Tài liệu Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương lentinula edodes bằng các phương pháp phân tích hiện đại

.. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC DƯƠNG THÚY QUỲNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM HƯƠNG (LENTINULA EDODES) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC DƯƠNG THÚY QUỲNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH CẤU TRÚC VÀ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ TRONG NẤM HƯƠNG (LENTINULA EDODES) BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Nguyễn Hữu Tùng 2. PGS.TS. Dương Nghĩa Bang THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại”, em đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè đồng nghiệp. Em xin bày tỏ sự biết ơn đặc biệt đến TS. Nguyễn Hữu Tùng - Trưởng nhóm nghiên cứu Hóa dược và Hoạt chất sinh học, Trường Đại học Phenikaa. PGS. TS. Dương Nghĩa Bang - Trưởng phòng Hành chính - Tổ chức, Trường ĐH Khoa Học - ĐH Thái Nguyên. TS Lê Đăng Quang - Giám đốc trung tâm nghiên cứu triển khai các hoạt chất sinh học, Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam; đã hướng dẫn em tận tình, chu đáo trong suốt quá trình làm luận văn, giúp em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Phạm Thế Chính - Trưởng Khoa Hóa học cùng các thầy, cô tại khoa Hóa học trường ĐH Khoa học - ĐH Thái N và các bạn trong lớp cao học K11 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu cùng toàn thể cán bộ giáo viên Trường THPT Hàm Long - Bắc Ninh đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian và công việc để em hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên, cổ vũ, khích lệ tinh thần trong suốt thời gian qua. Mặc dù đã có nhiều cố gắng trong quá trình thực hiện đề tài, song không thể tránh những hạn chế và thiếu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô giáo và bạn bè đồng nghiệp. Tác giả luận văn Dương Thúy Quỳnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. a DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................... b DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................ d MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................... 3 1.1. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc ............................... 3 1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) .................................................... 3 1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR .. 4 1.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .................................................. 6 1.1.4. Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC ....................................... 8 1.2. Giới thiệu về nấm hương (Lentinula edodes) .................................... 10 1.3. Lentinan .............................................................................................. 11 1.3.1. Đặc điểm cấu tạo ............................................................................. 11 1.3.2. Hoạt tính và ứng dụng của Lentinan ............................................... 13 1.4. Phương pháp chiết tách Lentinan ....................................................... 16 1.4.1. Một số phương pháp chiết tách phổ biến ........................................ 16 1.4.2. Định hướng lựa chọn phương pháp chiết tách Lentinan................. 18 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ............................................................. 19 2.1. Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ........................................ 19 2.1.1. Đối tượng ........................................................................................ 19 2.1.2. Hóa chất........................................................................................... 19 2.1.3. Thiết bị ............................................................................................ 19 2.2. Thực nghiệm ...................................................................................... 20 2.2.1. Phân tích hàm lượng Lentinan ........................................................ 20 2.2.2. Phương pháp tạo mẫu phân tích Lentinan....................................... 22 2.2.3. Phân tích xác định cấu trúc của Lentinan ....................................... 