Tài liệu Nghiên cứu phân tích cấu trúc dẫn xuất dibenzoaza 17 crown 5 ether bằng các phương pháp phổ hiện đại

.. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU PHÂN TÍ CH CẤU TRÚC DẪN XUẤT DIBENZOAZA-17-CROWN-5-ETHER BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ HIỆN ĐẠI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU PHÂN TÍ CH CẤU TRÚC DẪN XUẤT DIBENZOAZA-17-CROWN-5-ETHER BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ HIỆN ĐẠI Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60 44 01 18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. TRƯƠNG HỒNG HIẾU 2. PGS.TS LÊ TUẤN ANH THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. TRƯƠNG HỒNG HIẾU - Trung tâm Nhiệt đới Việt- Nga, PGS.TS LÊ TUẤN ANH Khoa Hóa Học - Trường Đại khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội. Người trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo Khoa Hóa học, các thầy cô phòng Đào tạo, các thầy cô trong Ban Giám hiệu trường Đại học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, ủng hộ và động viên em trong những lúc gặp phải khó khăn để em có thể hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, song do thời gian có hạn, khả năng nghiên cứu của bản thân còn hạn chế, nên kết quả nghiên cứu có thể còn nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của các thầy giáo, cô giáo, các bạn đồng nghiệp và những người đang quan tâm đến vấn đề đã trình bày trong luận văn, để luận văn được hoàn thiện hơn. Em xin trân trọng cảm ơn! Tác giả luận văn Hoàng Thị Nhung ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i MỤC LỤC ......................................................................................................... ii BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ............................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ vi MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. Một số phương pháp phân tích hóa lý hiện đại .......................................... 3 1.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ (HPLC-MS)......... 3 1.1.2. Phương pháp nhiễu xạ đơn tinh thể (Single-crystal X-ray Diffraction) ........... 9 1.1.3. Sơ lược về phổ cộng hưởng từ hạt nhân ............................................... 12 1.2. Các hợp chất piridinoazacrown ether ....................................................... 18 1.2.1. Các phương pháp chung tổng hợp (pyrido)azacrown ether .................. 20 1.2.2. Tổng hợp pyridinocrown ether bằng phương pháp ngưng tụ đa tác nhân ..... 24 Chương 2. THỰC NGHIỆM ........................................................................ 25 2.1. Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị ............................................... 25 2.1.1. Các phương pháp chuẩn bị mẫu chất phân tích .................................... 25 2.1.2. Dụng cụ và hóa chất .............................................................................. 25 2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng ............................................................................................... 25 2.1.4. Các phương pháp phân tích cấu trúc ..................................................... 26 2.2. Chuẩn bị tiền chất 1,8-bis(2-acetylphenoxy)-3,6-dioxaoctane (3) .......... 27 2.3. Chuẩn bị mẫu chất nghiên cứu bis-(benzo)(γ-arylpyridino)aza-17crown-5 ethers (5 a-d) ..................................................................................... 