Tài liệu Nghiên cứu phát triển chủng tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này

.. -1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC KHOA HỌC Nguyễn Ngọc Mai “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này”. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -2- MỞ ĐẦU Chitin phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, là polysaccharide phổ biến thứ hai sau cellulose. Nó là một chuỗi polymer chứa các đơn phân là N-acetylglucosamine đƣợc liên kết bởi liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng phân tử cao, không hòa tan trong nƣớc và các dung môi hữu cơ khác. Chitin là thành phần cấu trúc chính trong vỏ và lớp biểu bì của động vật chân đốt, giáp xác, các loài côn trùng và trong thành tế bào của nấm. Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành các sản phẩm khác nhau nhƣ N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose. Chitinase có trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xƣơng sống, thực vật và động vật có xƣơng sống. Chitinase đƣợc ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp nhƣ là một tác nhân nhằm kiểm soát nấm gây bệnh thực vật, kiểm soát côn trùng. Trong y dƣợc, chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, ngƣời ta đã nghiên cứu tách chiết chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau nhƣ vi khuẩn, nấm, động vật, thực vật… nhƣng chỉ có chitinase do vi sinh vật tổng hợp, đặc biệt là từ nấm sợi mới có hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ và pH. Hiện nay, đối với việc phòng ngừa côn trùng có hại cho cây trồng thì biện pháp biến nhất vẫn là sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học với liều lƣợng ngày càng cao, tần suất nhiều đang ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng sinh thái. Với ƣu điểm vƣợt trội về sự thân thiện với con ngƣời và môi trƣờng thì thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học đang là sự lựa chọn có tiềm năng lớn trong xu hƣớng phát triển nền nông nghiệp bền vững. Lecanicillium lecanii là một trong số những chủng nấm entomopathogenic, mà trƣớc đó đã đƣợc biết đến rộng rãi nhƣ Verticillium lecanii, nhƣng hiện nay đƣợc hiểu là một dạng anamorphic trong nhóm Trùng thảo. Hầu Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -3hết, entomopathogens đều kí sinh trên cơ thể côn trùng. Tuy nhiên, một số entomopathogens có thể tồn tại trên cây trồng. Vì vậy, L. lecanii spp. có thể có hai vật chủ là côn trùng và thực vật. Trong tự nhiên, nấm Lecanicillium spp. kí sinh và gây bệnh đối với côn trùng phá hoại cây, đặc biệt là rệp. Lecanicillium có độc lực rất mạnh đối với một số loài rệp nhƣ: rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphis gossypii). Do vậy, bào tử nấm Lecanicillium spp. rất đƣợc quan tâm trong vấn đề kiểm soát côn trùng và sâu hại cây. Từ những vấn đề thực tiễn đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này”. Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính chitinase. Đồng thời, tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase. Nội dung đề tài: - Gây đột biến chủng nấm lecanicillium lecanii bằng cách sử dụng hóa chất gây đột biến NTG (N–methyl–N'–nitron–nitrosoguanidine) và tia UV (tia cực tím). - Sàng lọc các chủng nấm kí sinh côn trùng có hoạt tính chitinase cao nhất. - Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng đột biến sàng lọc. - Xác định tính chất chitinase. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -4- Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1. Giới thiệu về chitinase Chitinase [poly-β-1,4-(2-acetalmido-2-deoxy)-D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm glycosyl hydrolase, là enzyme thùy phân chitin thành các đơn phân là chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Kí hiệu của chitinase là EC3.2.1.14 Trong đó: 3 → Hydrolase 2 → Glycosylase 1 → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase còn có các tên gọi khác tùy theo xuất xứ của enzyme là chitodextrinase, β-poly-N-acetylglucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus)…[98]. Chitinase có thể đƣợc tìm thấy ở những loài có thành phần cấu trúc chứa chitin nhƣ nấm, côn trùng, giáp xác, đến những loài không có chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật [59]. Ở những sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình thái và phân chia tế bào. Tùy thuộc vào các loài sinh vật khác nhau mà tổng hợp chitinase với mục đích khác nhau. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo ra nguồn carbon. Ở thực vật và động vật, chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm [91]. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -5Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó. Chitin [111] Chitin [(C8H13O5N)n] là một trong những dạng polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, đƣợc tạo thành bởi các đơn phân là N-acetylglucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside. Về mặt cấu trúc , chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cellulose, điểm khác biệt duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin đƣợc thay bằng nhóm hdroxyl (-OH) ở cellulose [71]. Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitinase Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng và có chứa nitrogen. Nó không hòa tan trong nƣớc, kiềm loãng hay đặc, rƣợu và hầu hết các dung môi hữu cơ thông thƣờng. Nó tan axit vô cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) và một số dung môi khác (hexafluro isopropanol, hexafluro acetone…) [69], [94]. Một số động vật không xƣơng sống nhƣ côn trùng, huyễn thể, giáp xác và giun tròn, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của lớp vỏ. Ở động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lƣợng chitin chiếm khá cao từ 14 – 35% so với trọng lƣợng khô [10]. Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [85]. Các dẫn xuất của chitinase Chitinase có thể thủy phân một số dẫn xuất của chitin nhƣ glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4-methylumbellferyl-tri N-acetyl chititrioside (MUC – phát huỳnh quang) [33], [60] và không thủy phân một số cơ chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -6- 1.1.2. Phân loại chitinase  Dựa vào phản ứng phân cắt Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) [60]. Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide. Các enzyme này đã đƣợc nghiên cứu từ dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 ± 0,2 và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 78). Chitin-1,4-β-chitobiosidase: enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose. N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase): enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các nhóm monomer N-acetyl-D-glucosamin. Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase [117]  Dựa vào cấu trúc phân tử Chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20 [60]. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -7- Họ Glycohydrolase 18: Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, đƣợc tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-anomer [43]. Chúng thủy phân các liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcNAc – GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình anomeric. Hoạt tính của các chitinase thuộc họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [53]. Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm những chitinase từ thực vật (Arabidosis, dƣa leo, cây họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus, Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…), virus và động vật [53]. Họ Glycohydrolase 19: Họ này gồm hơn 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu ở thực vật nhƣ cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)… ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và ngƣời. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -8- Hình 1.3: Cấu trúc không gian của họ Glycohydrolase 18 (A) và họ Glycohydrolase 19 (B) [118]  Dựa vào trình tự amino acid Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm [88]: Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhƣng không cần cho hoạt động xúc tác. Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tƣơng tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn. Chúng đƣợc cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 – 47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -9Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao. 1.1.3. Nguồn thu nhận chitinase Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật bao gồm vi sinh vật, thực vật và động vật [37], [60], [94].  Chitinase vi khuẩn Chitinase đƣợc tìm thấy ở Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin trong môi trƣờng nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sự sinh trƣởng và phát triển. Chitinase ở vi khuẩn có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy nhiên trong các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. ngƣời ta đều cho thêm chitin nhƣ nguồn cơ chất kích thích làm tăng khả năng tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính chitinase sau quá trình tách chiết.  Chitinase nấm Các loài nấm sợi cũng có khả năng tạo ra chitinase. Các chủng nấm mốc cho chitinase cao nhƣ Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia ... và đặc biệt ở các nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus ... Tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn, chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dƣỡng, nhƣng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm. Chitinase còn giữ vai trò trong hoạt động kí sinh nấm nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh ở thực vật Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -10 Chitinase thực vật Những thực vật bậc cao có khả năng sinh chitinase nhƣ thuốc lá, cao su, lúa mạch, cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) ... Ngoài ra, một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp chitinase [41]. Chitinase do thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các loại côn trùng và nấm kí sinh gây bệnh cho cây trồng [44]. Ngƣời ta đã quan sát thấy chitinase đƣợc tách chiết từ cây cần tây có khả năng ức chế sợi nấm phát triển. Tuy nhiên cũng có tác giả cho rằng chitinase còn có vai trò khác nhƣ tham gia vào quá trình hình thành phôi [35].  Chitinase động vật Ở một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xƣơng nhƣ ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt ... có thể thu nhận đƣợc chitinase (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa). Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ. Ngoài ra, chitinase còn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticun) của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác [33]. 1.2. NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE 1.2.1. Sơ lƣợc nghiên cứu về chitinase  Nghiên cứu trên thế giới So với các enzyme nhƣ protease, amylase… thì chitinase đƣợc nghiên cứu chậm hơn. Chitinase lần đầu đầu tiên đƣợc mô tả bởi Bernad (1911) về ảnh hƣởng Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -11của nhiệt độ đến chitinase và khả năng kháng nấm ở cây hoa phong lan [7]. Đối với vi sinh vật, đối tƣợng đƣợc nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces nhằm thu nhận chitinase ứng dụng trong việc phá vỡ vách tế bào nấm [23], [42]. Năm 1987, Mark O'Brien và Rita R. Colwell đã tiến hành xác định hoạt tính chitinase của 101 chủng vi khuẩn đƣợc phân lập từ các nguồn môi trƣờng khác nhau bằng cách kiểm tra tại chỗ trên giấy lọc với 4-methylumbellifety-N-acetyl-Dglucosamine [84]. Henrissat (1991) dựa trên sự tƣơng đồng về trình tự amino acid ở vùng xúc tác đã phân loại nhóm protein glycosyl hydrolases thành hơn 50 họ trong đó chitinase đƣợc chia thành hai họ 18 và 19 [52]. Năm 1993, Henrissat và Bairoch phân loại thêm những enzyme từ các loài Flavobacterium, endo-Nacetylglucosaminidase. Hai họ này chứa cả endochitinase và exochitinase [53]. Những năm gần đây, một số nghiên cứu trên chitinase từ nấm ký sinh côn trùng. Năm 1998, Kang và cộng sự (cs) đã tinh sạch và xác định các đặc tính của chitinase trên nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae [62]. Năm 2002, Tikhonov và cs tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính chitinase từ 2 chủng nấm Verticillium chlamydosporium và V. Suchlasporium [100]. Năm 2003, LI và cs nghiên cứu việc tăng hoạt tính của β-1,3-glucanse và chitinase trong mô sẹo trên cây bông bằng salicylic acid và sự tác động của độc tính nấm Verticillium dahliae [74]. Năm 2005, Duo-Chuan và cs đã tinh sạch và xác định tính chất của chitinase từ Talaromyces flavus. Laura và cs (2006) tiến hành nghiên cứu sản xuất oligosaccharides bằng enzyme thủy phân chitin là chitinase từ nấm Lecanicillium fungicola [36]. Năm 2009, PENG và cs đã nghiên cứu vai trò của protease và chitinase trong quá trình lây nhiễm côn trùng của nấm Verticillium lecanii [89]. Môi trƣờng thích hợp để sản xuất chitinase từ vi khuẩn hay nấm cũng đƣợc nghiên cứu rất nhiều trên các loại môi trƣờng lỏng, môi trƣờng xốp… [30], [40], [47], [51], [65], [92]. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -12 Nghiên cứu trong nước Nhìn chung những nghiên cứu về chitinase ở trong nƣớc vẫn còn rất hạn chế cho dù tiềm năng ứng dụng của enzyme này rất là cao. Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thƣơng, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma sp. [14]. Năm 2004, tác giả Đinh Minh Hiệp đã nghiên cứu quy trình tách chiết chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dƣợc [6]. Trên đối tƣợng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu quá trình thu nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu enzyme chitinase có hoạt tính khá cao [11]. Năm 2010, tác giả Nguyễn Đinh Nga và cs khảo sát khả năng tác động lên nấm Candida albicans của chitinase thu nhận từ lá cây khoai lang và từ nấm Trichoderma [8]. Năm 2012, Nguyễn Thị Hà đã tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp chitinase đƣợc phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ [4]. 1.2.2. Ứng dụng của chitinase  Trong nông nghiệp Chitinase đƣợc sử dụng trong kiểm soát nấm gây bệnh ở thực vật. Nhiều loài côn trùng, nấm mốc có thể gây ra nhiều loại dịch bệnh gây hại cho cây trồng và vật nuôi, ảnh hƣởng trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp. Theo Hirohi Ihui, chitinase luôn có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chứa chitin. Khi thực vật bị nhiễm nấm gây bệnh chứa chitin, các tế bào sẽ bị kích thích sinh ra chitinase và β-1,3-glucanase xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của bệnh [54]. Sự kích thích hoạt tính chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải amoniac, phenylalamin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực vật. Vì Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -13chitin không phải là thành phần phổ biến ở thực vật và động vật có xƣơng nên ngƣời ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin trong các nấm và côn trùng nhƣ 1-(1,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin, polyxin D… Khi áp dụng trên thực vật và động vật, những tác nhân trên có nhiều ƣu thế trong việc diệt nấm mốc, côn trùng có hại mà không gây hại đáng kế cho thực vật hoặc động vật có xƣơng sống. Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp. NRG4 có hoạt tính cao đối với Fusarium moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxii và Rhizopus nigricans [34]. Bhushan và Hoodal (1998) nghiên cứu về tính tƣơng thích của những chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp. BG-11 với thuốc diệt côn trùng và thuốc diệt nấm thƣờng đƣợc sử dụng [24]. Chitinase từ Bacillus cereus YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật nhƣ Fusarium oxyporum, F. Solani, Penicillium ultimum [32]. Ngoài ra, chitinase còn có vai trò trong kiểm soát côn trùng. Cơ thể của côn trùng có chứa chitin ở lớp vỏ ngoài và ống tiêu hóa. Phần lớn các nấm gây bệnh côn trùng nhƣ Metarhizium anisopliae, Nomurae rileyi, Aschersonia aleyrodis, Verticillium lecanii và một số nấm thuộc bộ Entomophtorales xâm nhập vào cơ thể sâu bọ, côn trùng dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với côn trùng .Sau đó nấm sẽ phát triển xuyên qua các lớp biểu bì, phá hủy các mô cơ thể, gây chết côn trùng [15, 84]. Các nhà khoa học đã chứng minh mối liên hệ giữa khả năng tiêu diệt sâu bệnh của vi nấm đối kháng và sự tổng hợp chitinase của các loài vi nấm này.  