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2.2.4. Xác định hàm lượng tổng Phenolic.......................................................25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................... 25 3.1. Xây dựng đường chuẩn β-glucan ....................................................... 25 3.2. Kết quả nghiên cứu quá trình tạo mẫu Lentinan ................................ 25 3.2.1. Nghiên cứu lựa chọn dung dịch đệm cho quá trình tạo mẫu Lentinan ở giai đoạn 2 ...................................................................................... 26 3.2.2. Nghiên cứu lựa chọn pH dung dịch đệm cho quá trình tạo mẫu Lentinan ở giai đoạn 2....................................................................... 27 3.2.3. Qui trình tạo mẫu Lentinan ............................................................. 29 3.3. Phân tích xác định cấu trúc của Lentinan .......................................... 33 3.3.1. Đặc điểm mẫu M2 trên cơ sở phương pháp phổ hồng ngoại IR ..... 33 3.3.2. Phân tích chất M2 trên cơ sở phương pháp ESI-MS/MS ............... 34 3.3.3. Phân tích các dữ liệu thu được trên cơ sở phương pháp NMR ....... 36 3.3.4. Phân tích khối lượng phân tử của Lentinan (M2) bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography) ................. 40 3.3.5. Tổng hợp dữ liệu phổ của Lentinan (M2).............................................42 3.4. Phân tích xác định hàm lượng tổng Phenolic...........................................42 KẾT LUẬN .............................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TĂT 13 C- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic Resonance) DMSO Dimethyl sulfoxide 1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic H- NMR Resonance) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MS Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) ESI-MS Phổ khối lượng Ion hóa (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) HSQC Phổ NMR 2 chiều HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) HMBC Phổ NMR 2 chiều HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Phổ hồng ngoại của 7 - hidroxy - 4- metylcoumarin .................. 3 Hình 1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat .......................... 5 Hình 1.3. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC .................................................... 8 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc Lentinan [13]..................................................... 12 Hình 1.5. Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử AFM ( Atomic force microscope) và ảnh của Lentinan trong dung dịch 250C [32] 12 Hình 1.6. Mô hình phân tử xoắn kép ba theo chiều phải của β-glucan (Lentinan) [29] ........................................................................ 12 Hình 1.7. Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit [24] ............................ 13 Hình 1.8. Cơ chế kháng u của Lentinan [32] ............................................ 14 Hình 2.1. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ D-glucose................................................................................. 21 Hình 3.1. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ D-glucose................................................................................. 25 Hình 3.2. Qui trình tạo mẫu Lentinan (giai đoạn 1).................................. 30 Hình 3.3. Qui trình tạo mẫu Lentinan (giai đoạn 2).................................. 31 Hình 3.4. Qui trình tạo mẫu Lentinan ....................................................... 32 Hình 3.5. Phổ IR của mẫu M2................................................................... 34 Hình 3.6. Phổ ESI-MS (negative-mode) của mẫu M2 chế độ MS/MS .... 34 Hình 3.7. Phổ LCMS-QTOF của mẫu Lentinan tiêu chuẩn từ nấm hương [37] .......................................................................................... 35 Hình 3.8. Phân tử Lentinan dạng β-D-glucan polysaccharide với mảnh m/z 1151 tương ứng mắt xích C42H72O36 ....................................... 35 Hình 3.9. (A) Mảnh phân nhánh với liên kết β-D-1→6 glucosic và liên kết β-D-1→3 glycosidic trong chuỗi chính của lentinan. Tương tác HMBC [ ] của liên kết trong chuỗi chính. (B). Cấu trúc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn chuỗi xoắn helix tạo thành từ 3 chuỗi đơn single của lentinan trong dung môi nước và DMSO [41]. ..................................... 