chuột (ppm) ......................................101 x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Sơ Ďồ cấu tạo hệ nano Ďa chức năng [21]. ..................................................5 Hình 1.2: Cấu trúc Ďơn và Ďa Ďômen của hạt Fe3O4 theo kích thƣớc (a) và Ďƣờng cong từ hoá của vật liệu sắt từ dạng khối (hình lớn) so với dạng siêu thuận từ (hình nhỏ) (b) [62] ..............................................................................................................12 Hình 1.3: Sơ Ďồ minh họa cơ chế hƣớng Ďích bằng từ trƣờng ngoài [62] ................14 Hình 1.4: Nồng Ďộ hạt từ ở khối u và mô lành trong não của chuột Ďƣợc hƣớng Ďích bằng từ (n=4) và chuột Ďối chứng (n=3) [72] ...........................................................15 Hình 1.5: Chuyển Ďộng quay trong hồi phục Néel (a) momen từ quay trong khi hạt cố Ďịnh; hồi phục Brown (b) momen từ tƣơng ứng với trục tinh thể, không Ďổi khi hạt quay [79] .............................................................................................................16 Hình 1.6: (a) Sự tăng nhiệt Ďộ theo thời gian của hệ hạt nano từ 20 mg/ml mang TMX trong từ trƣờng 230 kHz, 100 Oe. (b) Phóng thích thuốc TMX chủ Ďộng bằng cách bật và tắt từ trƣờng ngoài. (c) Sơ Ďồ minh hoạ quá trình phóng thích thuốc nhờ áp từ trƣờng xoay chiều [83] .....................................................................................18 Hình 1.7: Nguyên tắc chụp ảnh cộng hƣởng từ [90].................................................19 Hình 1.8: Ảnh MRI chụp ở chế Ďộ T2 (TE=150 ms) các ống 5-mm với nồng Ďộ hạt từ bọc mantol khác nhau [93]....................................................................................20 Hình 1.9: Ảnh MRI của khối u KB trên chuột nude trƣớc (a, c) và 4h sau khi tiêm hạt từ (b, d) [95] ........................................................................................................20 Hình 1.10: Hiệu ứng Ďốt nóng cảm ứng của hệ Fe3O4/SiO2 5 mg/ml và Ďồ thị SAR Tmax theo cƣờng Ďộ từ trƣờng [97].............................................................................21 Hình 1.11: Ảnh MR theo nồng Ďộ của hạt nano Fe3O4/BSA–DEX–FA (chế Ďộ chụp TR¼ 3000 ms, TE¼ 13,2 ms)[99]. ...........................................................................21 Hình 1.12: Phân tích ảnh hiển vi huỳnh quang của mẫu PAAIO-Rh123 và PAAIORh123-FA-PEG với nồng Ďộ 100mg/mL nhập bào vào tế bào FR(+) KB theo các thời gian khác nhau ở 37oC [11] ...............................................................................23 Hình 1.13: Cấu tạo hoá học của OCMCS .................................................................27 Hình 1.14: Cấu tạo của mạch Alginat và hình ảnh rong nâu ....................................28 Hình 1.15: Các bƣớc tổng hợp hệ nano từ mang curcumin [139] ............................30 xi Hình 1.16: Cấu trúc hoá học của curcumin (a), Doxorubicin (b) và axit folic (c) ....30 Hình 1.17: (a) Phân tử Doxorubicin, (b) Fe3O4 bọc bằng chitosan, (c) Fe3O4 bọc bằng chitosan mang Doxorubicin [143]. ...................................................................31 Hình 1.18: Ảnh hiển vi huỳnh quang Ďồng tiêu của tế bào ung thƣ gan HT29 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst 33342 (màu xanh) và Doxorubicin tự do, hạt nano PLATPGS mang Dox và hạt nano PLA-TPGS mang Dox có gắn folate (màu Ďỏ) [151] ...................................................................................................................................32 Hình 2.1: Sơ Ďồ tổng hợp các hệ dẫn thuốc Ďa chức năng ........................................39 Hình 2.2: Điều kiện nuôi chuột Ďƣợc duy trì ổn Ďịnh và thực nghiệm tiêm thuốc vào khối u trên chân phải chuột .......................................................................................47 Hình 2.3: Hệ thiết bị Ďốt từ .......................................................................................48 Hình 3.1: Các Ďặc trƣng của hạt nano Fe3O4 tổng hợp bằng phƣơng pháp Ďồng kết tủa: a) Phổ hồng ngoại, b) Giản Ďồ XRD, c) Đƣờng cong từ hoá, d) Ảnh SEM, e) Ảnh TEM...................................................................................................................50 Hình 3.2: Đƣờng cong từ hoá của các mẫu (các hình bên phải là hình phóng to của các Ďƣờng từ hoá tƣơng ứng tại vị trí gần gốc toạ Ďộ) ..............................................52 Hình 3.3: Giản Ďồ XRD của các mẫu Fe3O4 chế tạo bằng vi sóng ...........................53 Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của các mẫu Fe3O4 vi sóng .............................................54 Hình 3.5: Ảnh SEM mẫu M5 ....................................................................................54 Hình 3.6: Ảnh TEM và phổ DLS của mẫu Fe3O4 M5 phân tán trong nƣớc .............55 Hình 3.7: Đƣờng cong từ hoá của các mẫu chế tạo với lƣợng curcumin khác nhau 56 Hình 3.8: Thế Zeta của các hệ mang curcumin a) FOC1, b) FOC2, c) FOC3, d) FOC4 và e) FOC5 .....................................................................................................57 Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của (a) Fe3O4, (b) OCMCS, (c) Curcumin, (d) FOC ......58 Hình 3.10: Phổ hồng ngoại của (a) folate, (b) FOC và (c) FOCF.............................58 Hình 3.11: Phổ huỳnh quang của FOC và curcumin ................................................59 Hình 3.12: Ảnh Fe-SEM của (a) Fe3O4, (b) Fe3O4/OCMCS, (c) FOC và (d) FOCF 60 xii Hình 3.13: Giản Ďồ phân tích nhiệt (a) DrTGA, (b) TGA và (c) DTA của mẫu FOC (trái) và FOCF (phải) ...............................................................................................61 Hình 3.14: Mô hình cấu trúc hệ FOC và FOCF ........................................................61 Hình 3.15: Giản Ďồ nhiễu xạ tia X của (a) Fe3O4, (b) FOC và (c) FOCF .................62 Hình 3.16: Đƣờng cong từ trễ của (a) Fe3O4,(b) FOC và (c) FOCF .........................62 Hình 3.17: (a) Đƣờng Ďốt nhiệt và (b) Đồ thị tƣơng quan tốc Ďộ tăng nhiệt ban Ďầu (dT/dt) và nhiệt Ďộ bão hòa Ts theo nồng Ďộ hạt từ của hệ FOC ..............................63 Hình 3.18: (a) Đƣờng Ďốt nhiệt và (b) Đồ thị tƣơng quan tốc Ďộ tăng nhiệt ban Ďầu (dT/dt) và nhiệt Ďộ bão hòa Ts theo nồng Ďộ hạt từ của hệ FOCF ............................64 Hình 3.19: (a) Phổ UV-vis của các dung dịch curcumin trong dung môi etanol/nƣớc (1/1) ở các nồng Ďộ khác nhau (1) 0,01 mg/ml; (2) 0,008 mg/ml; (3) 