Trong y – dược học Chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine là chất có tiềm năng rộng lớn trong y dƣợc. Chitooligosaccharides có lợi ích tiềm năng đối với sản xuất thuốc cho ngƣời. Trong y học, ngƣời ta sử dụng các oligomer chitohexaose và chitoheptaose làm tác nhân kháng các khối u ung thƣ [68]. Chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus đã đƣợc sử dụng để sản xuất chitopentaose và chitotriose từ cơ Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -14chất chitin huyền phù [82]. Sashiwa và cộng sự (2002) đã sản xuất N-acetyl glucosamine từ α-chitin bằng cách sử dụng dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 [93]. Giữa các enzyme thủy phân chitin có thể kết hợp với nhau để thu nhận những oligomer có chiều dài chuỗi mong muốn. Ví dụ, để tạo chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl glucosamindase và exochitinase; trong khi để tạo N-acetyl glucosamine thì cần tỉ lệ cao exochitinase và N-acetyl glucosamindase. Aloise và cộng sự (1996) nhận thấy khi ủ enzyme chitinase với tetramer hoặc pentamer thu nhận từ Nocardia oritentalis thì thấy có sự hình thành các hexamer [101]. Nhiều phƣơng pháp chẩn đoán bệnh nấm nhƣ ELISA, sự ngƣng kết kháng thể, mẫu dò phân tử… tuy nhiên giá thành cao. Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng chitinase trong việc chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra. Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm. Hay ở nấm men thì chitin hiện diện trong những vết chồi. Do đó có thể dùng phƣơng pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phƣơng pháp chẩn đoán nhanh các loài nấm gây bệnh. Các nhà khoa học đã đề xuất một phƣơng pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase đã đƣợc phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và có thể sử dụng nhƣ một mẫu dò trong việc chẩn đoán với độ nhạy cao đểnhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mô bệnh [57], [71]. Ngoài ra, chitinase có tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bôi ngoài da chứa chất chống nấm bệnh thƣờng xảy ra các nƣớc vùng nhiệt đới bởi khả năng phân hủy vách tế bào vi nấm của chúng. Các nhà khoa học đề nghị sử dụng chitinase với các tác nhân kháng nấm có thể chấp nhận khác (nhƣ Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -15- amphotericin B, 5-fluorocytosin, các dẫn xuất azol, allylamines-thiocarbamastes, griseofulvin, bezoic…) nhằm bổ trợ cho hoạt động nội sinh của chitinase. Chitinase có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lƣợng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân. Ngoài ra, việc kết hợp giữa chitinase và laminarinase đƣợc ghi nhân là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm so với chỉ dùng chitinase [3], [41]. 1.3. NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG LECANICILLIUM LECANII Lecanicillium lecanii thuộc chủng nấm entomopathogenic. Lecanicillium spp. có khả năng kí sinh trên hai vật chủ là côn trùng và thực vật [21]. Trong tự nhiên, nấm này kí sinh và gây bệnh đối với côn trùng phá hoại cây trồng. L. lecanii có phổ vật chủ rộng gồm côn trùng có cánh, động vật chân đốt, sâu, bƣớm. Nấm Lecanicillium spp. có thể sợi màu trắng và bông. Sợi nấm trong suốt , có tốc độ tăng trƣởng 29 – 33mm sau 10 ngày, cả ở không khí lẫn trong môi trƣờng nuôi cấy. Bào tử đính có hình Hình 1.4: Sợi nấm và bào tử Lecanicillium lecanii [113] elip đƣợc bố trí theo hình trụ ở đỉnh, trong suốt, 4 – 5,6 x 1,6 – 2,4µm [29]. Nấm gây bệnh trên côn trùng dựa trên sự xâm nhập của các bào tử. Bào tử gặp độ ẩm và nguồn dinh dƣỡng thích hợp sẽ nảy mầm và xâm nhập vào cơ thể côn trùng thông qua lớp biểu bì bên ngoài, giữa các bộ phận trong cơ thể. Trong quá trình nảy mầm, bào tử tổng hợp protease, chitinase và lipase giúp các ống mầm xâm nhập vào lớp biểu bì đồng thời các enzyme hủy hoại hệ thống mô, cơ quan của côn trùng. Sợi nấm xâm nhập vào khoang máu, lƣu thông qua các chất lỏng của côn trùng và hình thành khối mô dạng sợi nấm trên cơ thể côn trùng. Do đó, Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -16Lecanicillium spp. đƣợc sử dụng trong việc tạo ra thuốc trừ sâu sinh học với một số loài côn trùng có hại trên cây trồng. Bào tử nấm Lecanicillium spp. rất đƣợc quan tâm trong vấn đề kiểm soát côn trùng và sâu bệnh hại cây trồng. Đặc biệt, L. lecanii có độc lực rất mạnh đối với một số loài rệp