Tài liệu Nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát hiện chỉ thị ung thư gan afp và dkk1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO NGUYỄN TRUNG THÀNH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1 LUẬN VĂN THẠC SĨ Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH PTN CÔNG NGHỆ NANO NGUYỄN TRUNG THÀNH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP BIẾN ĐỔI BỀ MẶT THANH DAO ĐỘNG HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM CẢM BIẾN PHÁT HIỆN CHỈ THỊ UNG THƯ GAN AFP VÀ DKK1 Chuyên ngành: Vật liệu và Linh kiện Nanô (Chuyên ngành đào tạo thí điểm) LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 i Lời cảm ơn Công sinh thành, dưỡng dục, trao trọn yêu thương không bờ bến, một đời của cha mẹ để con có được những ngày hôm nay, con xin tạc dạ. Cảm ơn người! Ơn dạy dỗ tận tâm của thầy cô không thể nào đền đáp, em xin ghi lòng. Em xin cảm ơn! Xin gửi tới thầy giáo, cán bộ hướng dẫn em đề tài luận văn này, PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng lời cảm ơn chân thành nhất. Thầy đã tận tâm hướng dẫn, dành thời gian quý giá của mình để đọc và sửa nội dung khoa học của bài luận này. Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Đặng Mậu Chiến. Một người thầy, người quản lý tận tâm vì sự phát triển của sự nghiệp khoa học nước nhà. Xin gửi tới Thạc Sỹ Phan Nhật Thanh Khoa lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất. Anh là một người thầy, một người anh chưa bao giờ thiếu nhiệt tình và tâm huyết giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cảm ơn Thạc sỹ Phạm Văn Bình, anh đã giúp tôi hiểu sâu hơn một số vấn đề liên quan đến y sinh trong đề tài này. Cảm ơn em Phạm Văn Thọ, các nghiên cứu viên, nhân viên của Phòng thí Nghiệm Công nghệ Nano đã có những giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài ở LNT. Chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong Hội đồng bảo vệ luận văn này đã đọc, phản biện giúp em hiểu rõ hơn những vấn đề chưa rõ. Tôi cũng chân thành cảm ơn đề tài C2014-32-01 thực hiện tại PTN Công nghệ Nano, Đai học Quốc gia Tp. HCM đã cho tôi cơ hội tham gia thực hiện nghiên cứu này. Xin gửi lời chúc sức khoẻ, hạnh phúc tới quý thầy cô, anh chị và các bạn! Tp.Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2014 Học viên cao học Nguyễn Trung Thành Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Học viên thực hiện Luận văn Nguyễn Trung Thành Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành iii MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang Lời cảm ơn ............................................................................................................................ i Lời cam đoan ....................................................................................................................... ii Mục lục ............................................................................................................................... iii Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................................. vii Danh muc các bảng........................................................................................................... viii Danh mục hình ảnh ............................................................................................................. ix Mở đầu .............................................................................................................................. 01 1. Giới thiệu ...................................................................................................................... 01 2. Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài .................................................................................... 02 2.1. Mục tiêu ............................................................................................................. 02 2.2. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................. 02 3. Tóm tắt nội dung của đề tài ........................................................................................ 03 CHƢƠNG 1 ...................................................................................................................... 04 TỔNG QUAN 1.1. Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động ....................................................... 