Tài liệu Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (pangasius hypophthalmus)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ THỊ THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2018 i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ THỊ THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN COLLAGEN TỪ DA CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) Chuyên ngành: Chế biến Thực phẩm và Đồ uống Mã số chuyên ngành: 62540201 Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Quản Lê Hà Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Đặng Minh Nhật Phản biện 1: GS.TSKH. Nguyễn Minh Tuyển Phản biện 2: GS.TS. Lê Văn Việt Mẫn Phản biện 3: TS. Lê Thị Minh Thủy NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. GS.TS. Phan Đình Tuấn 2. PGS.TS. Nguyễn Hoàng Dũng ii LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định. Tác giả luận án Lê Thị Thu Hương iii TÓM TẮT LUẬN ÁN 1. Tính cấp thiết của luận án Collagen là một loại protein chủ yếu của chất nền ngoại bào và mô liên kết [1], [2]. Collagen chiếm 30 % tổng lượng protein của cơ thể, đóng vai trò then chốt trong thành phần cấu tạo của các mô liên kết như da, gân, xương, dây chằng,…Collagen là một loại vật liệu sinh học được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm [3], [4]. Trước đây, collagen được tinh chế từ các nguồn nguyên liệu da và xương của trâu, bò, lợn. Từ năm 2000 đến nay, do sự bùng nổ của bệnh bò điên, bệnh lở mồm long móng ở lợn và gia súc; thêm vào đó, vì lý do tôn giáo một số đạo cấm sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ bò, lợn nên đa số các nghiên cứu tách chiết collagen tập trung vào nguồn nguyên liệu thay thế có nguồn gốc từ thủy sản. Việt Nam là một trong những quốc gia xuất khẩu thủy sản lớn của thế giới, chủ yếu là mặt hàng phi lê cá tra, cá ba sa. Lượng phụ phẩm của hai loại cá này thải ra hàng năm lên tới hàng trăm ngàn tấn. Tại thời điểm hiện tại, phụ phẩm cá tra, cá ba sa chủ yếu được chế biến thành thức ăn gia súc và phân bón có giá trị kinh tế thấp. Trong khi đó, da cá tra chứa một lượng collagen khá lớn, đây là sản phẩm có giá trị cao, được ưa chuộng trên thị trường thế giới, có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và vật liệu sinh học. Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra nhằm đa dạng hóa các sản phẩm có nguồn gốc từ thủy sản, nâng cao giá trị kinh tế của loài cá tra, cá ba sa, từ đó nâng cao thu nhập cho người nuôi trồng và chế biến thủy sản là rất cần thiết. 2. Mục tiêu của luận án Đề tài “Nghiên cứu phương pháp thu nhận collagen từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus)” được thực hiện với mục tiêu: (1) Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ tách chiết collagen và xác định các giải pháp kỹ thuật để nâng cao hiệu suất thu nhận collagen; iv (2) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng và động học quá trình trích ly collagen nhằm lựa chọn các thông số công nghệ thích hợp và thông qua mô hình hóa về động học trích ly để dự đoán được hàm lượng collagen theo thời gian trích ly, tăng khả năng chủ động điều khiển quá trình trích ly. (3) Xác định một số đặc tính hóa lý của collagen tách chiết từ da cá tra. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định thông số kỹ thuật của ba công đoạn chính trong quy trình công nghệ tách chiết collagen: tách tạp chất, trích ly và tinh sạch collagen. - Tối ưu hóa quá trình trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Mothodology) sử dụng phần mềm Design Expert 10: Thiết kế thí nghiệm theo phương án quay bậc hai tâm xoay Box – Hunter; đánh giá tính ý nghĩa của các hệ số hồi quy theo chuẩn Student; đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy theo chuẩn Fisher; Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng; Kiểm tra sự tương thích giữa thực nghiệm và mô hình dự đoán. - Nghiên cứu động học và cơ chế của quá trình trích ly collagen: với các thông số ảnh hưởng và vùng khảo sát đã xác định được qua nghiên cứu tối ưu hóa ở trên, tiến hành khảo sát sự thay đổi hàm lượng collagen trích ly theo thời gian và theo sự thay đổi hàm lượng của các thông số ảnh hưởng. Kết quả thực nghiệm thu được dùng để kiểm chứng, đánh giá sự tương thích của ba mô hình với thực nghiệm để chọn mô hình phù hợp mô tả đúng nhất động học quá trình trích ly collagen. - Nghiên cứu đặc tính hóa lý của collagen da cá tra như: thành phần amino acid, cấu tạo phân tử, nhiệt độ biến tính. Đồng thời kiểm tra một số chỉ tiêu kim loại nặng và vi sinh vật trong collagen thành phẩm. 4. Những đóng góp mới của luận án * Về mặt học thuật v (1) Đã xây dựng được mô hình toán học mô tả quy luật ảnh hưởng của nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin và tỷ số dung môi / da cá đến hiệu suất trích ly collagen; (2) Xác định được quá trình trích ly collagen từ da cá tra tuân theo quy luật động học bậc hai; (3) Xác định được bản chất của collagen tách chiết từ da cá tra và các đặc tính của nó. * Về mặt thực tiễn (1) Đưa ra giải pháp kỹ thuật hiệu quả để làm sạch da cá tra trước khi trích ly bằng cách sử dụng LASNa để