nhƣ rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphis gossypii) [50]. Năm 2001, Kim và cs đã cho ra một sản phẩm thƣơng mại mang tên Vertalec™ đƣợc tạo ra từ bào tử nấm L. lecanii [67]. Vũ Văn Hạnh và các cs đã phân lập Lecanicillium spp. từ rệp đào, có khả năng diệt rệp bông 100% sau 4 – 5 ngày trong điều kiện phòng thí nghiệm và trên 78% trong điều kiện nhà kính sau 14 ngày. Các bào tử của nấm này cũng có khả năng diệt rệp đào hại rau cải, dau diếp, ớt 100% sau 5 ngày phun trong điều kiện phòng thí nghiệm [50]. Bên cạnh đó, nấm này cũng đã đƣợc chứng minh có hoạt tính chống nấm mốc gây bệnh nấm mốc trên nhiều loại cây trồng [22], [104]. Nấm Lecanicillium spp. cũng kí sinh trên nhiều loại côn trùng bao gồm bộ cánh đều, bộ cánh cứng, cánh thẳng và bƣớm. Năm 2006, North và cs đã thử nghiệm và cho ra kết quả Lecanicillium muscarium diệt đƣợc khoảng 70% bọ dừa Thripspalmi sau 4 ngày [83]. Lecanicillium spp. đƣợc sử dụng để tạo chế phẩm diệt bƣớm trắng Mycotal™ [44], [56], [78]. Ngoài ra, loại nấm này cũng có thể kiểm soát giun tròn nang gây hại đậu tƣơng, nấm mốc gây hại dƣa chuột và các loại nấm gỉ gây hại cây hoa cúc [75], [103]. Mặc dù tiềm năng kiểm soát công trùng gây hại cây trồng của nấm Lecanicillium spp. rất lớn nhƣng việc nghiên cứu ứng dụng của nấm này để bảo vệ cây trồng cũng nhƣ kết quả đạt đƣợc còn rất hạn chế, nhất là ở Việt Nam. Hiệu quả diệt côn trùng của chế phẩm từ Lecanicillium spp. cũng nhƣ các chế phẩm sinh học khác còn kém, khối lƣợng chế phẩm diệt côn trùng sinh học đƣợc sử dụng chiếm tỷ trọng thấp trong tổng khối lƣợng các loại thuốc diệt côn trùng. Do vậy, việc tăng Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -17cƣờng nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium spp. là cần thiết. 1.4. ĐỘT BIẾN VÀ CẢI BIỂN CHỦNG 1.4.1. Giới thiệu về đột biến Đột biến là những thay đổi vật lý trong các gen và nhiễm sắc thể. Chúng có thể chỉ xảy ra đối với một tế bào đơn lẻ hoặc có thể đƣợc truyền từ một tế bào khác trong một sinh vật đa bào (tế bào soma đột biến), hoặc có thể đƣợc truyền từ một thế hệ khác đột biến thông qua giáo tử (mầm dòng đột biến). Đột biến có thể đƣợc gây ra bởi các yếu tố tự nhiên từ môi trƣờng, từ sự hoạt động hay không hoạt động của enzyme sửa chữa, và từ những hóa chất (chất gây đột biến) hoặc các bức xạ năng lƣợng cao. Tỷ lệ đột biến khác nhau giữa các loài sinh vật, giữa các gen, thời gian và địa điểm. Nó có thể gây ra tác động đáng kể không chỉ đối với cá nhân mà còn về sự tiến hóa của các loài. Những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền cho các đời sau, góp phần thúc đẩy đa dạng sinh học. Đối với các enzyme sử dụng trong công nghiệp phải đƣợc sản xuất với chi phí thấp và có thể tái sử dụng và tái sản xuất. Để đạt đƣợc điều này, việc cải thiện thƣờng đƣợc thực hiện bằng kỹ thuật đột biến. Ngƣời ta có thể tạo đột biến bằng các chất gây đột biến hóa học nhƣ N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), EMS… hoặc bằng cách chiếu xạ vật lý nhƣ tia X, tia γ, tia UV [105]. Sự đột biến các dòng nấm để tạo ra các enzyme công nghiệp khác nhau (lipase, chitinase, cellulose, glucoamylase…) đã đƣợc sử dụng rộng rãi. 1.4.2. Sự cải biến chủng trên thế giới Năm 1994, Kuhad và cộng sự đã xử lý chủng nấm Fusarium oxysporum bằng tia cực tím, chủng đột biến xử lý với NTG đã làm tăng khả năng tổng hợp Cellulase lên nhiều lần so với chủng tự nhiên [70]. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -18Năm 1998, Kim và cs sử dụng xung điện và hóa chất NTG để cải biến hai chủng nấm men Saccharomyces diastaticus (ATCC 28339) và Sacharomyces spp. trong sản suất cồn sinh học. Dòng đột biến chọn lọc NF30-9 lên men đƣợc ethanol nồng độ cao hơn [64]. Năm 2005, Chand và cs đã tiến hành thí nghiệm gây đột biến trên nấm sợi bằng NTG kết hợp với ethidium bromide và UV hoặc NTG kết hợp với ethidium bromide. Kết quả sàng lọc đƣợc chủng đột biến chọn lọc có khả năng tổng hợp cellulose cao hơn nhiều lần so với chủng tự nhiên [31]. Năm 2011, Vũ Văn Hạnh và các cs đã xử lý chủng nấm sợi Aspergillus sp. bằng cách kết hợp tia Rontghen và hóa chất NTG để gây đột biến.Chủng nấm đột biến chọn lọc có khả năng tổng hợp men phân hủy tinh bột sống cellulase tăng lên rất rõ rệt so với chủng tự nhiên [46], [48]. 