0,06 mg/ml; (4) 0,04 mg/ml; (5) 0,04 mg/ml và (b) Đƣờng chuẩn của curcumin trong dung môi etanol/nƣớc (1/1) .......................................................................................................65 Hình 3.20: Biểu Ďồ giải phóng curcumin của 2 hệ mẫu tại pH=7,4 và pH=5 ..........66 Hình 3.21: Ảnh huỳnh quang của tế bào HT29 trong Ďiều kiện bình thƣờng (control) và trong Ďiều kiện ủ 15 giờ với hệ FOC ....................................................................67 Hình 3.22: Đƣờng cong Ďáp ứng liều của tế bào HT29 ủ với curcumin tinh chất (a Ďƣờng phía trên), hệ FOC (a - Ďƣờng phía dƣới) và (b) Fe3O4/OCMCS. .................68 Hình 3.23: Phân bố của FOC và FOCF trên các cơ quan của chuột (hạt từ xuất hiện dƣới dạng các chấm màu nâu Ďậm) ...........................................................................71 Hình 4.1: Phổ IR của Fe3O4, Alginate, Dox, FA4, FA8 và FA4D ..........................73 Hình 4.2: Phổ huỳnh quang của Dox và FA4D (cùng nồng Ďộ Dox) .......................74 Hình 4.3: Phân bố kích thƣớc của các mẫu FA4, FA8, FA4D, FA8D .....................74 Hình 4.4: Ảnh TEM và phân bố kích thƣớc hạt của FA4D ......................................75 Hình 4.5: Giản Ďồ XRD của FA4D ...........................................................................76 Hình 4.6: Tính chất từ của các hệ hạt........................................................................76 Hình 4.7: Đƣờng cong Ďốt nóng cảm ứng từ (a, b, c) và so sánh nhiệt Ďộ bão hoà, tốc Ďộ tăng nhiệt ban Ďầu (d) của các mẫu. ...............................................................78 xiii Hình 4.8: Biểu Ďồ so sánh giá trị SAR các mẫu ở nồng Ďộ 1 và 3 mg/ml ................79 Hình 4.9: Giản Ďồ phân tích nhiệt của FA4 (a) và FA4D (b) ...................................80 Hình 4.10: Sơ Ďồ cấu trúc của FAD và FADF ..........................................................81 Hình 4.11: Quá trình giải phóng thuốc của FA4D ở pH 7,4 và pH 5 .......................82 Hình 4.12: Đƣờng cong Ďáp ứng liều và tƣơng quan giá trị IC50 của hệ FA4D trên các dòng tế bào Hep-G2, LU-1, RD, FL và Vero. ....................................................83 Hình 4.13: Hình ảnh tế bào LU-1 và Hep-G2 ủ với Dox và FA4D ở các nồng Ďộ khác nhau...................................................................................................................86 Hình 4.14: Thế Zeta của FA (a) và FAD (b) .............................................................86 Hình 4.15: Đƣờng cong Ďốt nóng cảm ứng từ của FA ở các từ trƣờng khác nhau, nồng Ďộ 2 mg/ml (a) và ở từ trƣờng 80 Oe, các nồng Ďộ khác nhau (b) và FAD ở Ďiều kiện tƣơng tự (c), (d) .........................................................................................87 Hình 4.16: Phổ hồng ngoại của FADF so với các thành phần ..................................89 Hình 4.17: Phổ huỳnh quang của FADF so với folate và Dox (a) và các mẫu chứa chấm lƣợng tử CdTe (b) ............................................................................................90 Hình 4.18: Ảnh TEM và phổ DLS của a) FADF và b) FADQ .................................91 Hình 4.19: Giản Ďồ XRD ..........................................................................................92 