loại lipid và H2O2 để khử màu da cá với các thông số kỹ thuật cụ thể. (2) Xây dựng được phương trình hồi quy mô tả quan hệ giữa hiệu suất trích ly collagen với các yếu tố ảnh hưởng: nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin và tỷ số dung môi/da cá, từ đó xác định được các giá trị tối ưu. (3) Xác định được điều kiện tốt nhất để loại muối ra khỏi collagen bằng phương pháp thẩm tích với hiệu suất tách muối cao nhất đạt 95,75%. (4) Xác định được điều kiện tốt nhất để loại lipid ra khỏi collagen thành phẩm bằng kỹ thuật trích ly lipid bằng dung môi CO2 siêu tới hạn. (5) Đánh giá các đặc tính chất lượng của collagen thành phẩm cho thấy sản phẩm phù hợp để dùng làm vật liệu sinh học hoặc sử dụng trong nuôi cấy tế bào. vi ABSTRACT Fish skin is the byproduct of fishery companies in the Mekong River Delta. Basa fish (Pangasius hypophthalmus) skin contains large amounts of collagen, highly valuable protein in the food, cosmetics and pharmaceutical industries. The aims of this thesis "Research on methods of extraction collagen from tra fish (Pangasius hypophthalmus) skin" were as follows: (1) Research on extraction process of collagen from tra fish (Pangasius hypophthalmus) skin; (2) Optimisation and kinetics studies on the extraction of collagen from tra fish skin; (3) Studies on the characterizations of collagen from tra fish skin The thesis presented an overview of the structure, origin and application of collagen; the collagen extraction methods and the theoretical basis of kinetic of solid – liquid extraction. Statistical optimization of process conditions using the central composite design (CCD) appeared to be an effective tool for the extraction process of soluble collagen from the fish skin (Pangasius hypophthalmus). Each of the three independent variables (acetic acid concentration, liquid to solid ratio, and pepsin content) showed a significant effect in the yield of extracted collagen. The mathematical model gave an R2 of 0,993 and a P value of less than 0,0001, which implied a good agreement between the predicted values and the actual values of the yield of PSC, thus confirmed a good generalization of the mathematical model. The optimal conditions to obtain maximum yield of PSC were identified as follows: 0,47 M of acetic acid concentration, 55 mL/g of liquid to solid ratio and 0,49 % of pepsin content. Under these optimized conditions, the experimental PSC extraction yield agreed closely with the predicted yield of 92,44 %. Kinetic models based on the second order rate equation were successfully developed to describe the extraction process with different processing variables. Extraction rate constant, initial extraction rate and equilibrium concentrations of collagen for different acetic acid concentrations, pepsin contents and liquid to solid ratios were predicted. The vii model verification showed that the experimental values agreed with the predicted ones, with percentage error differences in the range of 0,18 - 4,05 %. The extraction of collagen from basa fish (Pangasius hypophthalmus) skin mainly consists of three phases: Phase 1- Removing fat and pigments: basa fish skin was treated by LASNa 0,5 % to remove fat, during 6 hours and H2O2 1 % to remove pigments, during 2 hours. The compositions of basa fish skin after treatment by LASNa were as follows: hydroxyproline - 13,8 mg/g; moisture - 79,54 %; organic substance - 20,33 %; lipid – 0,98 % and ash – 0,13 %; color parameters obtained as follows: L = 73,065 ± 0,12; a = -3,64 ± 0,11 and b =18,32 ± 0,68. Phase 2 - Extraction of collagen from basa fish skin and fractional precipitation to obtain collagen: Collagen was extracted from basa fish skin with acetic acid - 0,47 M, pepsin - 0,49 % and L/S - 55 ml/g during 24 hours at a temperature of 4 °C, then NaCl was added to a final concentration of 0,9 M in order to precipitate collagen. Phase 3 - Refining collagen in two main stages (removing sodium chloride in solution collagen by dialysis and removing lipid by SCCO2). After purification, the compositions of collagen were: 0,159 % of NaCl; 0,1467 % of lipid (by dry weight). The collagen from basa fish skin is identified as type I collagen. The collagen consist of three chains as follows: the α chain with molecular weight of about 130 kDa, the β chain with molecular weight of about 250 kDa (as components of two α chain) and the γ chain chain with molecular weight of about 300 kDa (as components of 3 α chain). The denature temperature of collagen is 39 oC. The final product’s compositions were: hydroxyproline 97,76 mg/g (corresponding collagen content is 927,7 mg/g); organic compounds 92,8 %; moisture 7,0 %; lipid 0,03 % and ash 0,20 %; without detection of heavy metals (As, Pb). The product met the microbiological standards of Vietnam Pharmacopoeia IV-2009. viii LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới: GS.TS. Phan Đình Tuấn và PGS.TS. Nguyễn Hoàng Dũng, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án này. Xin cảm ơn dự án RBE (Research Based Education)- JICA, thầy PGS.TS. Nguyễn