04 1.1.1. Cảm biến sinh học.......................................................................................... 04 1.1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học. ............................. 04 1.1.1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học ................. 05 1.1.1.3. Phân loại ........................................................................................... 06 1.1.2. Cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động ............................................... 08 1.1.2.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học dựa trên nguyên lý thanh dao động. .................................................................. 08 1.1.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của cảm biến sinh học trên cơ sở thanh dao động .......................................................................................... 10 1.2. Ung thƣ gan ............................................................................................................... 11 1.2.1. Thực trạng bệnh nhân ung thư gan trên thế giới ........................................... 14 1.2.2. Phòng tránh, chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư gan ................................... 16 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành iv 1.2.2.1. Phòng tránh bệnh ung thư gan .......................................................... 16 1.2.2.2. Các phương pháp chẩn đoán bệnh ung thư gan ................................ 17 1.2.2.3. Một số phương pháp điều trị bệnh ung thư gan ............................... 18 1.2.3. Hệ kháng thể-kháng nguyên .......................................................................... 20 1.2.4. Chất chỉ thị ung thư gan ............................................................................... 22 1.2.4.1. Chất chỉ thị AFP .............................................................................. 22 1.2.4.2. Chất chỉ thị DKK1 ........................................................................... 23 1.3. Các phƣơng pháp biến đổi bề mặt để ứng dụng cảm biến thanh dao động trong việc phát hiện ung thƣ gan .............................................................................................. 24 1.3.1 Biến đổi xuất phát từ bề mặt Au ...................................................................... 24 1.3.2. Biến đổi xuất phát từ bề mặt SiNx ................................................................. 25 1.3.2.1 Phương pháp biến đổi và vấn đề đối với SiNx ................................... 25 1.3.2.2 Vai trò của xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2 .................................. 26 1.3.2.2.1 Giới thiệu về plasma O2 ...................................................... 26 1.3.2.2.2 Một số kỹ thuật tạo plasma ................................................ 26 1.3.2.2.3 Vai trò của plasma đối với bề mặt SiNx ............................ 29 1.4 Các phƣơng pháp đánh giá hiệu quả của cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động............................................................................................................................ 29 1.4.1. Đánh giá các bước biến đổi bề mặt ................................................................ 29 1.4.1.1. Phương pháp chụp ảnh huỳnh quang .............................................. 29 1.4.1.2 Phương pháp đo góc tiếp xúc .......................................................... 30 1.4.1.3. Phương pháp phản ứng đổi màu nhờ enzyme HRP ........................ 33 1.4.2. Phương pháp đo độ lệch thanh dao động để phát hiện chất đánh dấu sinh học ................................................................................................................................... 33 CHƢƠNG 2 ...................................................................................................................... 36 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Quy trình biến đổi bề mặt thanh dao động ....................................................... 36 2.1.1. Quy trình xuất phát từ Au............................................................................ 36 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành v 2.1.1.1. Khảo sát trên wafer .......................................................................... 