Tài liệu Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự kỷ việt nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome)

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ VÙNG MÃ HÓA (EXOME) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2019 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THU HIỀN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ VÙNG MÃ HÓA (EXOME) Chuyên ngành: Mã số: Hóa sinh học 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Huy Hoàng Viện Nghiên cứu hệ gen 2. GS.TS. Phan Văn Chi Viện Công nghệ sinh học Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Huy Hoàng và GS.TS Phan Văn Chi đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu cũng như thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ, ủng hộ và tham gia nhiệt tình của các cán bộ, đồng nghiệp của phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, các bác sĩ tại khoa Tâm bệnh, Bệnh viện Nhi Trung Ương,. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo, phòng Quản lý tổng hợp, ThS. Bùi Hải Hà, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và nghiên cứu của nghiên cứu sinh. Tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và người thân đã ở bên tôi chăm sóc, động viên, giúp tôi yên tâm học tập và nghiên cứu. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài thuộc các hướng KHCN ưu tiên cấp Viện Hàn lâm KHCNVN “Giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở bệnh nhân tự kỷ Việt Nam” VAST02.02/15-16. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ quý báu của Viện Hàn lâm KHCNVN. Tác giả luận án Nguyễn Thu Hiền i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Thu Hiền ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. x MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 1.1. Bệnh tự kỷ ......................................................................................................... 4 1.1.1. Giới thiệu bệnh tự kỷ ......................................................................................... 4 1.1.2. Thực trạng bệnh tự kỷ ........................................................................................ 5 1.2. Phân biệt, chẩn đoán hội chứng tự kỷ ............................................................ 9 1.2.1. Hội chứng Asperger ......................................................................................... 10 1.2.2. Hội chứng Rett ................................................................................................. 11 1.2.3. Rối loạn tan rã thời thơ ấu ................................................................................ 12 1.2.4. Rối loạn phát triển lan toả không xác định ...................................................... 12 1.2.5. Phương pháp chẩn đoán và điều trị .................................................................. 12 1.3. Các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ........................................... 15 1.3.1. Các hội chứng di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ .......................................... 15 1.3.2. Những yếu tố gây bệnh ở cấp độ di truyền học ............................................... 17 1.4. Các tiến bộ nghiên cứu về di truyền của rối lo n phổ tự kỷ bằng giải tr nh tự gen thế hệ mới .................................................................................. 23 1.4.1. Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới ........................................................ 23 iii 1.4.2. Giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ ...................................................................................................................... 26 1.4.3. Giải trình tự toàn bộ hệ gen trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ................ 32 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 33 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 33 2.2. Hóa chất và trang thiết bị .............................................................................. 33 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 35 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số................................................................................... 35 2.3.2. Tạo thư viện DNA ............................................................................................ 36 2.3.3. Giải trình tự gen bằng máy Illumina ................................................................ 38 2.3.4. Tiền xử lý số liệu và phân tích dữ liệu ............................................................. 38 2.3.5. Nhân gen bằng kĩ thuật PCR ............................................................................ 43 2.3.6. Giải trình tự gen tự động trên máy Sanger....................................................... 43 2.3.7. Phân tích các gen trong mối tương tác ............................................................. 44 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................. 46 3.1. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 46 3.2. Giải tr nh tự toàn bộ vùng mã hóa ............................................................... 47 3.2.1. Kết quả tạo thư viện DNA ............................................................................... 47 3.2.2. Kết quả giải trình tự gen trên máy Illumina ..................................................... 47 3.3. Xác định biến thể di truyền ở bệnh nhân tự kỷ .......................................... 51 3.3.1. Xác định và chú giải biến thể ........................................................................... 51 3.3.2. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T01 ................................................................. 53 3.3.3. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T02 ................................................................. 56 iv 3.3.4. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T03 ................................................................. 62 3.3.5. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06 ................................................................. 65 3.3.6. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07 ................................................................. 73 3.3.7. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08 ................................................................. 79 3.3.8. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T09 ................................................................. 83 3.4. Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion .............................. 86 3.5. SNP RS7725785 trên gen HTR4.................................................................... 88 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ....................................................................... 89 4.1. Xác định và chú giải biến thể ........................................................................ 89 4.2. Các gen liên quan đến biểu hiện bệnh đặc trƣng của ASD ........................ 91 4.3. Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion .............................. 97 4.4. Gen RYR2, RYR3 .......................................................................................... 101 4.5. Gen MUC16 .................................................................................................. 103 4.6. Đa h nh rs7725785 trên gen HTR4 ............................................................. 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN .......................................................................................... 112 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .......................................................... 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 120 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ADI-R: The Autism Diagnostic Interview - Bảng phỏng vấn chẩn đoán Revised tự kỷ có điều chỉnh ADOS The Autism Diagnostic Observation Bảng quan sát chẩn đoán tự Schedule kỷ ASD Autism Spectrum Disorders Rối loạn phổ tự kỷ BWA Burrows - Wheeler Alignment Tool Công cụ gióng Burrows-Wheeler CARS Childhood Autism Rating Scale Thang chẩn đoán tự kỷ tuổi ấu thơ CDC Centers For Disease Control Trung tâm kiểm soát dịch bệnh CHAT Check - list for Autism in Toddlers Bảng kiểm tra sàng lọc tự kỷ ở trẻ nhỏ chập chững biết đi CNVs Copy number variants Biến thể đa hình số lượng bản sao Cowden syndrome Hội chứng Cowden CS hàng DBC-P Developmental Behavior Checklist for Bảng câu hỏi phát triển hành Parent vi cho bố mẹ dbSNP The Single Nucleotide Polymorphism Ngân hàng dữ liệu đa hình Database đơn nucleotide DSM Cẩm nang chẩn đoán và Diagnostic and Statistical Manual of thống kê về chứng rối loạn Mental Disorder tâm thần FXS Fragile X Hội chứng X dễ gãy Gilliam Autism Rating Scale Thang đánh Gilliam GARS vi giá tự kỷ GATK Genome Analysis Toolkit Công cụ phân tích hệ gen HDAC1 Histone deacetylase 1. Dữ liệu đột biến gen người ICD International Classification of Diseases Phân loại quốc tế về bệnh tật IGV Integrated Genomics Viewer Công cụ xem hệ gen hợp nhất Intellectual disability Khuyết tật trí tuệ ID M-CHAT Modifier Check-list Autism in Toddlers MECP2 NCBI NHGRI Chromatin architecture genes National Center Information for Bảng sàng lọc tự kỷ ở trẻ nhỏ chập chững biết đi có sửa đổi Các gen cấu trúc chromatin Biotechnology Trung tâm thông tin Công nghệ sinh học National Human Genome Research Viện Nghiên cứu quốc gia về Institute gen người NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới PDDNOS Pervasive Developmental Disorder Not Rối loạn phát triển lan tỏa Otherwise Specified không xác định PDD Pervasive developmental disorders Rối loạn phát triển lan tỏa PLADOS The Pre - linguistic Autism Diagnostic Bảng quan sát chẩn đoán tự Observation Schedule kỷ dành cho trẻ chưa biết nói SAM Sequence Alignment / Map Sắp xếp/gióng hàng trình tự SBL sequencing by ligation Giải trình tự bằng ghép nối SBS sequencing by synthesis Giải trình tự bằng tổng hợp Tuberous Sclerosis Bệnh xơ cứng não củ WES Whole exome sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen mã hóa WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ hệ gen TS vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thông tin các mẫu bệnh nhân và gia đình nghiên cứu............ 33 Bảng 2.2. Trình tự đoạn oligonuleotide.................................................... 34 Bảng 3.1. Chất lượng DNA tổng số.......................................................... 46 Bảng 3.2. Bảng thông tin chất lượng đọc của các mẫu giải trình tự......... 49 Bảng 3.3. Kết quả gióng hàng của các mẫu giải trình tự với hệ gen tham chiếu................................................................................ 50 Bảng 3. 4. Kết quả xác định và chú giải biến thể...................................... 51 Bảng 3.5. Số lượng biến thể sau các bước lọc của 07 bệnh nhân............. 52 Bảng 3.6. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T01................................................................................... 53 Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T01............................................................................................ 55 Bảng 3.7. Bảng 3.8. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T02.................................................................................. Bảng 3.9. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T02........................................................................................... 59 Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T03................................................................................... 62 Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T03........................................................................................... 64 Bảng 3.10. Bảng 3.11. 56 Bảng 3.12. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T06.................................................................................. 67 Bảng 3.13. Bảng thống kê biến thể của bệnh nhân T06............................. 68 Bảng 3.14. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T07................................................................................... 74 Bảng 3.15. Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T07............................................................................................ viii 76 Bảng 3.16. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T08................................................................................... Bảng 3.17. Bảng thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T08............................................................................................ 82 Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T09.................................................................................. 83 Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T09........................................................................................... 85 Tổng kết các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở 07 bệnh nhân.......................................................................................... 91 Một số đa hình liên quan đến ASD được công bố trên thế giới 109 Bảng 3.18. Bảng 3.19. Bảng 4.1. Bảng 4.2. ix 80 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tỷ lệ bệnh tự kỷ ở một số nước phát triển trên thế giới.......... 6 Hình 1.2. Tỷ lệ tự kỷ ở Việt Nam so với các nước trong khu vực Châu Á............................................................................................. 8 Hình 1.3. Tình hình bệnh tự kỷ ở Việt Nam........................................... 9 Hình 1.4. Lịch sử nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ từ năm 1975 đến năm 2015 25 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu..................................................................... 36 Hình 2.2. Quy trình tạo thư viện DNA................................................... 37 Hình 2.3. Sơ đồ phân tích dữ liệu giải trình bằng các phần mềm tin sinh chuyên sâu...................................................................... 39 Hình 3.1. Kết quả tách DNA tổng số từ mẫu máu toàn phần................ 46 Hình 3.2. Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện DNA........................... 47 Hình 3.3. Hình ảnh minh họa file kiểm định chất lượng....................... 48 Hình 3.4. Chất lượng dữ liệu của FastQ của các mẫu............................. 49 Hình 3.5. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T01............................. 54 Hình 3.6. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T02............................ 57 Hình 3.7. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân T02........................................................................................... 61 Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Trp13569Cys ở bệnh nhân T02.......................................................................................... 61 Hình 3.9. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T03............................ 63 Hình 3.10. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Val2430Ala trên gen MUC16 ở bệnh nhân T03........................................................................................... 65 Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T06............................ 67 Hình 3.8. Hình 3.11. x Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Leu13171Phe trên gen MUC16 ở bệnh nhân T06.......................................................................................... 69 Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Glu12869Lys trên gen MUC16 ở bệnh nhân T06.......................................................................................... 69 Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho phát hiện biến thể p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06..................................................................... 71 Mô hình mô phỏng cấu trúc 3D của đột biến p.L111P và p.R3048C ở bệnh nhân T06.................................................... 71 Hình 3.16. Vị trí 5 domain đầu tiên của protein RYR3............................ 72 Hình 3.17. Trình tự amino acid của RYR3 ở các loài khác nhau............. 73 Hình 3.18. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T07............................ 75 Hình 3.19. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Val13167Met trên gen MUC16 ở bệnh nhân T07.......................................................................................... 76 Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Arg801Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07.......................................................................................... 77 Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Tyr819Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07.......................................................................................... 77 Mô hình mô phỏng cấu trúc đột biến p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys ở bệnh nhân T07............................................... 78 Hình 3.23 Trình tự amino acid của RYR2 ở các loài khác nhau............. 79 Hình 3.24. Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T08............................ 81 Hình 3.25. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Trp13569Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T08.......................................................................................... 82 Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T09........................... 84 Hình 3.12. Hình 3.13. Hình 3.14 Hình 3.15. Hình 3.20. Hình 3.21. Hình 3.22. Hình 3.26. xi Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân T09........................................................................................... 85 Hình 3.28. Các họ kênh ion và các gen liên quan..................................... 87 Hình 3.29. Đa hình c.507+53G>T trên gen HTR4 ở BN T01, T07, T08, T09........................................................................................... 88 Vai trò của gen HTR4.............................................................. 107 Hình 3.27. Hình 4. 