Hoàng Dũng, chủ nhiệm đề tài B1-07 “Fish collagen extraction and application” và cô PGS.TS. Phan Ngọc Hòa chủ nhiệm đề tài B2-06 “Purification collagen from Pangasius hypophthalmus fish skin and application”, GS. Shigeru Morimura - cố vấn đề tài, cùng toàn thể các thành viên thực hiện đề tài đã hỗ trợ và cho tôi nhiều ý kiến quý báu trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của GS.TS. Lê Văn Việt Mẫn, TS. Trần Bích Lam, GS.TS. Đống Thị Anh Đào, Cô Nguyễn Thị Nguyên, PGS.TS. Mai Thanh Phong, PGS.TS. Lê Kim Phụng, TS. Hoàng Minh Nam, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu thực nghiệm và dành cho tôi nhiều ý kiến trao đổi khoa học bổ ích cho luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, Phòng Sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Kỹ thuật Hóa Học và Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ giảng viên Khoa Kỹ thuật Hóa học & Môi trường, Ban Giám hiệu Trường Đại học Lạc Hồng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình vừa công tác vừa thực hiện luận án. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gởi lời chúc tốt đẹp nhất tới quý thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp, các em sinh viên và gia đình đã hỗ trợ, động viên và khuyến khích tôi trong suốt thời gian qua. ix MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH....................................................................................xv DANH MỤC BẢNG BIỂU ....................................................................................... xviii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...............................................................................xx MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN .....................................................................................3 1.1 Nguồn gốc, cấu tạo, tính chất và ứng dụng của collagen ..........................................3 1.1.1 Nguồn nguyên liệu tách chiết collagen ..................................................................3 1.1.1.1 Collagen tách chiết từ da bò ................................................................................3 1.1.1.2 Collagen tách chiết từ da lợn ...............................................................................3 1.1.1.3 Collagen tách chiết từ cá .....................................................................................4 1.1.2 Cấu tạo phân tử collagen ........................................................................................4 1.1.2.1 Thành phần amino acid của phân tử collagen .....................................................5 1.1.2.2 Cấu trúc của collagen ..........................................................................................7 1.1.3 Phân loại collagen .................................................................................................10 1.1.3.1 Collagen dạng sợi ..............................................................................................10 1.1.3.2 Collagen không ở dạng sợi ................................................................................10 1.1.4 Tính chất của collagen ..........................................................................................12 1.1.4.1 Tính hydrate hóa của collagen ...........................................................................13 1.1.4.2 Độ nhớt của dung dịch collagen ........................................................................14 1.1.5 Ứng dụng của collagen ........................................................................................15 1.1.5.1 Ứng dụng của collagen trong thực phẩm ..........................................................15 1.1.5.2 Ứng dụng của collagen trong lĩnh vực vật liệu sinh học ...................................16 x 1.1.5.3 Ứng dụng của collagen trong dược phẩm .........................................................17 1.2 Đặc điểm của cá tra .................................................................................................19 1.3 Các phương pháp tách chiết collagen từ da cá ........................................................19 1.3.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá trong nước và trên thế giới ...19 1.3.2 Trình tự tách chiết collagen từ da cá ....................................................................21 1.2.2.1 Quá trình tách tạp chất để sản xuất collagen .....................................................22 1.2.2.2 Quá trình trích ly collagen .................................................................................26 1.2.2.3 Quá trình tinh sạch collagen .............................................................................30 1.4 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly rắn –lỏng ............................................32 1.4.1 Mô hình hấp phụ Peleg ........................................................................................33 1.4.2 Mô hình khuếch tán Fick .....................................................................................33 1.4.3 Mô hình động học bậc hai ....................................................................................33 1.5 Những vấn đề tồn tại và định hướng nghiên cứu ....................................................34 1.5.1 Những vấn đề tồn tại ............................................................................................34 1.5.2 Định hướng nghiên cứu ........................................................................................34 CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............35 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất ........................................................................................35 2.1.1 Nguyên liệu...........................................................................................................35 2.1.2 Hoá chất ................................................................................................................35 2.2 Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra ................................................................37 2.3 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................39 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu ..................................................................................................39 2.3.2 Hoạch định thí nghiệm .........................................................................................41 2.3.2.1 Khảo sát quá trình tách tạp chất từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) ........41 2.3.2.2 Khảo sát quá trình trích ly collagen từ da cá tra ................................................42 xi 2.3.2.3 Nghiên cứu động học và cơ chế trích ly collagen .............................................45 2.3.2.4 Phương pháp tinh sạch collagen ........................................................................50 2.3.3 Phương pháp phân tích .........................................................................................53 2.3.3.1 Phương pháp hóa lý ...........................................................................................53 2.3.3.2 Phương pháp phân tích vi sinh ..........................................................................59 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................60 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ....................................................................61 3.1 Phân tích nguyên liệu da cá tra ................................................................................61 3.2 Khảo sát quá trình tách tạp chất từ da cá tra............................................................62 3.2.1 Tách tạp chất từ da cá tra bằng NaOH..................................................................62 3.2.2 Tách tạp chất từ da cá tra bằng LASNa ................................................................64 3.2.3 Tách tạp chất từ da cá tra bằng ethanol ................................................................65 3.2.4 Xử lý màu da cá tra bằng H2O2 ............................................................................68 3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất trích ly collagen ..................71 3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ acetic acid đến hiệu suất trích ly collagen ....................71 3.3.2 Ảnh hưởng của tỷ số dung môi : da cá (L/S) đến hiệu suất trích ly collagen ......73 3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme pepsin đến hiệu suất trích ly collagen .........74 3.4 Tối ưu hóa quá trình trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng phần mềm Design Expert 10. ........................................................................................75 3.4.1 Phân tích thống kê và dự đoán phương trình hồi quy ..........................................75 3.4.2 Tối ưu hóa giá trị các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly collagen bằng phương pháp bề mặt đáp ứng RSM-CCD ...................................................................................78 3.5 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen từ da cá tra bằng dung dịch acetic acid kết hợp với enzyme pepsin ..........................................................................81 3.5.1 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen theo mô hình Peleg...........81 xii 3.5.2 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen theo mô hình khuếch tán Fick .......................................................................................................................................84 3.5.3 Nghiên cứu động học của quá trình trích ly collagen theo mô hình động học phản ứng bậc hai .....................................................................................................................87 3.5.4 Xác định hàm lượng collagen và tốc độ trích ly theo mô hình động học bậc hai 91 3.5.5 Kiểm tra sự phù hợp của mô hình động học bậc hai với thực nghiệm .................93 3.6 Khảo sát quá trình tinh sạch collagen ......................................................................95 3.6.1 Khảo sát quá trình thẩm tích loại muối ra khỏi dung dịch collagen bằng màng cellulose - RCDMB (Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing) ..................95 3.6.1.1 Thẩm tích lần thứ nhất .......................................................................................95 3.6.1.2 Thẩm tích lần thứ hai .........................................................................................96 3.6.2 Tách lipid bằng CO2 siêu tới hạn (SCCO2) ..........................................................97 3.6.2.1 Ảnh hưởng của áp suất dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid ...............................97 3.6.2.2 Ảnh hưởng của lưu lượng dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid...........................98 3.6.