27 2.4. Phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C của các chất: ................................................................. 28 iii Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 33 3.1. Chuẩn bị dẫn xuất 1,8-bis(2-acetylphenoxy)-3,6-dioxaocthane .............. 33 3.2. Chuẩn bị hợp chất mẫu (γ-arylpyridino)dibenzoaza-17-crown-5ether (5a-d) ...................................................................................................... 35 3.3. Phân tích và xác định cấu trúc bằng các phương pháp hóa lý ................. 35 KẾT LUẬN .................................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 46 PHỤ LỤC iv BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AcOH : Acid acetic APCI : Atmospheric Pressure Chemical Ionization APPI : Atmospheric Pressure Photoionization COSY : Correlated Spectroscopy ESI : Electrospray Ionization HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence HPLC : High-performance liquid chromatography HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation Me : methyl NH4Oac : ammonium acetat NMR : Nuclear magnetic resonance v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Các hằng số vật lý các sản phẩm thu được (5a-d) .......................... 41 Bảng 3.2. Độ chuyển dịch hóa học trên phổ 1H-NMR của các hợp chất (5a-d) .. 42 Bảng 3.3. Độ dài và góc liên kết hydro của hợp chất (5a) [Å and o] .............. 44 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy HPLC-MS ............................ 3 Hình 1.2. Kỹ thuật ion hóa ESI ...................................................................... 6 Hình 1.3. Cặp tín hiệu Fiedel........................................................................ 10 Hình 1.4. Sơ đồ tóm tắ t quá trình phân tích cấ u trúc bằ ng phương pháp X-Ray (nguồn internet) ........................................................ 10 Hình 1.5. Cấu tạo phân tử được xây dựng trên cơ sở dữ liệu nhiễu xạ đơn tinh thể X-ray......................................................................... 11 Hình 1.6. Hạt nhân nguyên tử tự quay quanh trục của nó và mang điện tích dương ..................................................................................... 12 Hình 1.7. Định hướng của hạt nhân trước và sau khi đặt vào từ trường B0 ...... 13 Hình 1.8. Chênh lệch mức năng lượng giữa hai định hướng hạt nhân (1H, 13C) ........................................................................................ 13 Hình 1.9. Máy cộng hưởng từ hạt nhân. ....................................................... 14 Hình 1.10. Ví dụ phổ CHTHN - 1H NMR, 500MHz, dung môi CDCl3 ........ 15 Hình 1.11. Tương tác spin - spin và số bội đỉnh ............................................ 16 Hình 1.12. Ví dụ về phổ HSQC...................................................................... 17 Hình 1.13. Ví dụ về phổ HMBC..................................................................... 18 Hình 3.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của hợp chất (5a) ............ 36 Hình 3.2. Phổ dãn 1H-NMR - tín hiệu cộng hưởng khu vực polyether của chất (5a).................................................................................. 37 Hình 3.3. Phổ dãn 1H-NMR - tín hiệu cộng hưởng khu vực vòng pyridine ..... 38 Hình 3.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HMBC. ........................... 39 Hình 3.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC ............................. 39 Hình 3.6. Tương tác giữa các proton và nguyên tử cacbon. ........................ 