1 xii 1 MỞ ĐẦU Tự kỷ (ASD) thuộc một nhóm các rối loạn một rối loạn phát triển, không đồng nhất về mặt di truyền. Bệnh nhân tự kỷ thường có biểu hiện khiếm khuyết về tương tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Một số bệnh thường thấy đi kèm với ASD bao gồm rối loạn lo âu, rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa và các phản ứng bất thường gây kích thích cảm giác. Ước tính mới nhất cho thấy rằng ASD ảnh hưởng đến khoảng 1 trong 59 trẻ em dưới 8 tuổi và tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai chiếm ưu thế so với bé gái. Bệnh được cho là có nguy cơ di truyền do ảnh hưởng đồng thời bởi nhiều biến thể gen khác nhau. Trong những nghiên cứu ở các cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu hình của ASD ở những cặp song sinh cùng trứng chiếm 70-90%, trong khi tỉ lệ này ở những cặp song sinh khác trứng chỉ 0-30%. Các nghiên cứu cho thấy rằng, anh chị em trong cùng một gia đình có một bệnh nhân mắc bệnh thì nguy cơ mắc bệnh trong gia đình lên tới 25%, cao hơn nhiều so với nguy cơ mắc bệnh của dân số nói chung. Trong số những rối loạn tâm thần và thần kinh có tính di truyền, tự kỷ chiếm tỷ lệ cao lên tới 40-80%. Sự tương tác yếu tố môi trường với yếu tố di truyền gây ra những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh, phát triển trí não. Trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ, đã có nhiều phương pháp được áp dụng như FISH, Microarrya, aCGH. Tuy nhiên, đối với con người, trí tuệ là một tính trạng cực kỳ phức tạp do nhiều gen quy định. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng của thay đổi các gen liên quan đến trí tuệ, dẫn đến thiểu năng trí tuệ cũng như tự kỷ cần được tiến hành ở toàn bộ hệ gen, nhất là vùng mã hóa (exome). Đây là hai phương pháp nghiên cứu đã và đang đạt được nhiều bước tiến nhảy vọt trong nghiên cứu di truyền bệnh này. Giải trình tự vùng mã hóa - Whole exome sequencing (WES) là một ứng dụng của công nghệ giải trình tự thế hệ mới để xác định các biến thể trên tất cả các vùng mã hóa trong hệ gen. Hàng chục nghìn biến thể gen có thể được xác định trên exome trong nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch, 2 thần kinh,... WES đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu lâm sàng vài năm gần đây. Do đó, WES đang được coi là hướng đi đúng đắn để nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ. Tại Việt Nam, bệnh tự kỷ cũng có xu hướng tăng nhanh và cũng chưa có phương pháp chữa trị triệt để, mà chỉ có các phương pháp hỗ trợ, cải thiện tình hình bệnh. Đặc biệt, tại Việt Nam, các nghiên cứu di truyền bệnh còn rất hạn chế. Xuất phát từ những thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phƣơng pháp giải tr nh tự toàn bộ vùng mã hóa (exome)” được thực hiện nhằm góp phần phát hiện và làm sáng tỏ nguyên nhân gây bệnh tự kỷ ở người Việt Nam. Nghiên cứu này sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu di truyền học giải thích được cơ chế gây bệnh và các bác sĩ lâm sàng có thêm hướng điều trị bệnh hiệu quả, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống. Mục tiêu của đề tài 1. Giải trình tự và phân tích toàn bộ vùng mã hóa (exome) ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam. 2. Xác định các biến thể di truyền trên các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam. Nội dung nghiên cứu: 1. Sàng lọc bệnh nhân tự kỷ. 2. Thu thập mẫu máu và tách DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân và gia đình. 3. Giải trình tự toàn bộ exome của một số bệnh nhân tự kỷ tự Việt Nam. 4. Phân tích số liệu tìm các biến thể di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ở một số người Việt Nam. Những đóng góp mới của luận án: 1. Đưa ra số liệu các biến thể mới ở 07 người bệnh tự kỷ Việt Nam. 2. Xác định 02 biến thể mới (p.L111P và p.R3048C) trên gen RYR3 ở 01 bệnh nhân. 3. Xác định 02 biến thể mới (p.R801C và p.W819C) trên gen RYR2 ở 01 bệnh nhân. 3 4. Xác định 06 biến thể mới trên gen MUC16 (p.A2224S; p.W13569C; p.Val13167Met; p.L13171F; p.E12869K; p.D13229E) ở 06 bệnh nhân. 5. Xác định đa hình rs7725785c.507+53G>T trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH TỰ KỶ 1.1.1. Giới thiệu bệnh tự kỷ Tự kỷ là một dạng rối loạn trong Rối Loạn Phát Triển Lan Toả (Rối Loạn Phổ Tự Kỷ). Bệnh khởi phát sớm trong 3 năm đầu tiên của cuộc đời. Tự kỷ tác động đến sự phát triển của trẻ trong 3 lĩnh vực chính đó là: tương tác xã hội, ngôn ngữ và hành vi. Tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ là một nhóm các hội chứng không đồng nhất về mặt di truyền. Bệnh nhân tự kỷ biểu hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về tương tác xã hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Hiện tượng này bao gồm nhiều biểu hiện khác nhau, ví dụ như người bệnh hay có hành động quay cổ tay, quay đầu hay có những hành động có tính bắt buộc như xếp đồ chơi, búp bê, ô tô thành một hàng ngang hoặc dọc. Nguy hiểm nhất chính là bệnh nhân hay tự làm mình bị thương như: lấy tay chọc lên mắt, cấu