36 2.1.1.2. Thử nghiệm trên chíp thanh dao động để dò tìm AFP ..................... 37 2.1.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiNx/SiO2 ...................................................... 39 2.1.2.1. Khảo sát silane hóa bề mặt SiNx và SiO2 và vấn đề của SiNx ......... 39 2.1.2.2. Xử lý bề mặt SiNx bằng plasma O2.................................................. 43 2.1.2.3. Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy ............................................ 44 2.1.2.4. Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với GOPTS ........................................................................................................... 44 2.1.2.5. Áp dụng các quy trình tối ưu hóa để biến đổi bề mặt SiNx với APTES +GAD ............................................................................................... 44 2.1.2.6. Ứng dụng thanh dao động động để dò tìm DKK1 .......................... 45 2.2 Các phƣơng pháp, thiết bị khảo sát và hoá chất sử dụng trong đề tài ................. 47 2.2.1. F-LCA và kính hiển vi huỳnh quang ............................................................ 47 2.2.2. Máy đo góc tiếp xúc ..................................................................................... 48 2.2.3. Khảo sát bằng enzim HRP ............................................................................ 48 2.2.4. Đo độ lệch ..................................................................................................... 49 2.2.5. Các hoá chất sử dụng trong đề tài................................................................. 49 CHƢƠNG 3 ...................................................................................................................... 51 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát qui trình biến đổi xuất phát từ bề mặt Au ............................................ 51 3.1.1 Khảo sát thời gian ngâm GAD ...................................................................... 51 3.1.2 Khảo sát nồng độ GAD ................................................................................. 54 3.1.3 Đánh giá hiệu quả quy trình tối ưu thông qua góc tiếp xúc ......................... 55 3.1.4 Kết quả thử nghiệm thanh dao động để phát hiện AFP ................................. 56 3.2. Qui trình xuất phát từ bề mặt SiN/SiO2 ................................................................ 57 3.2.1 Kết quả biến đổi bề mặt SiNx chưa qua xử lý plasma O2 và bề mặt SiO2 ... 57 3.2.2. Cải tiến quy trình xuất phát từ bề mặt SiNx bằng phương pháp xử lý plasma oxy .......................................................................................................................... 58 3.2.3. Tối ưu hóa quy trình xử lý plasma oxy ....................................................... 59 3.2.3.1. Thời gian xử lý plasma ................................................................... 59 3.2.3.2. Ảnh hưởng của lưu lượng khí oxy.................................................. 61 3.2.3.3. Ảnh hưởng của công suất plasma ................................................... 64 3.2.3.4. Các thông số xử lý plasma tối ưu ................................................... 65 3.2.4. Áp dụng quy trình xử lý plasma vào quy trình APTES +GAD tối ưu ........ 66 3.2.5. Áp dụng quy trình xử lý plasma oxy +APTES+GAD tối ưu để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động để dò tìm DKK1 ...................................................... 68 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành vi CHƢƠNG 4 ...................................................................................................................... 70 KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG PHÁT TRIỂN ĐỀ TÀI 4.1. Kết luận .................................................................................................................... 70 4.2. Hướng phát triển của đề tài. ..................................................................................... 70 Tài liệu tham khảo ........................................................................................................... 