40 Hình 3.7. Phổ HRLC-MS hợp chất azacrown ether (5a) ................................ 41 Hình 3.8. Cấu trúc phân tử (5a) .................................................................... 43 Hình 3.9. Phân bố trong mạng tinh thể (5a). Các liên kết hydro nội phân tử C─H•••O và giữa các phân tử C─H•••N và C─H•••O ................ 43 1 MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển của hóa học hiện đại, vai trò của các phương pháp phân tích hóa lý ngày càng được nâng cao và có vị trí quan trọng trong việc phân tích xác định độ tinh khiết của sản phẩm, xác định công thức cấu tạo và các đặc trưng cấu trúc phân tử, ... Các dữ liệu phân tích thu được có ý nghĩa rất quan trọng trong hóa học vật liệu mới (ảnh hưởng cấu trúc và độ bền vật liệu, chính xác tỷ lệ cấu thành vật liệu, ...); trong tổng hợp hóa dược và phát triển thuốc (xác định và phân lập chính xác đồng phân lập thể có hoạt tính sinh học, giảm tác dụng phụ không mong muốn của thuốc khi có chứa hỗ hợp đồng phân lập thể, ...). Chính vì vậy, ngày nay, các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại không chỉ có ứng dụng thực tiễn trong mọi ngành nghề sản xuất (hóa chất bảo vệ nông nghiệp, thuốc thú y, công nghiệp vật liệu mới, hóa chất tẩy rửa, vật liệu sơn phủ bề mặt, phẩm nhuộm...), mà còn là công cụ không thể thiếu trong các ngành khoa học kỹ thuật, nghiên cứu công nghệ (hóa học môi trường, hóa sinh, y dược, vật liệu mới, ...). Từ cuối những năm 80 của thế kỷ 20, với sự ra đời và phát triển mạnh mẽ của hóa học tổ hợp - lĩnh vực tổng hợp hóa dược được hình thành trên cơ sở các phản ứng đa tác nhân, kết hợp với kỹ thuật máy tính - đã góp phần xây dựng các cơ sở dữ liệu hoạt chất và các loại thuốc hóa dược tiềm năng. Việc xác định cấu tạo của hoạt chất và độ tinh khiết của sản phẩm không thể thiếu được các kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân hiện đại (1HNMR, 13 CNMR, HMBC, HSQC, COSY - NOESY, ...); các kỹ thuật sắc ký (lỏng, khí) hiệu năng cao kết hợp khối phổ; kỹ thuật phân tích nhiễu xạ đơn tinh thể, ... Các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại với sự kết hợp của công nghệ thông tin đã giúp quá trình tổng hợp và xác định hoạt tính sinh học của các hợp chất mới trở nên đơn giản và dễ dàng hơn, nhanh chóng đưa các hoạt chất tiềm năng vào thử nghiệp lâm sàng và phát triển thành các loại thuốc mới. 2 Với ý nghĩa và tầm quan trọng của các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại, chúng tôi đã lựa chọn đề tài giới thiệu tổng quan lý thuyết, cũng như ứng dụng một số phương pháp phổ hiện đại, đang được ứng dụng rộng dãi trong tổng hợp hóa dược, nhằm phân tích cấu trúc và xác định độ tinh khiết của một số hợp chất mới tổng hợp được. Đề tài cũng trình bày ứng dụng phương pháp tổng hợp đa tác nhân trong điều chế các hợp chất (γarylpyridino)dibenzoaza-17-crown-5-ether mới. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Một số phương pháp phân tích hóa lý hiện đại 1.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ (HPLC-MS) Thiết bị thực nghiệm phân tích xác định khối lượng các chất nghiên cứu trong luận văn này là LTQ Orbitrap XL hoạt động theo cơ chế HPLC-MS/MS, với detector khối phổ (MS). Máy có hệ thống 4 kênh dung môi; mẫu sau khi được tách trong hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sẽ đi qua một ống dẫn đến đầu dò MS. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu APCI hoặc ESI. Ion sinh ra được tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion để đưa vào bộ phân tích khối. Trong bộ phân tích khối lượng này, ion sẽ bị bẫy trong những quĩ đạo được ổn định bởi một điện trường thay đổi theo thời gian (time varying electric field). Tùy theo hiệu điện thế âm hay dương áp vào những thấu kính (lens) trong nguồn API và hệ quang học ion mà xác định những ion mang điện tích dương hoặc âm sẽ được dẫn tới bộ phân tích khối. Ion cần phân tích sẽ có một tỉ lệ m/z xác định, nhờ đó chúng được tách chọn lọc ra khỏi bộ phân tích khối và tạo một tín hiệu đặc trưng tại hệ thống phát hiện ion. Với khối phổ thu được có thể định danh chính xác hợp chất nghiên cứu và kết hợp với pic tương ứng trên sắc ký đồ (LC) để định lượng và định tính hợp chất đó (Hình 1). Hình 1.1. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy HPLC-MS 4 Đầu dò khối phổ (Detector MS) Như đã trình bày, phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó. Như vậy, trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn. Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thường độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ. Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuâ ̣t sắ c ký lỏng ghép khố i phổ phải đố i mặt với rất nhiề u khó khăn trong việc tìm cách giải quyế t được sự tương thích giữa hê ̣ thống sắ c ký lỏng và đầ u dò khố i phổ . Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức đô ̣ chân không cao, nhiêṭ đô ̣ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tố c dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt đô ̣ng ở áp suất cao với mô ̣t lươ ̣ng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đố i thấ p, các chấ t phân tích ở thể lỏng. Để khắ c phu ̣c những khó khăn trên, đã phát triển rất nhiều kỹ thuật xử lý trong đó phải kể đến, kỹ thuâ ̣t ion hóa ta ̣i áp suấ t khí quyể n (Atmospheric Pressure Ionization - API). Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành 5 ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử được gia tốc với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray - TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích. Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: * Ion hoá tia điện (Electrospray Ionization - ESI) là một kỹ thuật ion hóa được ứng dụng cho những hợp chất không bền nhiệt, phân cực, có khối lượng phân tử lớn. ESI có khả năng tạo thành những ion đa điện tích (dương hoă ̣c âm, tùy thuộc vào áp cực điện thế ), đươ ̣c xem là kỹ thuâ ̣t ion hóa êm diụ hơn APCI, thích hợp cho phân tích các hợp chất sinh học như protein, peptide, nucleotide… hoặc các polyme công nghiệp như polyethylen glycol. Đươ ̣c bắ t nguồn từ hê ̣ thống sắc ký lỏng, ta ̣i đầ u ố ng dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang tích điện tại bề mặt. Khí ở xung quanh các gio ̣t này ta ̣o nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương, khi đó, mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương gia tăng. Mật độ điện tích này tăng đến một điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh) để từ đó hạt sương phân chia thành những hạt nhỏ hơn vì lực đẩy lúc này lớn hơn sức căng bề mặt. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích cao này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí bởi lực đẩy tĩnh điện rồi sau đó đi vào bộ phân tích khối. Trong kỹ thuật ESI, phân tử nhất thiết phải đươ ̣c biế n thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương. Điề u này phu ̣ thuô ̣c vào: dung môi sử du ̣ng, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch. Các dung môi phù hơ ̣p để phun sương là: methanol, acetonitrile, ethanol… 6 Hình 1.2. Kỹ thuật ion hóa ESI * Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization - APCI) là kỹ thuâ ̣t ion hóa thường được sử dụng để phân tích những hợp chất có độ phân cực trung bình, có phân tử lượng nhỏ, dễ bay hơi. Trong APCI, ion đươc hình thành như sau: mẫu hợp chất cần phân tích, hòa tan trong pha động, sau khi ra khỏi cột sắ c ký, được cho đi ngang qua ố ng mao quản đốt nóng. Khi ra khỏi ống, nhờ khí N2, dung dịch được phun thành dạng sương từ đầu ra của nguồn APCI. Các giọt sương nhỏ được mô ̣t dòng khí dẫn đến mô ̣t ố ng thạch anh đun nóng, gọi là buồ ng dung môi hóa khí. Hợp chất đi theo luồ ng khí nóng ra khỏi ố ng để đế n một vùng có áp suấ t khí quyể n, nơi đây sẽ xảy ra sự ion hóa hóa học nhờ vào que phóng điê ̣n corona, ta ̣i đây có sự trao đổ i proton để biế n thành ion dương (M+H)+ và trao đổi electron hoă ̣c proton để biến thành ion âm (M-H)-. Sau đó, các ion sẽ được đưa vào bô ̣ phân tích khố i. * Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photoionization - APPI). Thông thường, hợp chấ t phân tích thường ion hóa bằng nguồn ESI hoă ̣c APCI, tuy nhiên, có mô ̣t số chấ t không đươ ̣c ion hóa tố t bằ ng hai kỹ thuâ ̣t này, ví du ̣ như polyaromatic hydrocarbons (PAHs), người ta sẽ sử du ̣ng nguồn APPI. Kế t hơ ̣p ưu điể m của giữa dòng khí phun thẳ ng góc với dòng ion, đèn krypton trong nguồn sẽ phát ra các photon có năng lươ ̣ng cao đủ để ion hóa nhiều hơ ̣p chấ t hóa ho ̣c khác nhau. 7 Ngoài ba nguồn ion hóa trên, còn có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode ionization) có thể vâ ̣n hành, thao tác ở hai chế độ ion hóa ESI và APCI. Trong các kỹ thuật trên, kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiềuhơn cả. Hiện nay, có các kiểu đầu dò khối phổ chính như sau - Đầu dò khối phổ bẫy ion (Ion Trap - IT) - Đầu dò khố i phổ cộng hưởng cyclotron sử du ̣ng phép biến đổi Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, FTICR hay FT-MS). - Đầu dò khối phổ thời gian bay (Time of Flight - TOF) - Đầu dò khối phổ tứ cực (Quadrupole) Chúng rất khác nhau về thiết kế và thao tác, với những ưu và nhươ ̣c điể m riêng. Đối với loại bẫy ion, các ion trước hết được bắt hoặc “bẫy” trong một khoảng thời gian nhất định rồi được phân tích bằng MS hoặc MS/MS. Loại máy này được sử dụng khá rộng rãi (xét theo những công bố khoa học). Tuy nhiên, chúng có độ chính xác không cao do chỉ có một số lượng khá hạn chế các ion có thể tích lũy vào tâm điểm trước khi được tích điện trong không gian, do vậy có thể phản ánh sai lệch sự phân bố và phép đo. Người ta cũng đã tiến hành cải tiến kỹ thuật trên bằng sự phát triển các bẫy ion “tuyến tính” hoặc “hai chiều” khi những ion được tập hợp trong một thể tích hình ống lớn hơn bẫy ion ba chiều truyền thống, cho phép làm tăng độ nhạy, độ phân giải và độ chính xác. Đầu dò FT-MS bản chất cũng là một loại khối phổ bẫy ion, cho phép bắt những ion dưới độ chân không sâu trong một từ trường cao. Do được cải tiến và kết hợp cả hai loại máy nên FT-MS có độ nhạy, độ chính xác và phân giải cao. Tuy nhiên, do vận hành phức tạp và giá thành quá cao nên chúng ít được sử dụng trong phân tích dư lươ ̣ng. 8 Đối với đầ u dò khố i phổ thời gian bay, tấ t cả các ion đơn điê ̣n tích nào chịu một sai biệt về thế năng V sẽ đa ̣t mô ̣t năng lươ ̣ng chuyể n hóa eV (electron volt) như nhau. Vì vâ ̣y, những ion có khố i lượng lớn hơn sẽ có vâ ̣n tố c nhỏ hơn nên mấ t nhiề u thời gian hơn để bay qua cùng một quañ g đường dài trong một ố ng không có từ trường (field-free flight tube). Các ion, sau khi đươ ̣c tăng tốc, bay ngang qua vùng không trường, nơi đây chúng sẽ đươ ̣c tách riêng nhau ra tùy theo giá tri ̣m/z của chúng, và đươ ̣c tâ ̣p trung ta ̣i bô ̣ phâ ̣n thu nhâ ̣n tín hiệu. Do thời gian đến đích của các ion chỉ cách nhau rất ngắ n, 10-7 giây, nên máy cần có hệ thống điện tử cực nha ̣y để có thể phân biêṭ đươ ̣c các ion. Đầu dò tứ cực (mô ̣t hoă ̣c ba tứ cực) có đô ̣ nha ̣y cao trong phân tích định lượng một chấ t đã biết, ta ̣o đươ ̣c nhiề u phân mảnh trong chế đô ̣ MS/MS, có thể làm đươ ̣c kiể u đo mất phân tử trung hòa (neutral loss), thích hơ ̣p cho phân tích vi lươ ̣ng các chấ t đã biế t trước cấ u trúc. Tuy nhiên, đầ u dò tứ cực khó giải thích cơ chế phân mảnh MS/MS. Tùy theo mục đích, các nhà nghiên cứu sẽ chọn các kỹ thuật ứng với các máy khối phổ thích hợp. Ngoài ra, để phát huy những ưu điể m cũng như khắ c phu ̣c các ha ̣n chế của từng loa ̣i đầ u dò, người ta còn ghép nố i kế t hợp các kỹ thuật với nhau, ví dụ như hê ̣ thố ng kết hơ ̣p giữa bẫy ion và tứ cực API QTRAP4000 hay QTRAP5500 của hãng Appliedbiosystems, trong đó, tứ cực thứ ba của hê ̣ ba tứ cực đươ ̣c thay bằ ng bẫy ion [39]. Khí mang trong hệ HPLC thường được lựa chọn là các khí trơ như: He, H2, N2, Ar, Ne, Kr, … Trong đó, khí N2 được sử dụng phổ biến do có ưu điểm: an toàn, giá thành rẻ, dễ dàng làm tinh khiết. Cột phân tách sử dụng trong hệ HPLC - Thông dung nhất là 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản, trong đó, cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 2-4mm và chiều dài 2-3m; cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0.2-0.5µm), cột có đường kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m. Hiện nay, cột mao quản được làm chủ 9 yếu bằng silica nung chảy (SiO2) được phủ bên ngoài một lớp polyimide (là một loại polymer chịu nhiệt nhằm bảo vệ cột); cột mao quản có đường kính trong 0,25 đến 0,75 mm và chiều dài từ 10 đến 100 m.Tùy theo cách thức bố trí pha tĩnh lỏng bên trong cột mà ta có 2 loại cột mao quản hở chính là: a) WCOT (Wall-coated capillary open tubular), cột mao quản hở có thành trong phủ pha tĩnh lỏng, còn gọi là cột mao quản film mỏng. b) SCOT (Support-coated open tubular), cột mao quản hở có thành trong gắn hạt chất mang rắn phủ pha tĩnh lỏng, còn gọi là cột mao quản lớp mỏng). Trong đó cột WCOT có hiệu quả tách tốt nhất với số đĩa lí thuyết từ 1000 đến 4000 đĩa trên 1 m chiều dài cột. Pha tĩnh phổ biến nhất đối với cột WCOT là polysiloxane [(5%-Phenyl)methylpolysiloxane: DB-550% Diphenyl / 50% Dimethylpolysiloxan: DB-608]. 1.1.2. Phương pháp nhiễu xạ đơn tinh thể (Single-crystal X-ray Diffraction) Giới thiệu chung Phương pháp X-ray phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác đinh ̣ cấu trúc phân tử của một hơ ̣p chấ t hữu cơ. Từ phương trình Bragg, người ta tính toán độ dài của các ca ̣nh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lươ ̣ng phân tử (n) xây dựng nên tế bào cơ sở. Phương trình Bragg: 2d.sin(θ) = nλ Thể tích tế bào cơ sở: V = abc(1-cos2α-cos2β-cos2γ+2cosαcosβcosγ)1/2 Số lươ ̣ng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.1023 (d: tỷ tro ̣ng g/cm3). Mặt khác, khi chiế u bức xa ̣ tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kế t sẽ phát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xa ̣ theo hai hướng (h,k,l) và hướng ngươ ̣c la ̣i (-h,-k,-l). Cường độ của tín hiệu Friedel (Fhkl, F-h,-k-l) đươ ̣c tính toán nhờ cường độ của tín hiệu nhiễu xa ̣ (Ihkl) (|Fhkl| = (Ihkl)1/2). Mật độ electron ta ̣i 10 một điể m trong tế bào cơ bản sẽ đươ ̣c tính toán bằ ngcông thức: ρ(x,y,z) = [ ΣhklFhklexp{-2p(hx + ky + lz)}]/V. Hình 1.3. Cặp tín hiệu Fiedel Bằ ng cách đo cường độ của tấ t cả các tín hiệu nhiễu xa ̣ Ihkltheo mặt h,k,l khi đã biết được các thông số cơ bản của tế bào cơ sở theo phương trình Bragg ở trên, người ta sẽ tính toán đươ ̣c mật độ electron tại mo ̣i điể m trong không gian của tế bào cơ sở, từ đó có thể xây dựng đươ ̣c bản đồ mật độ điện tích của phân tử. Từ dữ liệu bản đồ mật độ electron, chương trình máy tính sẽ dựng được cấ u trúc không gian ba chiề u của phân tử. Quá trình xác đinh ̣ cấ u trúc của hợp chấ t hữu cơ bằ ng phương pháp X-ray phân tử có thể đươ ̣c tóm tắ t như sau: Hình 1.4. Sơ đồ tóm tắ t quá trình phân tích cấ u trúc bằ ng phương pháp X-Ray (nguồn internet) b. Xác đinh ̣ cấ u hình tuyệt đố i Phương pháp X-ray tinh thể có khả năng xác đinh ̣ chính xác cấ u hình tuyệt đố i của một phân tử , nế u trong phân tử có nguyên tử có tán xa ̣ tia X 11 bấ t thường. Để xác đinh ̣ cấ u hình tuyệt đố i của phân tử bằ ng phương pháp X-ray tinh thể người ta sử du ̣ng phươ ng pháp của Bijvoet và phương pháp so sánh chỉ số R. Phương pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bấ t đố i khi đươ ̣c chiế u bức xa ̣ tia X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bấ t thường Friedel, lơ ̣i du ̣ng nguyên tắ c này Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấ u với tín hiệu của cặp bức xạ Friedel ở trung tâm bấ t đố i phản xạ theo hướng (h,k,l) và hướng ngược lại (-h,-k,-l), để xác đinh ̣ cấ u hình tuyệt đố i. Phương pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R đươ ̣c xây dựng trên cơ sở hàm thống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồ ng phân đố i quang và được so sánh với các tính toán Bijvoet để xác đinh ̣ kiểu đồ ng phân đố i quang. Nế u giá tri ̣ của chỉ số R có sự sai khác, dù rấ t nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá la ̣i các giá tri này bằ ng phương pháp thố ng kê. ̣ Hình 1.5. Cấu tạo phân tử được xây dựng trên cơ sở dữ liệu nhiễu xạ đơn tinh thể X-ray 12 1.1.3. Sơ lược về phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cơ sở vật lý của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân - Tính chất từ của hạt nhân Theo thuyết cấu tạo nguyên tử, nguyên tử được cấu tạo từ hạt nhân và lớp vỏ điện tử. Giả thiết rằng hạt nhân có dạng hình cầu có điện tích dương và mật độ điện tích phân bố đồng đều trên mặt cầu. Hạt nhân nguyên tử luôn luôn quay quanh trục của nó nên sinh ra momen động lượng hay còn gọi là momen spin hạt nhân P. Khi hạt nhân nguyên tử tự quay quanh trục của nó và vì hạt nhân mang điện tích dương nên chúng sẽ làm xuất hiện dòng điện và khi đó sẽ sinh ra từ trường giống như những thanh nam châm nhỏ (Hình 1.6), vì vậy chúng sẽ tương tác với từ trường bên ngoài. Hình 1.6. Hạt nhân nguyên tử tự quay quanh trục của nó và mang điện tích dương Thực nghiệm cũng chỉ ra rằng, không phải tất cả các hạt nhân đều có từ tính, mà chỉ các hạt nhân có số spin lẻ (1H, 13C, ...) mới có đặc trưng này. Nếu không có sự tác động của từ trường bên ngoài thì các spin hạt nhân của những hạt nhân có từ tính sẽ định hướng theo vô số phương. - Tính chất của hạt nhân trong từ trường ngoài Khi mẫu chất khảo sát có chứa những hạt nhân này được đặt vào giữa hai cực của một nam châm mạnh (từ trường B0), các hạt nhân sẽ bị định hướng theo hướng của nam châm: song song cùng chiều hoặc song song ngược chiều với từ trường của nam châm (Hình 1.7).