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid .............................99 3.6.2.4 Ảnh hưởng của hàm lượng chất trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tách lipid .....................................................................................................................................100 3.6.2.5 Khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian ở các điều kiện tối ưu .....................102 3.7 Xác định đặc tính hóa lý của collagen thành phẩm ...............................................103 3.7.1 Xác định thành phần hóa học của collagen thành phẩm ....................................103 3.7.2 Kết quả điện di collagen thành phẩm trên gel polyacrylamide – SDS ...............103 3.7.3 Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá tra ......................................................104 3.7.4 Cấu trúc sợi collagen từ da cá tra ......................................................................105 3.7.5 Cấu trúc phân tử collagen từ da cá tra ...............................................................107 3.7.6 Thành phần các amino acid trong collagen từ da cá tra .....................................108 3.7.7 Thành phần các kim loại nặng trong collagen da cá tra .....................................110 3.7.8 Kiểm nghiệm vi sinh trong collagen da cá tra ....................................................110 xiii 3.8 Đặc tính của collagen da cá tra ..............................................................................111 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................................112 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................................114 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................115 xiv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc của sợi dây chằng ...............................................................................7 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử collagen loại I ......................................................................8 Hình 1.3 (A) Hình ảnh vi sợi collagen với chu kì D = 67 nm nhìn qua kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). (B) Biểu đồ thể hiện sự sắp xếp hai chiều của các phân tử collagen trong vi sợi. Chu kì D hình thành từ sự sắp xếp so le của các phân tử collagen trong vi sợi ...................................................................................................................................9 Hình 1.4 Cá tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878) ........................................19 Hình 1.5 Sơ đồ trình tự tách chiết collagen ...................................................................21 Hình 1.6 Giản đồ pha của CO2 ....................................................................................23 Hình 1.7 Cơ chế phá vỡ melanin .................................................................................25 Hình 1.8 Giai đoạn đầu và cuối của quá trình thẩm tích ..............................................32 Hình 2.1 Quy trình tách chiết collagen từ da cá tra .......................................................38 Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................39 Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................................40 Hình 2.3 Thiết bị trích ly collagen .................................................................................43 Hình 2.4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị CO2 siêu tới hạn THAR SFC SN.11419 mô phỏng trên máy tính .................................................................................................52 Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a), hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian. ....................63 Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ LASNa đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a), hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian. ....................64 Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến sự thay đổi hàm lượng lipid (a), hydroxyproline (b), tro (c) và hàm ẩm (d) trong da cá tra theo thời gian. ....................66 Hình 3.4 (a) Da cá trước khi xử lý màu bằng H2O2 và (b) da cá sau khi xử lý màu bằng H2O2 ...............................................................................................................................70 Hình 3.5 (a) Hiệu suất trích ly collagen ở các nồng độ acetic acid khác nhau đạt được sau 24h với tỷ số L/S là 60 ml/g và hàm lượng pepsin là 0,5 %; (b) Sự gia tăng hiệu suất trích ly collagen theo thời gian ở các nồng độ acetic acid khác nhau. ..........................72 xv Hình 3.6 Hiệu suất trích ly collagen sau 24 h ở các tỷ số L/S khác nhau; nồng độ acetic acid là 0,55 M và hàm lượng pepsin là 0,5 %. ..............................................................73 Hình 3.7 Hiệu suất trích ly collagen sau 24 h ở các hàm lượng pepsin khác nhau; nồng độ acetic acid là 0,55 M và tỷ số L/S là 60 ml/g. ..........................................................74 Hình 3.8a Ảnh hưởng của nồng độ acetic acid và hàm lượng pepsin đến hiệu suất trích ly collagen ......................................................................................................................79 Hình 3.8b Ảnh hưởng của nồng độ acetic acid và tỷ số L/S đến hiệu suất trích ly collagen .......................................................................................................................................79 Hình 3.8c Ảnh hưởng của hàm lượng pepsin và tỷ số L/S đến hiệu suất trích ly collagen .......................................................................................................................................80 Hình 3.9 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg với sự ảnh hưởng của nồng độ acetic acid ......................................................................................................................81 Hình 3.9 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg dưới tác động của tỷ số L/S ....82 Hình 3.9 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg dưới tác động của hàm lượng enzyme pepsin. ..............................................................................................................82 Hình 3.10 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của nồng độ acetic acid .................................................................................................................84 Hình 3.10 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của tỷ số L/S .................................................................................................................................85 Hình 3.10 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của hàm lượng enzyme pepsin. ....................................................................................................85 Hình 3.11 (a) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của nồng độ acetic acid .................................................................................................................87 Hình 3.11 (b) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của tỷ số L/S .............................................................................................................................88 xvi Hình 3.11 (c) Kết quả thực nghiệm (các ký hiệu) và mô hình (đường liền nét) của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của hàm lượng enzyme pepsin. ....................................................................................................88 Hình 3.12 Sự gia tăng hàm lượng NaCl trong môi trường thẩm tích theo thời gian ở các tỉ số collagen/dung dịch đệm khác nhau (Thẩm tích lần thứ nhất) ...............................95 Hình 3.13 Sự gia tăng hàm lượng NaCl trong môi trường thẩm tích theo thời gian ở các tỉ số collagen/dung dịch đệm khác nhau (Thẩm tích lần thứ hai) .................................96 Hình 3.14 (a) - Ảnh hưởng của áp suất dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen. Cột 0- collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid ở áp suất tương ứng 100, 200 và 300 bar, cột 4 - protein chuẩn ..............................................................................................................................98 Hình 3.15 (a)- Ảnh hưởng của lưu lượng dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen. Cột 0- collagen trước khi trích ly lipid, cột 13 collagen sau khi trích ly lipid ở lưu lượng dòng CO2 tương ứng 5, 10 và 15 g/phút, cột 4 - protein chuẩn ............................................................................................................99 Hình 3.16 (a)- Ảnh hưởng của nhiệt độ dòng CO2 đến hiệu suất tách lipid; (b)- Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen. Cột 0 - collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid ở nhiệt độ dòng CO2 tương ứng 34, 38 và 42 oC, cột 4 - protein chuẩn .............................................................................................................100 Hình 3.17 (a) -Ảnh hưởng của chất trợ dung môi- ethanol đến hiệu suất tách lipid; (b)Hình điện di SDS-PAGE của các mẫu collagen. Cột 0 - collagen trước khi trích ly lipid, cột 1-3 collagen sau khi trích ly lipid với hàm lượng ethanol tương ứng 5, 10 và 15 % , cột 4 - protein chuẩn ....................................................................................................101 Hình 3.18 (a) - Kết quả khảo sát tốc độ tách lipid theo thời gian; (b)- Hình điện di SDSPAGE của các mẫu collagen. Cột 1-4 collagen sau khi trích ly lipid với thời gian lưu tương ứng 10, 20, 30 và 40 phút, cột 5 - protein chuẩn ..............................................102 Hình 3.19 SDS-PAGE của collagen da cá tra cột 1, 2, 3, 4 và cột 0 - protein chuẩn.104 Hình 3.20 Đường cong biến tính nhiệt của dung dịch collagen 0,3 %........................105 Hình 3.21 Ảnh SEM chụp cấu trúc collagen tách chiết từ da cá tra ...........................106 Hình 3.22 Ảnh TEM chụp bó sợi collagen tách chiết từ da cá tra ..............................106 Hình 3.23 Phổ FTIR của collagen tách chiết từ da cá tra ............................................108 xvii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Thành phần amino acid của collagen tách chiết từ da một số loài cá ............6 Bảng 1.2 Cấu tạo của chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người .12 Bảng 1.3: Đặc tính collagen loại I dạng sợi của Công ty Collagen Solutions ..............17 Bảng 1.4 Tóm tắt quá trình trích ly collagen từ một số loại da cá bằng phương pháp acid .......................................................................................................................................27 Bảng 1.5 Tóm tắt quá trình trích ly collagen từ một số loại da cá bằng phương pháp enzyme ...........................................................................................................................28 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong quá trình thực hiện luận án .....................35 Bảng 2.2 Giá trị mã hóa và giá trị thực nghiệm của các yếu tố khảo sát ......................44 Bảng 3.1 Thành phần hóa lý của da cá tra ...................................................................61 Bảng 3.2 So sánh hiệu quả tách tạp chất và mức độ thất thoát hydroxyproline khi xử lý da cá tra bằng NaOH, LASNa và ethanol ở các điều kiện đã chọn ...............................68 Bảng 3.3 Độ sáng của da cá Tra sau xử lý H2O2 ở các nồng độ khác nhau .................69 Bảng 3.4 Thành phần hóa học của da cá tra sau khi xử lý H2O2 .................................71 Bảng 3.5 Kế hoạch thực nghiệm xác định hiệu suất trích ly collagen theo ..................76 Bảng 3.6 Kết quả phân tích ANOVA cho mô hình đáp ứng bậc hai ............................77 Bảng 3.7 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm ........................78 Bảng 3.8 So sánh kết quả thực nghiệm và mô hình ......................................................80 Bảng 3.9 Các thông số động học và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình Peleg .......................................................................83 Bảng 3.10 Các thông số mô hình và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích ly collagen từ da cá tra theo mô hình khuếch tán Fick dưới tác động của nồng độ acetic acid, tỷ số L/S và hàm lượng enzyme pepsin. ...............................................................86 Bảng 3.11 Các thông số mô hình và giá trị tương quan thống kê của quá trình trích ly collagen từ da cá tra (Pangasius hypophthalmus) theo mô hình động học bậc hai dưới tác động của nồng độ acetic acid, tỷ số L/S và hàm lượng enzyme pepsin. .................89 Bảng 3.12 Các hệ số cơ bản của ba mô hình nghiên cứu ..............................................91 xviii Bảng 3.13 Hàm lượng collagen xác định từ thực nghiệm và mô hình dự đoán theo thời gian trích ly ở các nồng độ acetic acid, hàm lượng enzyme pepsin, tỷ số L/S khác nhau. .......................................................................................................................................94 Bảng 3.14 Nồng độ NaCl trong dung dịch collagen sau hai lần thẩm tích ...................97 Bảng 3.15 Thành phần hóa lý của collagen thành phẩm ............................................103 Bảng 3.16 Thành phần amino acid của collagen tách chiết từ da cá tra .....................109 Bảng 3.17 Thành phần các kim loại nặng trong collagen da cá tra .............................110 Bảng 3.18 Chỉ tiêu vi sinh trong collagen da cá tra.....................................................110 Bảng 3.19 Mô tả sản phẩm collagen da cá tra .............................................................111 xix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ASC Acid - Solubilized Collagen CCD Central Composite Design DOC Deoxycholate DMSO Dimethyl Sulfoxide EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid FTIR Fourier Transformation Infra-red LASNa Sodium Lauryl Benzen Sulfonate L/S Liquid/ Solid MPD 2- Methyl – 2, 4 – Pentanediol PE Polyethylene PSC Pepsin - Solubilized Collagen RCDMB Regenerated Cellulose Dialysis Membrane Tubing RMSD Root Mean Square Deviation RSM Response Surface Methodology SCCO2 Supercritical Carbon Dioxide SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis ± SD Standard Deviation SEM Scanning Electron Microscope TEM Transmission Electron Microscopy xx