71 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Stt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Chữ viết tắt AFP Anti-AFP Anti-DKK1 APTES BSA CAT CCP CT DKK1 DNA ELISA FITC F-LCA GAD GOPTS GP73 HCC HCV HRP ICP IgA IgD IgE IgG IgM LCA LNT MRI PBS RNA SPR UV-Vis Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Diễn giải Alpha-fetoprotein Anti-Alpha-fetoprotein Anti-Dickkopf-1 3-Aminopropyl triethoxysilane Bovine serum albumin Computerized Axial Tomography Capacitively coupled plasma Computerized Tomography Dickkopf-1 Deoxyribonucleic acid Enzyme-linked immunosorbent assay Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanate-Lens culinaris agglutinin Glutaraldehyde 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane Golgi Protein 73 Hepatocellular carcinoma Hepatitis C Horseradish peroxidase Inductively Coupled Plasma Immunoglobulin A Immunoglobulin D Immunoglobulin E Immunoglobulin G Immunoglobulin M Lens culinaris agglutinin Laboratory for Nanotechnology Magnetic Resonance Imaging Phosphate buffered saline Ribonucleic acid Surface plasmon reconance Ultraviolet–visible spectroscopy Nguyễn Trung Thành viii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học. ......................................... 6 Bảng 2.2.1. Danh mục các hóa chất .................................................................................. 49 Bảng 3.1.1: Khảo sát thời gian ngâm GAD. ..................................................................... 51 Bảng 3.1.2: Khảo sát nồng độ GAD. ................................................................................ 54 Bảng 3.1.3: Kết quả đo góc tiếp xúc nước. ....................................................................... 56 Bảng 3.2.1: Các thông số của quá trình xử lý plasma oxy ............................................... 58 Bảng 3.2.2: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy ...................................................... 60 Bảng 3.2.3: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy ...................................................... 61 Bảng 3.2.4: Các thông số quá trình xử lý plasma oxy. ..................................................... 64 Bảng 3.2.5: Các thông số tối ưu của quá trình xử lý plasma oxy ..................................... 65 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành ix DANH MỤC HÌNH ẢNH Tên hình ảnh Trang Hình 1: a) Thanh dao động khi chưa nhận kháng nguyên; b) thanh dao động khi đã nhận kháng nguyên ..................................................................................................................... 01 Hình 1.1.1: “enzyme electrode” đầu tiên .......................................................................... 04 Hình 1.1.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học. .................................................... 06 Hình 1.1.3: Một số thành phần sinh hoá được sử dụng trong thiết kế cảm biến sinh học và các chất phân tích riêng tương ứng. .............................................................................. 07 Hình 1.1.4: Sự thay đổi màu sắc của ánh sáng phản xạ trên bề mặt khi chiết suất và độ dày màng thay đổi.............................................................................................................. 08 Hình 1.1.5: Các nguyên tắc truyền dẫn của cantilever, a) sự thay đổi về độ cong bởi nhiệt độ thay đổi; b) sự thay đổi về độ cong bởi ứng suất bề mặt; c) sự thay đổi về tần số dao động cộng hưởng khi thay đổi khối lượng ........................................................................ 09 Hình 1.1.6: Hai cơ chế liên kết kháng thể - kháng nguyên gây ra hai dạng ứng suất bề mặt khác nhau. a) ứng suất kéo; b) ứng suất nén. ............................................................. 09 Hình 1.1.7: Sơ đồ một chip thanh dao động nhìn từ trên xuống ...................................... 10 Hình 1.1.8: Sơ đồ mặt cắt ngang một chip thanh dao động ............................................. 10 Hình 1.2.1: Hình ảnh lá gan bình thường và lá gan bị ung thư ........................................ 11 Hình 1.2.2: Giai đoạn 1 của ung thư gan .......................................................................... 12 Hình 1.2.3: Giai đoạn 2 của ung thư gan .......................................................................... 12 Hình 1.2.4: Giai đoạn 3 của ung thư gan .......................................................................... 13 Hình 1.2.5: Giai đoạn 4 của ung thư gan .......................................................................... 14 Hình 1.2.6: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mắc bệnh và chết vì các loại ung thư trên thế giới trung bình trong 100 người dân: a) nam; b) nữ.......................................................................... 14 Hình 1.2.7: a) Biểu đồ số người mắc bệnh và chết vì các loại ung thư ở một số vùng trên thế giới; b) Bản đồ mô tả phân bổ bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới. ......................... 15 Hình 1.2.8: Cấu trúc điển hình của một kháng thể ........................................................... 21 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành x Hình 1.2.9: Bề mặt của kháng thể IgG. ............................................................................ 21 Hình 1.2.10: Sự gắn kết kháng nguyên-kháng thể. .......................................................... 22 Hình 1.2.11: Sự phụ thuộc của khả năng sống sót theo thời gian sau khi phẩu thuật liên hệ với hàm lượng DKK1 của những bệnh nhân HCC ...................................................... 24 Hình 1.3.1: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au ............................................ 25 Hình 1.3.2 : Công thức cấu tạo của cysteamine ............................................................... 25 Hình 1.3.3: Cấu tạo buồng phản ứng của kỹ thuật CCP................................................... 27 Hình 1.3.4: Cấu tạo của buồng phản ứng của kỹ thuật ICP ............................................. 28 Hình 1.3.5: Quá trình thay thể nguyên tử Nitơ của nguyên tử Oxy ................................. 29 Hình 1.3.6: Vai trò của plasma oxy đối với bề mặt SiNx ................................................. 29 Hình 1.4.1: Một số chất huỳnh quang, a) fluorescein isothiocyanate (FITC); b) 5carboxyfluorescein succinimidyl ester; c) 6-fluorescein-5-carboxamido hexanoic acid succinimidyl ester .............................................................................................................. 30 Hình 1.4.2: Hình ảnh những giọt nước trên lá sen ........................................................... 31 Hình 1.4.3: Góc thấm ướt của nước trên thủy tinh (trái) và lá sen (phải) ........................ 31 Hình 1.4.4: Các trường hợp không thấm ướt, ít thấm ướt và thấm ướt tốt. ..................... 31 Hình 1.4.5: Sự phụ thuộc của góc tiếp xúc vào các dạng lực căng bề mặt. ..................... 32 Hình 1.4.6: Mô tả nguyên lý đo độ lệch của thanh dao động ........................................... 34 Hình 1.4.7: a) Hệ đo độ lệch thanh dao động của các chíp trên cùng một mảng; b) Một chíp với 9 thanh dao động .................................................................................... 35 Hình 2.1.1: Quy trình biến đổi bề mặt Au của mẫu wafer .............................................. 36 Hình 2.1.2: Cơ chế phản ứng giữa nhóm thiol (-SH) và Au. ........................................... 37 Hình 2.1.3: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine (-NH2) và nhóm aldehyde (-CHO). ...... 37 Hình 2.1.4: Quá trình khử của hợp chất NaCNBH3 ......................................................... 37 Hình 2.1.5: Quy trình xử lý bề mặt thanh dao động có phủ Au ....................................... 38 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành xi Hình 2.1.6: Vai trò của BSA............................................................................................. 39 Hình 2.1.7: Sơ đồ quy trình silane với GOPTS trên bề mặt SiNx và SiO2 ...................... 40 Hình 2.1.8: Liên kết silanol trên bề mặt SiNx/SiO2 .......................................................... 40 Hình 2.1.9: Cấu tạo phân tử GOPTS và APTES ............................................................. 41 Hình 2.1.10: Quá trình silane hoá trên bề mặt SiNx/SiO2 với các chất có nhóm silane. R là một nhóm chức (như là epoxy, amine,...) ..................................................................... 42 Hình 2.1.11: Cơ chế phản ứng giữa nhóm amine và nhóm epoxy .................................. 43 Hình 2.1.12: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx bằng plasma oxy. ...................................... 43 Hình 2.1.13: Thiết bị RIE 200ipB, SAMCO, tại Phòng thí Nghiệm Công nghệ Nano ... 44 Hình 2.1.14: Quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD áp dụng các quy trình tối ưu hoá ................................................................................................................................ 45 Hình 2.1.15: Sơ đồ quy trình biến đổi bề mặt SiNx với APTES+GAD nhằm thu nhận DKK1................................................................................................................................. 46 Hình 2.1.16: Vai trò của BSA trong trong quy trình APTES+GAD để biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động .................................................................................................. 47 Hình 2.2.1: Kính hiển vi huỳnh quang BX41 (Olympus) tại LNT................................... 47 Hình 2.2.2: Thiết bị đo góc tiếp xúc CAM 101 ................................................................ 48 Hình 2.2.3: Thiết bị Scala tại LNT ................................................................................... 49 Hình 3.1.1: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang và thời gian ngâm GAD ................. 52 Hình 3.1.2: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo thời gian ngâm GAD: a) 15 phút; b) 30 phút; c) 60 phút; d) 60 phút; e) 120 phút ........................................................................... 53 Hình 3.1.3: Sự phụ thuộc của tín hiệu huỳnh quang vào nồng độ GAD .......................... 54 Hình 3.1.4: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo nồng độ GAD: a) 1%; b) 1.5%; c) 2%; d) 2.5%; e) 3%. .................................................................................................................. 55 Hình 3.1.5: Đồ thị thể hiện sự thay đổi độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ khác nhau của AFP..................................................................................................................... 57 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành xii Hình 3.2.1: Ảnh huỳnh quang của a) wafer SiNx được biến đổi với GOPTS và không được xử lý plasma oxy và mẫu SiO2 ................................................................................. 58 Hình 3.2.2: Ảnh huỳnh quang của mẫu SiNx có xử lý plasma oxy .................................. 59 Hình 3.2.3: Đồ thị thể hiện sự thay đổi của độ sáng huỳnh quang theo thời gian xử lý plasma oxy. ........................................................................................................................ 60 Hình 3.2.4: Ảnh huỳnh quang của 4 mẫu wafer ứng với thời gian xử lý plasma khác nhau: a) 20 phút; b) 30 phút; c) 45 phút; d) 60 phút ......................................................... 61 Hình 3.2.5: Đồ thị sự phụ thuộc của độ sáng huỳnh quang vào lưu lượng khí oxy ......... 62 Hình 3.2.6: Ảnh huỳnh quang của các mẫu ứng với lưu lượng khí oxy khác nhau: a) 20 sccm; b) 40 sccm; c) 80 sccm; d) 120 sccm; e) 160 sccm................................................. 63 Hình 3.2.7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ sáng huỳnh quang vào công suất xử lý plasma ICP. ........................................................................................................................ 64 Hình 3.2.8: Ảnh huỳnh quang của các mẫu theo công suất plasma ICP: a) 200 W; b) 300 W; c) 400 W. ..................................................................................................................... 65 Hình 3.2.9: Ảnh huỳnh quang: a) mẫu không được xử lý plasma oxy; b) mẫu xử lý plasma oxy với các thông số tối ưu ................................................................................... 66 Hình 3.2.10: Hình ảnh huỳnh quang của F-LCA trên thanh dao động được biến tính bề mặt sử dụng các thông số tối ưu của quy trình APTES..................................................... 67 Hình 3.2.11: Độ hấp thụ của dung dịch được đo bằng máy quang phổ UV-VIS với bước sóng hấp thụ khoảng 540 nm ............................................................................................. 68 Hình 3.2.12: Đường chuẩn độ lệch của thanh dao động ứng với nồng độ DKK1 khác nhau ................................................................................................................................... 69 Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 1 Mở đầu 1. Giới thiệu Ung thư gan là 1 trong 9 bệnh ung thư hay gặp nhất trên toàn thế giới, chiếm 5,6% trong tổng số các bệnh ung thư và là bệnh có tiên lượng xấu. Thời gian sống trung bình từ khi phát hiện khoảng 6 tháng, chỉ có khoảng 4,7% có khả năng sống sót sau 5 năm [26]. Thật nguy hiểm hơn khi ngày càng ảnh hưởng mạnh từ mặt trái của sự phát triển như, ôi nhiễm môi trường, lạm dụng hóa chất trong bảo quản thực phẩm, uống rượu bia,… làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư. Để tăng khả năng điều trị bệnh ung thư thì yêu cầu cốt yếu là phát hiện bệnh sớm và chính xác. Nhiều thập niên qua, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ra nhiều phương pháp để chuẩn đoán sớm bệnh ung thư như, chụp cộng hưởng từ (MRI), chụp cắt lớp đồng vị phóng xạ phát positron, chụp cắt lớp, nội soi,…[27]. Các phương pháp trên chủ yếu là chỉ phát hiện được bệnh khi bệnh đã phát triển thành khối u. Một phương pháp có khả năng phát hiện được bệnh sớm hơn, đơn giản, chi phí thấp là phương pháp dùng chất chỉ thị thông qua cảm biến sinh học. Các thanh dao động với kích thước micromet được ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị ung thư được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Với độ dày của thanh dao động khoảng 1µm, dài khoảng 500-700µm, nhiều tính chất vật lý của thanh sẽ thay đổi rõ rệt khi một lượng nhỏ chất chỉ thị (chất cần phân tích) bám lên bề mặt thanh. Đo tín hiệu điện hoá, ứng suất bề mặt, độ lệch hoặc sự thay đổi của tần số dao động của thanh thì ta thu được nhiều thông tin chính xác phục vụ cho quá trình phân tích và chẩn đoán bệnh. Hình 1 mô tả sự thay đổi của thanh dao động trước và sau khi gắn kết chất chỉ thị. a) Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ b) Nguyễn Trung Thành 2 Hình 1: a) Thanh dao động khi chưa nhận kháng nguyên; b) thanh dao động nhận kháng nguyên.[1] Hiệu quả của phương pháp phụ thuộc rất lớn vào khả năng cố định các phần tử sinh học lên bề mặt của thanh dao động. Do đó, việc nghiên cứu phương pháp tăng khả năng gắn kết các thụ thể sinh học lên bề mặt thanh dao động là rất cần thiết. Các thanh dao động ứng dụng trong cảm biến sinh học thường làm từ vật liệu SiNx và được phủ lên một lớp vàng và crom mỏng. Bản thân Au và SiNx không phản ứng trực tiếp với các thụ thể nên để gắn kết các thụ thể này lên bề mặt thì chúng ta phải biến đổi bề mặt của thanh dao động. Đề tài này nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động nhằm tăng khả năng gắn kháng thể lên bề mặt thanh dao động hướng đến ứng dụng làm cảm biến phát hiện chỉ thị ung thư gan AFP và DKK1. 2. Mục tiêu và ý nghĩa của đề tài 2.1. Mục tiêu Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu phương pháp biến đổi bề mặt thanh dao động được phủ lớp Au, SiNx hướng ứng dụng làm cảm biến phát hiện chất chỉ thị AFP và DKK1. 2.2. Ý nghĩa của đề tài Sử dụng cảm biến thanh dao động để phát hiện các chất chỉ thị ung thư gan là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch không đánh dấu, đơn giản, chi phí thấp và đặc biệt là có thể phát hiện được bệnh ung thư gan ở giai đoạn đầu. Điều này sẽ giúp tăng khả năng điều trị hiệu quả bệnh ung thư gan. Ở nước ta, đây là một đề tài khá mới mẻ. Nghiên cứu này có thể mở ra những hướng nghiên cứu mới về xét nghiệm miễn dịch nhằm chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan. Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 3 3. Tóm tắt nội dung của đề tài Nội dung chính của đề tài bao gồm:  Khảo sát thí nghiệm biến đổi bề mặt Au của thanh dao động thông qua cysteamine, GAD. Xây dựng quy trình dò tìm AFP.  Khảo sát phương pháp biến đổi bề mặt SiNx của thanh dao động thông qua GOPTS, APTES, GAD. Xây dựng quy trình dò tìm DKK1. Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thanh dao động 1.1.1. Cảm biến sinh học 1.1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ cảm biến sinh học Sự phát triển của cảm biến sinh học đầu tiên gắn liền với cái tên L. C. Clark, người đầu tiên đề xuất đầu dò oxy (1956) cho việc xác định oxy trong máu và sau đó được coi là “enzyme electrode” gồm có đầu dò enzim và hai màng lọc máu kèm theo một phần nhỏ dung dịch glucose oxidase giữa chúng (hình 1.1.1). Hình 1.1.1: “enzyme electrode” đầu tiên. Enzim xúc tác sự oxi hoá chuyển đổi glucose thành axít gluconic. Vì vậy, lượng oxy bị phân giải gần bề mặt điện cực tương ứng với nồng độ glucose. Sau này, một thiết bị tương tự với glucose oxidase được giữ trong gel polyacrylamide đã được mô tả bởi Updike và Hicks (1967). Tuy nhiên, ứng dụng phân tích đầu tiên của cố định enzim đã được tạo ra vào năm 1962 (Guilbault et al. 1962). G. Guilbault đã đề xuất hệ thống cảnh báo cho việc phát hiện sớm chất độc thần kinh. Nó bao gồm 2 điện cực lưới Pt với một thanh xốp hấp thụ chứa các enzim cholinesterase cố định. Năm 1969, cảm biến enzyme potentiometric đầu tiên dựa trên điện cực NH3 chọn lọc và urease cho việc kiểm tra u-rê trong nước tiếu (Guilbault và Montalvo 1969). Năm 1970, Bergveld đã phát minh transistor hiệu ứng trường chọn lọc ion (ISFET). Năm 1972, cảm biến sinh học thương mại đầu tiên được sản xuất. Nó là thiết bị kiểm tra đường huyết, có dạng cây bút sử dụng một điện cực. Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 5 Năm 1975, Janata phát minh ra cảm biến miễn dịch đầu tiên dự trên một bộ phân thế (potentiometric transducer). Năm 1976, ra đời cảm biến miễn dịch amperometric đầu tiên (Aizawa et al. 1976). Cũng trong năm này, Karube phát mình ra cảm biến sinh học vi khuẩn (microbial biosensor) dựa trên tốc độ hô hấp như là một tín hiệu đặc trưng trong tổng lượng vật chất hữu cơ có thể oxi hoá trong nước. Năm 1980, Peterson phát minh ra cảm biến pH sợi quang đầu tiên trong khí huyết cơ thể. Năm 1982, lần đầu tiên ra đời cảm biến sinh học glucose dựa trên cơ sở sợi quang. Năm 1983, lần đầu ra đời cảm biên miễn dịch cộng hưởng gen nguyên sinh bề mặt (surface plasmon reconance-SPR). Năm 1984, ra đời cảm biến sinh học đo dòng gián tiếp đầu tiên. Ferrocene được sử dụng với glucose oxidase cho việc thu nhận glucose. Năm 1987, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết MediSense ExacTechTM (mô hình dải/bút và dùng một lần). Năm 1990, ra mắt Pharmacia BIACore SPR dựa trên hệ thống cảm biến sinh học. Năm 1992, i-STAT ra mắt thiết bị phân tích máu cầm tay. Năm 1996, Glucocard được ra mắt. Năm 1998, ra mắt cảm biến sinh học đường huyết LifeScan FastTake. Năm 2001, LifeScan đã mua hệ thống kinh doanh thiết bị kiểm tra glucose của Inverness Medical’s với giá 1,3 tỷ đô. Từ năm 1999-nay, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng một số kỹ thuật như BioNMES, Quantum dots, nanopartivles, Nanocantilever, Nanowire và Nanotube vào cảm biến sinh học [2], [3]. 1.1.1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của cảm biến sinh học Cấu tạo cơ bản của một cảm biến sinh học được mô ta ở hình 1.1.2 [5]: Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Nguyễn Trung Thành 6 Hình 1.1.2: Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học. Một cảm biến sinh học bao gồm 3 phần chính: (1) các thụ thể (kháng thể, bộ dò DNA, cell receptor…) có thể bắt giữ các phần tử sinh học (như là kháng nguyên, DNA đích, cell…); (2) bề mặt cảm biến, nơi gắn các thụ thể đồng thời cũng là nơi sinh ra các tín hiệu vật lý (độ lệch, điện trở, chiết suất…) hoặc hóa học thay đổi khi các thụ thể bắt giữ được các phần tử sinh học, (3) thiết bị điện tử có nhiệm vụ biến các tín hiệu vật lý, hóa học từ cảm biến và chuyển thành tin hiệu chuyển về hệ thống máy tính để xử lý và hiển thị kết quả. Nguyên tắc hoạt động cơ bản của cảm biến sinh học: bề mặt cảm biến được biến đổi và cố định các thụ thể lên đó, khi tiếp xúc với môi trường cần phân tích, các thụ thể này sẽ bắt giữ các chất cần phân tích dẫn đến làm thay đổi một số tính chất hóa, lý của bề mặt (độ lệch, điện trở, chiết suất…). Sau đó, thông qua bộ chuyển đổi, những thay đổi này được chuyển sang các tín hiệu quang, điện, cơ,...và nhờ bộ phận xử lý tín hiệu (vi xử lý, thiết bị điện tử) khuếch đại, đo lường các tín hiệu này và cho ta biết được thông tin về chất phân tích. 1.1.1.3. Phân loại cảm biến sinh học Việc phân loại cảm biến sinh học thông thường dựa vào nguồn gốc các bộ phận chính của chúng (bảng 1.1.1.) [2]. Bảng 1.1.1: Các thành phần chính của một cảm biến sinh học. Thành phần sinh hoá Enzim Kháng thể Axít nucleic Chất cảm thụ Mô Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ Bộ phận truyền dẫn Điện hoá Quang Vi cơ điện Mass sensitive Enthalpiemetric Thành phần phân tích Thuốc và chất chuyển hoá của chúng Chất chỉ thị sinh học Vitamin và các chất chống oxi hoá Các chất chuyển đổi Chất ô nhiễm môi trường Nguyễn Trung Thành