1.4.3. Sự cải biến chủng ở Việt Nam Năm 2009, Hồ Tuyên và cs đã sử dụng ba phƣơng pháp gây đột biến gồm chiếu tia cực tím (UV) vào bào tử, xử lý hóa chất gây đột biến NTG đối với tế bào trần và các phân đoạn khuẩn ty nhằm nâng cao hoạt tính kháng sinh của Acremonium chrysogenum. Biến chủng tốt nhất thu đƣợc có hoạt tính kháng sinh tăng khoảng 75% so với chủng gốc [17]. Năm 2010, tác giả Nguyễn Quỳnh Uyển và cs đã sử dụng hoá chất gây đột biến NTG để nâng cao hoạt độ phân giải protein của protease ngoại bào của vi khuẩn Bacillus sp. Sau khi gây đột biến bằng NTG và sàng lọc, hai chủng vi khuẩn đột biến có hoạt độ phân giải protein cao hơn 1,5 lần và 2 lần so với hoạt độ của chủng gốc đã thu đƣợc [18]. Năm 2012, Vũ Văn Hạnh và các cs tiến hành thí nghiệm nâng cao độc lực diệt rệp đào của chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium bằng đột biến tia UV và Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -19NTG nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Sàng lọc 42 dòng nấm đột biến, trong đó 2 thể đột biến UV (UV10.4 và UV60.3) và 3 thể đột biến NTG (NTG30.2, NTG50.2 và NTG60.2) diệt 100% rệp muội sau 4 đến 5 ngày phun. Độc lực của các thể đột biến tăng từ 10 đến 20% so với kiểu dại [5]. 1.5. RỆP VÀ THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC 1.5.1. Tổng quan về rệp hại cây trồng Rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới. Chúng phân bố tập trung ở các vùng ôn đới. Ngoài ra, chủng cũng phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt với độ đa dạng thấp hơn. Có khoảng 4400 loài thuộc 10 họ đã đƣợc biết đến, trong đó phổ biến nhất là họ Aphidae. Khoảng 250 loài là loài gây hại nghiêm trọng trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp nhƣ rệp đào (Myzus persicae), rệp bông (Aphis gossypii), rệp hại ớt (Piper nigrum), rệp ngô (Aphis maydis)…[110]. Đồng thời, nó cũng là vật chủ trung gian góp phần làm lây lan virus từ những cây nhiễm bệnh sang cây lành, làm giảm năng suất cây trồng, gây thiệt hại lớn cho nông nghiệp. Rệp là loài côn trùng thân mềm [25]. Cơ thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng) và đƣợc bao bọc bởi một bộ khung kitin. Nó có kích thƣớc từ 1 – 10 mm, cơ thể hình bầu dục có mầu xanh lá cây, đen, nâu, hồng hoặc không màu. Rệp có ba cặp chân Hình 1.5: Cấu tạo ngoài của rệp [116] phân đốt, mắt kép, 1 cặp râu, có cánh (dạng màng) hoặc không có cánh [55]. Ở rệp có cả hai kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính. Nhiều loại có sự thay đổi giữa kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính khá phức tạp. Sự thay đổi giữa hai kiểu để sinh ra trứng hoặc ấu trùng, thay đổi giữa cây chủ thân gỗ và cây chủ thân thảo. Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -20Khoảng 10% loài rệp thay đổi kiểu sinh sản để thích nghi với sự thay đổi cây chủ [75]. Kẻ thù tự nhiên của rệp gồm có bọ rùa ăn rệp, rong bắp cày kí sinh, ấu trùng muỗi kí sinh, nhện cua, vi khuẩn, virus, các loài nấm kí sinh côn trùng (entomopathogenic) nhƣ Entomophthora, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và L. lecanii [28], [110]. 1.5.2. Tình hình rệp hại cây trồng  Trên thế giới Mỗi năm thế giới phải chi trả hàng triệu dollar Mỹ cho công tác phòng trừ rệp hại. Rệp gây hại trên nhiều loại cây trồng quan trọng nhƣ bông, đậu tƣơng, hƣớng dƣơng, củ cải đƣờng, khoai tây, ngô, ngũ cốc và rau cải. Theo thống kê của Tatchell (1989), rệp phá hoại nhiều loại cây trồng ở vƣơng quốc Anh. Sản lƣợng bị thiệt hại thƣờng ở mức 4 – 10% và có thể lên đến 46% ở cây đậu. Ƣớc tính giá trị thiệt hại lên đến 70 triệu bảng Anh [98]. Bảng 1.1: Tình hình thiệt hại ở một số cây trồng do rệp ở Anh [98] Loại cây Rệp gây hại Dạng gây hại Sản lƣợng bị thiệt hại (%) Lúa mì đông Sitobion avenae Phá hoại 9,7 – 12,5 Metopolophium dirhodum Phá hoại 13 Lúa mạch đông Rhopalosiphum padi Truyền bệnh 0 – 86 Lúa mạch xuân Metopolophium dirhodum Phá hoại 8,8 Củ cải đƣờng Myzus persicae Truyền bệnh 6,5 Khoai tây Macrosiphum euphrobiae Phá hoại 5,7 Myzus persicae Phá hoại 4,4 Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B