37 Hình 3.10. Phổ 1H-NMR của M2 ghi trong D2O tại tần số 500 MHz ghi trên máy Bruker AM 500 FT-NMR ............................................... 38 Hình 3.11. Phổ 13C-NMR của các tín hiệu carbon thuộc mẫu M2. Mẫu ghi trong dung môi D2O tại tần số 125 MHz trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR .................................... 38 Hình 3.12. Phổ C-NMR của mẫu M2 và phần giãn rộng từ δ 72-75.5 13 ppm. ......................................................................................... 39 Hình 3.13. Phổ HSQC của các tín hiệu cross-peak của mẫu M2 ............. 39 Hình 3.14. Phổ HMBC của các tín hiệu cross-peak thuộc mẫu M2 ......... 40 Hình 3.15. Khối lượng phân tử ước tính của M2.1 (B) ............................ 40 Hình 3.16. Đường chuẩn định lượng biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ acid gallic........................................................................42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Một số loại β-glucan[10] .......................................................... 13 Bảng 3.1. Kết quả lựa chọn dung dịch đệm cho quá trình tạo mẫu Lentinan ở giai đoạn 2 .................................................................................. 26 Bảng 3.2. Kết quả lựa chọn pH dung dịch đệm photphat trong quá trình tạo mẫu Lentinan ở giai đoạn 2 ........................................................... 28 Bảng 3.3. Tín hiệu 1H-NMR và 13 C-NMR của chất M2 ghi trong dung môi D2O ......................................................................................... 38 Bảng 3.4. Tổng hợp dữ liệu phổ của Lentinan (M2).......................................41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Hiện nay, các phương pháp phổ không chỉ ứng dụng trong phạm vi ngành hóa học mà còn ở nhiều ngành khác nhau như hóa sinh, y dược, nông nghiệp, dầu khí, vật liệu, môi trường...Sự phát triển mạnh mẽ của các phương pháp phổ đã giúp cho việc nghiên cứu trong các ngành khoa học đặc biệt là hóa học các hợp chất thiên nhiên trở nên dễ dàng hơn, phát triển nhanh hơn. Trước đây, để chứng minh cấu tạo của một chất có thể mất nhiều thời gianthậm chí có khi kéo dài nhiều năm thì nay có thể thực hiện sau vài giờ, sở dĩ làm được như vậy là nhờ sự hỗ trợ của các phương pháp vật lý hiện đại. Để phân tích cấu trúc của các hợp chất hữu cơ có thể sử dụng các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại khả kiến, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối lượng... Mỗi phương pháp cho phép xác định một số thông tin khác nhau của cấu trúc phân tử và hỗ trợ lẫn nhau trong việc xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ. Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển ngày càng cao của khoa học kĩ thuật và kinh tế xã hội, đời sống tinh thần và vật chất của con người ngày càng được nâng cao và không ngừng được cải thiện. Theo đó, vấn đề đảm bảo tính “Sạch - An toàn - Tốt cho sức khỏe” của các sản phẩm sử dụng trong cuộc sống ngày càng được chú trọng. Các loại sản phẩm ấy có thể cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng đa lượng, vi lượng thiết yếu cho cơ thể, bên cạnh đó chúng phải có tính phòng và chữa bệnh. Nấm ăn là một trong số các loại thực phẩm đáp ứng được mục tiêu đó. Từ hàng ngàn năm nay, nấm là một loại thực phẩm được ưa chuộng từ lâu đời và hiện nay được xếp vào nguồn cung cấp thực phẩm chức năng của nhiều quốc gia trên thế giới. Trong số đó, nấm hương (Lentinula edodes) là một loại thực phẩm được xem là “Thịt sạch - Rau sạch” có giá trị dinh dưỡng cao. Nấm hương chứa khá nhiều các nguyên tố đa lượng, vi lượng, khoáng cũng như các acid amin... Lentinula là một β-glucan từ nấm hương, polysacarit mang hoạt tính sinh học chất tăng cường miễn dịch mới phổ biến nhất hiện nay. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Vài thập kỷ trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học và hóa dược liệu, các chế phẩm β-glucan nguồn gốc từ nấm tự nhiên, nấm nuôi trồng, nấm men được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm chống ung thư và sản phẩm tăng cường chức năng miễn dịch. Hàng năm, lượng nấm hương sử dụng để sản xuất Lentinan ở Nhật khoảng vài trăm ngàn tấn có giá trị lên tới trăm triệu USD, với qui trình tách chiết công nghiệp cho ra sản phẩm Lentinan chất lượng cao phân bố trên toàn thế giới [4,5]. Trong khi đó ở Việt Nam có nguồn nấm hương dồi dào, trồng rất nhiều tại các tỉnh thành nhưng chủ yếu dùng làm thực phẩm, và xuất khẩu chưa phát triển làm nấm dược liệu. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu phân tích cấu trúc và hàm lượng, một số hợp chất có trong nấm hương (Lentinula edodes) bằng các phương pháp phân tích hiện đại” nhằm tách chiết, tinh chế và phân tích cấu trúc những hợp chất thiên nhiên có trong nấm hương, nâng cao giá trị của nấm hương. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 1.1.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Phổ hồng ngoại [1,2] được sử dụng để nhận biết các chất (kiểm tra độ tinh khiết), để xác định các nhóm chức (phân tích cấu tạo), để định lượng hợp chất hữu cơ và để nghiên cứu tác dụng tương hỗ nội phân tử và ngoại phân tử… Để kiểm tra độ tinh khiết người ta đem so phổ đồ của chất với phổ đồ mẫu có sẵn trong phổ đồ bản hoặc thư viện phổ (sử dụng phần mềm máy tính). Nói chung để nhận biết một chất chưa biết bằng phương pháp phổ hồng ngoại, điều quan trọng là phải biết giải thích phổ. Trong trường hợp thông tin cấu trúc dự đoán chưa đủ tin cậy thì cần dựa vào các phương pháp phổ khác hoặc bằng mẫu thử hóa học thích hợp. Ngoài ra, trên cơ sở của định luật Lambert - Beer phổ hồng ngoại còn được ứng dụng trong phân tích định lượng. Hình 1.1. Phổ hồng ngoại của 7 - hidroxy - 4- metylcoumarin Đường cong biểu diễn cường độ hấp thụ với số sóng của bức xạ hồng ngoại được gọi là phổ hồng ngoại, trên phổ biểu diễn các cực đại hấp thụ ứng với những dao động đặc trưng của nhóm nguyên tử hay liên kết nhất định. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Căn cứ vào phổ hồng ngoại đo được đối chiếu với các dao động đặc trưng của các liên kết, ta có thể nhận ra sự có mặt của các liên kết trong phân tử. Một phân tử có thể có nhiều dao động khác nhau và phổ hồng ngoại của các phân tử khác nhau thì khác nhau, tương tự như sự khác nhau của các vân ngón tay. Sự chồng khít lên nhau của phổ hồng ngoại thường được làm dẫn chứng cho hai hợp chất giống nhau. Khi sử dụng phổ hồng ngoại để xác định cấu trúc, thông tin thu được chủ yếu là xác định các nhóm chức hữu cơ và những liên kết đặc trưng. Các pic nằm trong vùng từ 4000 - 1600 cm-1 thường được quan tâm đặc biệt, vì vùng này chứa các dải hấp thụ của các nhóm chức, như OH, NH, C=O, C≡N… nên được gọi là vùng nhóm chức. Vùng phổ từ 1300 - 626 cm-1 phức tạp hơn và thường được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định nhóm chức. Chính ở đây các dạng pic thay đổi nhiều nhất từ hợp chất này đến hợp chất khác, vì thế vùng phổ từ 1500 cm-1 được gọi là vùng vân ngón tay. 1.1.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) [3,4] là phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất hữu cơ. Phương pháp phổ biến được sử dụng là phổ 1H-NMR và 13C-NMR. Hạt nhân của nguyên tử 1H và 13C có momen từ. Nếu đặt proton trong từ trường không đổi thì moment từ của nó có thể định hướng cùng chiều hay ngược chiều với từ trường. Đó là spin hạt nhân có tính chất lượng tử với các số lượng tử +1/2 và -1/2 . Độ chuyển dịch hóa học : Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau. Đặc trưng cho các hạt nhân 1H và 13C trong phân tử có độ chuyển dịch hóa học δ; đối với hạt nhân 1H thì:    TMS  x .10 6 ( ppm) o Trong đó:νTMS, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn TMS và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Đối với các hạt nhân khác thì độ chuyển dịch hóa học được định nghĩa một các tổng quát như sau:   chuan  x .10 6 ( ppm) o Trong đó: νchuan, νx là tần số cộng hưởng của chất chuẩn và của hạt nhân mẫu đo, νo là tần số cộng hưởng của máy phổ. Hằng số chắn σ xuất hiện do ảnh hưởng của đám mây electron bao quanh hạt nhân nguyên tử, do đó tùy thuộc vào vị trí của hạt nhân 1H và 13C trong phân tử khác nhau mà mật độ electron bao quanh nó khác nhau dẫn đến chúng có giá trị hằng số chắn σ khác nhau và do đó độ chuyển dịch hóa học của mỗi hạt nhân khác nhau. Theo đó proton nào cộng hưởng ở trường yếu hơn sẽ có độ chuyển dịnh hóa học lớn hơn. Dựa vào độ chuyển dịch hóa học  ta biết được loại proton nào có mặt trong chất được khảo sát. Giá trị độ chuyển dịch hóa học không có thứ nguyên mà được tính bằng phần triệu (ppm). Đối với 1H-NMR thì δ có giá trị từ 0-12 ppm, đối với 13C-NMR thì δ có giá trị từ 0-230 ppm. Hình 