Hình 4.20: Tính chất từ (a) và Ďƣờng cong Ďốt nóng cảm ứng của FADF (b), FAQ (c) và FADQ (d) ........................................................................................................93 Hình 4.21: Kết quả giải phóng Doxorubicin từ FADF .............................................93 Hình 4.22: Khả năng Ďốt nóng cảm ứng từ ở pH 5 và pH 7,4 của mẫu FADF 1 mg/ml ........................................................................................................................94 Hình 4.23: Nhiệt Ďộ và %Dox giải phóng bởi từ trƣờng ..........................................95 Hình 4.24: Độc tính tế bào của các hệ mẫu chứa Doxorubicin ................................96 Hình 4.25: Chỉ số sống sót của tế bào khi ủ với các mẫu chứa CdTe: (a) CdTe, (b) FAQ, (c) FADQ ........................................................................................................97 Hình 4.26: Độc tính tế bào của các hệ mẫu chứa CdTe (CdTe, FAQ và FADQ) ...99 Hình 4.27: Hình ảnh giải phẫu bệnh khối u có nhiều nhân quái, nhân chia ...........100 xiv Hình 4.28: Hình ảnh giải phẫu các cơ quan : a - gan, b – lách, c - thận, d – u; trái – Ďối chứng, giữa – FAD, phải – FADF ....................................................................102 Hình 4.29: Kết quả Ďịnh lƣợng sắt ở các cơ quan sau tiêm tĩnh mạch (G: gan, L: lách, M: máu, T: thận, U: u) ....................................................................................102 Hình 4.30: Trọng lƣợng của các nhóm chuột trong quá trình Ďiều trị ....................103 Hình 4.31: Sự thay Ďổi kích thƣớc khối u trong quá trình Ďiều trị in vivo .............103 Hình 4.32: (a) Các chuột trong quá trình Ďiều trị và (b) kích thƣớc khối u sau Ďiều trị lần 8 - Đối chứng (Trái trên), FA (Phải trên), FAD (Trái dƣới) và FADF (Phải dƣới) ........................................................................................................................104 Hình 4.33: Kích thƣớc khối u giảm ở các nhóm chuột Ďƣợc Ďiều trị .....................105 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay, sự phát triển của khoa học và công nghệ Ďã Ďem lại nhiều tiến bộ vƣợt bậc trong sinh y học nhƣng loài ngƣời vẫn Ďang phải Ďối diện với nhiều loại bệnh nan y, Ďiển hình nhất là bệnh ung thƣ. Hiện nay có rất nhiều thuốc Ďiều trị ung thƣ trên thị trƣờng. Tuy nhiên, nhƣợc Ďiểm lớn nhất của các loại thuốc Ďiều trị ung thƣ là ít tan trong nƣớc hoặc dễ bị Ďào thải, tính Ďịnh hƣớng chọn lọc không cao và dù ít hay nhiều Ďều ảnh hƣởng không tốt Ďối với sức khỏe bệnh nhân vì có tác dụng phụ kèm theo nhƣ các triệu chứng buồn nôn, tiêu chảy, gây thiếu máu, giảm miễn dịch của cơ thể. Nguyên nhân là do phần lớn các phƣơng thức Ďiều trị không chỉ tác Ďộng cục bộ lên khối u mà còn ảnh hƣởng Ďến một bộ phận lớn các mô và cơ quan lành của cơ thể [1]. Để khắc phục những nhƣợc Ďiểm của phƣơng pháp nêu trên, các nhà nghiên cứu Ďã ứng dụng công nghệ nano, sử dụng vật liệu với kích thƣớc nano mét làm phƣơng tiện dẫn các loại thuốc Ďặc trị ung thƣ nhƣ Curcumin, Paclitaxel, Doxorubicin… Ďến khối u một cách an toàn [2–4]. Bên cạnh Ďó vật liệu nano từ Ďã và Ďang Ďƣợc nghiên cứu mạnh mẽ nhằm ứng dụng trong sàng lọc tế bào ung thƣ, chẩn Ďoán ung thƣ bằng hình ảnh cộng hƣởng từ MRI, nhiệt trị bằng cách làm tăng nhiệt Ďộ vùng khối u khi Ďƣợc Ďặt trong từ trƣờng, và Ďặc biệt là dẫn truyền thuốc dƣới ảnh hƣởng của nam châm... [5, 6] Các hạt nano từ và thuốc chống ung thƣ Ďƣợc bọc bởi các lớp vỏ là các polymer thiên nhiên hoặc polymer tổng hợp nhƣ dextran, dextran biến tính, chitosan, chitosan biến tính, alginate, PLA-TPGS, PLAPEG…và trên bề mặt có thể Ďƣợc gắn thêm một số yếu tố hƣớng Ďích nhƣ acid folic (folate), aptamer, tranferin, lectin và kháng thể. Hệ nano Ďa chức năng nhƣ vậy sẽ tăng hiệu quả tác Ďộng Ďối với các tế bào ung thƣ nhất Ďịnh, giải quyết phần nào yêu cầu của phƣơng pháp hóa trị là phải có tính chọn lọc cao Ďối với tế bào ung thƣ. Lợi ích là: Sử dụng vật liệu này cho phép giảm liều thuốc dùng, giúp ngƣời bệnh tránh Ďƣợc các tác dụng phụ không mong muốn; tập trung thuốc vào vị trí khối u, tránh tác Ďộng Ďến tế bào lành [7, 8]. Từ những vấn Ďề nêu trên cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng hạt nano lõi Fe3O4, lớp vỏ bọc là các polime nhƣ chitosan biến tính, dextran biến tính, alginate, copolime…, gắn thêm Ďuôi folate nhƣ một phƣơng tiện chuyên 2 chở thuốc Curcumin (Cur) hoặc Doxorubicin (Dox) Ďến Ďúng Ďích là khối u ung thƣ một cách an toàn. Trên thế giới, một số nghiên cứu về hệ nano Ďa chức năng dùng trong y sinh học, Ďặc biệt là trong Ďiều trị ung thƣ Ďã Ďƣợc công bố [9–11], tuy nhiên, Ďây vẫn là hƣớng nghiên cứu mới với nhiều triển vọng. Ở Việt Nam, một số nhóm nghiên cứu Ďã công bố các công trình liên quan Ďến việc tổng hợp hạt nano từ và ứng dụng trong xử lí môi trƣờng [12, 13]. Các nghiên cứu Ďịnh hƣớng sử dụng hạt nano từ trong y sinh chủ yếu khai thác khả năng nhiệt từ trị của vật liệu này [14–16]. Tính chất quang và khả năng hƣớng Ďích Ďƣợc nghiên cứu rất hạn chế. Trên cơ sở các phân tích kể trên, chúng tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu chế tạo và đánh giá hiệu quả tác động của hệ nano đa chức năng (polymer-drugFe3O4-folate) lên tế bào ung thƣ”. 2. Mục tiêu nghiên cứu chính của luận án: Mục tiêu chung của luận án là tạo Ďƣợc các hệ nano Ďa chức năng có thể sử dụng Ďể chuẩn Ďoán và Ďiều trị ung thƣ. Trong Ďó, mục Ďích Ďặc thù của luận án này là tạo Ďƣợc các hệ có Ďồng thời các chức năng: mang thuốc - từ - quang và hƣớng Ďích. Mục tiêu nghiên cứu cụ thể gồm có: - Chế tạo Ďƣợc hệ nano Ďa chức năng gồm: vật liệu kích thƣớc nano Fe3O4 (có tính chất từ) Ďƣợc bọc bởi polyme tƣơng thích sinh học, gắn yếu tố hƣớng Ďích (folate), mang thuốc (drug) ((Curcumin, Doxorubicin) (tính chất quang)), phân tán tốt trong nƣớc, có khả năng nhắm Ďích ung thƣ. - Thử nghiệm và Ďánh giá Ďƣợc hiệu quả tác Ďộng của hệ hạt nano lên các dòng tế bào ung thƣ nhƣ HT29; HeLa; HepG2... và trên Ďộng vật thực nghiệm. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án: Luận án thực hiện các nội dung sau: - Chế tạo các hệ nano Ďa chức năng trên cơ sở hạt nano từ Fe3O4, bọc bởi polime cacboxylmetyl chitosan hoặc alginate, mang thuốc curcumin hoặc doxorubicin, gắn folate. - Xác Ďịnh các Ďặc trƣng về vật liệu: cấu trúc, hình thái, tính chất từ, quang, dung lƣợng mang thuốc, Ďộ bền, khả năng phân tán cả hệ nano Ďa chức năng Ďã chế tạo.