lên da, tự đánh vào tay và đầu. Một dấu hiệu nữa là trẻ mắc bệnh thường có khả năng đi lại chậm hơn nhiều so với trẻ khác, phải mất 2-3 năm tuổi mới đi lại bình thường được. Khả năng giao tiếp bằng mắt của trẻ không tốt và bệnh nhân thường có thái độ hờ hững với mọi thứ xung quanh. Ngoài những triệu chứng lâm sàng cổ điển cụ thể, khoảng 31% bệnh nhân bị khuyết tật trí tuệ, 20-25% có triệu chứng co giật (Canitano, 2007; Liu and Takumi , 2014; Srivastava and Schwartz, 2014). Một số bệnh thường thấy đi kèm với ASD bao gồm rối loạn lo âu (White et al, 2009), rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa (Valicenti-McDermott et al, 2006) và các phản ứng bất thường gây kích thích cảm giác (Rogers et al, 2003). Các triệu chứng chính của ASD thường xuất hiện sớm, khoảng 6 tháng tuổi và thể hiện rõ khoảng năm 2-3 tuổi. Bệnh gặp phổ biến ở bé trai nhiều hơn bé gái, với tỷ lệ khoảng 4:1 (Baio et al, 2018). Bệnh tự kỷ là bệnh có cơ sở di truyền rất phức tạp do sự tương tác của nhiều gen. Sự tương tác của gen với 5 môi trường hay những yếu tố ngoại cảnh khác không làm biến đổi DNA nhưng ảnh hưởng đến biểu hiện gen. Cơ sở di truyền của bệnh được đề xuất có liên quan đến sự ảnh hưởng kết hợp của các biến thể khác nhau (Inoue et al, 2015). Trong những nghiên cứu ở những cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu hình của ASD ở những cặp song sinh cùng trứng chiếm 70-90%, trong khi tỉ lệ này ở những cặp song sinh khác trứng chỉ 0-30% (Rosenberg et al, 2009; Ronald and Hoekstra, 2014). Các nghiên cứu cho thấy rằng, anh chị em trong cùng một gia đình có một bệnh nhân mắc bệnh thì các thành viên còn lại có nguy cơ mắc cao hơn so với dân số nói chung khoảng 25%. Trong những rối loạn tâm thần và thần kinh có tính di truyền, tự kỷ chiếm tỷ lệ cao lên tới 40-80% (Chahrour et al, 2012). Có nhiều cách giải thích khác nhau về sự tăng tỷ lệ trẻ mắc bệnh tự kỷ trên thế giới hàng năm. Gần đây, một số nhà khoa học cho rằng các bà mẹ mang thai đã tiếp xúc với ô nhiễm hóa chất, đặc biệt là kim loại và thuốc trừ sâu, sự tiếp xúc này làm biến đổi sự phát triển cấu trúc não của trẻ dẫn đến bị bệnh tự kỷ. Yếu tố môi trường cũng có những tương tác với yếu tố di truyền và gây ra những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh và phát triển trí não (Elif et al, 2016). 1.1.2. Thực tr ng bệnh tự kỷ 1.1.2.1.Thực trạng bệnh tự kỷ trên thế giới Những nghiên cứu từ trước năm 1985 về tỷ lệ mắc bệnh tự kỷ cho thấy có khoảng 5 trường hợp trong số 1000 trẻ em. Từ những năm 1980, số ca mắc bệnh được chẩn đoán tăng lên với tốc độ nhanh chóng. Kết quả này một phần là do những tiến bộ của y học trong chẩn đoán và một phần là do chính phủ cũng đã đầu tư nhiều hơn vào lĩnh vực y tế đặc biệt là những bệnh liên quan đến thần kinh (Blumberg, 2007). Các đánh giá thống kê cho thấy tỉ lệ mắc ASD trên thế giới ở các nước khác nhau là khác nhau. Năm 2006, theo thống kê của Williams và cộng sự, tỷ lệ ASD trên toàn cầu là 20/10.000 (Williams et al, 2006). Đến năm 2012, Elsabbagh và nhóm nghiên cứu của mình đã báo cáo tỷ lệ mắc ASD trên thế giới là 62/10.000, tức là cứ 160 trẻ thì có 1 trẻ mắc bệnh (Elsabbagh et al, 2012). 6 Hình 1.1 Tỷ lệ bệnh tự kỷ ở một số nƣớc phát triển trên thế giới (Nguồn: Trung tâm kiểm soát và Phòng chống bệnh - CDC, 2015) Tỷ lệ bệnh năm 2015 theo thống kê của Baxter và cộng sự đã có sự gia tăng đáng kể, ước tính khoảng 7,6/1000, tức là trong 132 người thí có 1 người mắc ASD (Baxter et al, 2015). Trung tâm Kiểm soát và Phòng chống bệnh (CDC) ở Mỹ đã đưa ra tỷ lệ trẻ mắc những rối loạn thần kinh trên toàn cầu năm 2014 là 1% (CDC, 2014). Hiện nay, có hơn 3,5 triệu người Mỹ mắc bệnh tự kỷ, ước tính 1/68 trẻ em được chẩn đoán mắc bệnh (CDC, 2014). Như vậy, tỷ lệ tự kỷ ở trẻ em ở Hoa Kỳ tăng 119,4% so với năm 2000 (1/150) đến năm 2010 (1/68) (CDC, 2014) (Hình 1.1). Vì thế, tự kỷ được đánh giá là chứng khuyết tật có tỷ lệ phát triển nhanh nhất (CDC, 2008). Điều này dễ dàng được giải thích bởi lối sống ngày càng thực dụng tại Mỹ. Bên cạnh Mỹ, Anh cũng là một nước có tỷ lệ tự kỷ ở mức cao (xấp xỉ 1%) (Brugha et al, 2011). Ngoài Anh và Mỹ có tỷ lệ mắc tự kỷ cao, bệnh cũng có mặt ở nhiều quốc gia trên thế giới. Do tỷ lệ trẻ tự kỷ gia tăng nhanh chóng đang đặt ra những vấn đề lớn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Tại Mỹ, tự kỷ được xếp vào danh mục 13 dạng khuyết tật bẩm sinh và vấn đề trẻ tự kỷ đã được khẳng định là một trong những ưu tiên hàng đầu trong chính sách y tế của nước này. Tại một số nước ở châu Á hiện nay như Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc, vấn đề tự kỷ cũng đã được các nhà khoa học và xã hội đặc biệt quan tâm.