1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của benzyl axetat Hằng số tương tác spin-spin J: Trên phổ NMR, mỗi nhóm hạt nhân không tương đương sẽ thể hiện bởi một cụm tín hiệu gọi và vân phổ, mỗi vân phổ có thể bao gồm một hoặc nhiều hợp phần. Nguyên nhân gây nên sự tách Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn tín hiệu cộng hưởng thành nhiều hợp phần là do tương tác của các hạt nhân có từ tính ở cạnh nhau. Tương tác đó thể hiện qua các electron liên kết. Giá trị J phụ thuộc vào bản chất của hạt nhân tương tác, số liên kết và bản chất các liên kết ngăn giữa các tương tác. Hằng số tương tác spin-spin J được xác định bằng khoảng cách giữa các hợp phần của một vân phổ. Dựa vào hằng số tương tác spin-spin J ta có thể rút ra kết luận về vị trí trương đối của các hạt nhân có tương tác với nhau. 1.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (MS) Phương pháp phổ khối lượng (MS) [3,5] là một phương pháp phân tích công cụ quan trọng để phân tích thành phần và cấu trúc của các hợp chất vô cơ và hữu cơ. Trong phương pháp phổ khối lượng, các phân tử của mẫu chất được ion hóa và được phân mảnh. Các ion xuất hiện được phân tách theo số khối của chúng và được ghi nhận dưới dạng các tín hiệu trên phổ. Vị trí của tín hiệu cho biết số khối và cường độ của tín hiệu cho biết hàm lượng tương đối của ion tương ứng. a. Cơ sở lí thuyết Như đã biết trong các phương pháp phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân người ta giữ nguyên phân tử để nghiên cứu thì ở phương pháp phổ khối lượng người ta lại “phá hủy” phân tử để nghiên cứu chúng. Trong phương pháp phổ khối lượng, trước tiên mẫu chất được làm bay hơi, sau đó các phân tử bị bắn phá bởi chùm electron phóng ra từ catot của một ống phóng điện với năng lượng cao và bị ion hóa. Để có thể giải phóng ra được một electron ra khỏi phân tử, electron va chạm phải có một động năng tối thiểu bằng năng lượng ion hóa của phân tử (715eV). Giả sử phân tử (ABC) với A, B, C có thể là một nguyên tử hay nhóm nguyên tử va chạm với các electron có năng lượng cao hơn năng lượng ion hóa, đầu tiên xảy ra sự ion hóa phân tử [25]: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn (ABC) + 1e  (ABC)+ + 2e (ABC) + e  (ABC)Z+ + (z+1)e (ABC) + e  (ABC)- (a) (b) (c) Ở quá trình (a) sự va chạm với electron đã loại phân tử một electron. Vì ở các phân tử hữu cơ các electron đều ghép đôi nên phân tử mất một electron thì ion được tạo thành có một electron độc thân. Ở quá trình (b) phân tử bị mất Z electron (Z = 2, 3) khi đó tạo ra ion phân tử mang điện tích Z+ Ở quá trình (c) phân tử nhận một electron và trở thành anion gốc (ABC)Hai quá trình (b) và (c) có xác suất rất thấp. Do đó quá trình (a) là quan trọng nhất và trong hầu hết các trường hợp chỉ có sự tách một electron ra khỏi phân tử và từ đó các ion hầu hết là ion dương hóa trị 1. Các ion sinh ra được phân tách, rồi ghi lại tín hiệu theo tỉ số khối lượng, điện tích (m/Ze) của chúng. Trong máy phổ khối lượng chỉ những ion dương mới đến được bộ phận tách, còn ion âm thì bị giữ lại ở buồng ion hóa, các phân tử trung hòa thì được hút ra ngoài. Vì xác suất tạo thành các ion có Z>1 là rất nhỏ và vì e là điện tích electron, được quy ước bằng 1 đơn vị điện tích, nên thông thường(m/Ze) hay (m/e) chính là số khối của ion. b. Ứng dụng của phổ khối - Xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của phântử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó. - Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất. - Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần tách riêng của nó. -Xác định công thức phân tử dựa vào phân tử khối chính xác hoặc dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị.. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 1.1.4. Phân tích hàm lượng các chất bằng HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) [6] là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhừ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng. Khi phân tích sắc ký, các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và hầu hết sự phân tách đều xảy ra ở nhiệt độ thường. Chính vì thế mà các thuốc không bền với nhiệt không bị phân hủy khi sắc ký. Sắc ký thường được hoàn thành trong một thời gia ngắn (khoảng 30 phút). Chỉ những thành phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích được bằng HPLC. Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong lĩnh vực phân tích hóa học nói chung cũng như trong kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược nói riêng. Hình 1.3. Sơ đồ thiết bị phân tích HPLC (1) Bình chứa pha động: Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%. (2) Bộ khử khí Degases: Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi dẫn đến sai kết quả phân tích. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn (3) Bơm cao áp: Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600 bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10 ml/phút. (4) Bộ phận tiêm mẫu: Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi. (5)Cột sắc ký:Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25 cm đường kính trong 1-10 mm, hạt nhồi cỡ 0,35µm,…Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký. (6) Đầu dò: Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,… (7) Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích. (8) In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển. Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược phẩm, thực phẩm, môi trường, hóa chất,… Thiết bị HPLC cũng ngày càng phát triển và hiện đại hơn nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo và sản xuất thiết bị phân tích.Để đảm bảo chất lượng kết quả phân tích nhiều loại chỉ tiêu trên các nền mẫu khác nhau, đáp ứng được nhu cầu phân tích đa dạng của khách hàng, CASE cũng đã đầu tư các hệ thống HPLC hiện đại của các hãng nổi tiếng trên thế giới trong sản xuất thiết bị phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ NẤM HƯƠNG (LENTINULA EDODES) Nấm hương (còn gọi là nấm đông cô) là loại nấm ăn có nguồc gốc bản địa ở Đông Á. Tên khoa học: Lentinula edodes Đặc điểm phân loại[10,11]: - Giới : Fungi - Họ : Marasmiaceae - Ngành : Basidiomycota - Chi : Lentinula - Lớp : Agaricomycetes - Loài : L. edodes - Bộ : Agaricales Hình dạng Nấm hương có dạng như cái ô, đường kính 4-10 cm, màu nâu nhạt, khi chín chuyển thành nâu sậm. Nấm hương có một chân đính vào giữa tai nấm. Mặt trên tai nấm màu nâu, mặt dưới có nhiều bản mỏng xếp lại.Trên mặt nấm có những vảy nhỏ màu trắng. Thịt nấm màu trắng, cuống hình trụ. Nấm mọc trên những cây có lá to và thay lá mỗi mùa như dẻ, sồi, phong[10,11]. Thành phần hóa học Trong 100g nấm hương khô (phần ăn được) chứa 13 g nước, 19 g protein, 1,8g lipit, 54g hydratcacbon, 7,8g chất xơ, 4,9g chất khoáng. Vitamin trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn nấm hương: B1, B2, B12, PP, provitamin D. Ngoài ra, còn chứa 9 loại axit amin không thay thế: Isoleuxin, Leuxin, Lysin, Metionin, Phenylalamin, Valin, Tyrosin, Trytophan, Alanin. Hơn nữa trong nấm hương và hệ sợi nấm hương có tới 40 loại enzyme. Một số enzym đáng chú ý: enzym β-(1-3)-glucozidaza, kitinaza, lipoidaza, ligninaza, pepsin, loxintinaza, pectinaza, saccaraza, transferaza, hemixenlulaza, amylotransferaza, inulaza, glycozidaza, insulinaza, asparaginaza, peroxydaza, lactaza, tyrozin oxydaza,…[20,26,28]. Theo Mizuno yếu tố tạo nên hương thơm, vị ngon của nấm là monosodium glutamat, nucleotit, amino axit tự do, chuỗi peptit, axit hữu cơ (axit malic, axít fumalic, axít glutaric, axit oxalic, axit lactic,… ) và đường [22]. Các nhà khoa học đã chiết xuất được chất Lentinan và Lentinula Edodes Mycelium (LEM) từ nấm hương. Đây là 2 chất chính tạo nên tác dụng dược lý của loại nấm này [22]. 1.3. LENTINAN 1.3.1. Đặc điểm cấu tạo Lentinan là một β-glucan có chứa liên kết glycosidic β -1,3/β -1,6. Đó là một polysacarit gồm các β-D-glucopyranose liên kết với nhau, trong đó cách 5 liên kết (1-3)-β-D-glucopyranose lại có hai nhánh liên kết (1-6) -βglucopyranose. Trọng lượng phân tử: xấp xỉ 500.000 Da. Công thức phân tử: (C6H10O5)n . Độ quay riêng: 14-220 (NaOH). Danh pháp hóa học: β-D-glucopyranosyl-(1→6)-[β-D-glucopyranosyl(1→3)-[β-D-glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-β-Dglucopyranose Lentinan có cấu trúc điển hình của chuỗi xoắn kép ba [16,18,25,30]. Các (1,3)-β-D-glucan khác nhau bởi khối lượng phân tử, chiều dài mạch chính, mức độ phân nhánh và chiều dài mạch nhánh.Kiểu cấu tạo mạch của các (1,3)-β-D-glucan có sự phân biệt khá lớn theo nguồn gốc của chúng. (1,3)-β-Dglucan của nấm thường là một mạch phân nhánh dạng xương cá với mạch ngắn nối vào mạch chính bằng dây nối 1→6 [12, 29]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn