Tài liệu Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (panax sp.) phân bố tự nhiên tại lâm đồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM __________________ LÊ NGỌC TRIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP ĐÀ LẠT, 2017 A BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM __________________ LÊ NGỌC TRIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. NGUYỄN VĂN KẾT GS.TSKH. TRẦN DUY QUÝ ĐÀ LẠT, 2017 B LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng để bảo vệ ở bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Đà Lạt, ngày 21 tháng 12 năm 2017 Tác giả luận án Lê Ngọc Triệu i LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận án, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Văn Kết, GS.TSKH. Trần Duy Quý, những ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn, giúp đỡ tận tình để tôi có thể tôi hoàn thành luận án. Xin đƣợc trân trọng cám ơn quý thầy cô thuộc Ban đào tạo sau đại học -Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam, Viện Di truyền Nông nghiệp, Trƣờng Đại học Đà Lạt đã truyền đạt các kiến thức, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, sinh hoạt chuyên môn và thực hiện luận án. Để có đƣợc các kết quả nghiên cứu trong luận án này, tôi xin chân thành cám ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia và đặc biệt là TS. Trần Văn Tiến đã tạo điều kiện cho tôi tham gia, thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền chi sâm (Panax L.) ở Việt Nam”. Xin đƣợc tri ân đến Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên cũng nhƣ các anh em, bạn bè đồng nghiệp gần xa,…..đã chia sẻ, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Sau cùng, từ tận đáy lòng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ tôi, ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng tôi nên ngƣời và vợ tôi đã luôn động viên và chia sẻ để tôi phấn đấu hoàn thành luận án này. Lê Ngọc Triệu ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ...................................................................................................................... i Lời cám ơn ......................................................................................................................... ii Danh mục chữ viết tắt ....................................................................................................... vi Danh mục bảng ................................................................................................................ vii Danh mục hình.................................................................................................................. ix MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................................. 1 2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................................ 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................................... 2 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài ................................................................. 3 5. Những đóng góp mới của luận án ................................................................................. 4 Chƣơng 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 5 1.1. Vai trò của các loại sâm trong đời sống ..................................................................... 5 1.2. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật ................. 7 1.2.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật ............................................................................... 7 1.2.1.1. Các phƣơng pháp dựa trên đặc điểm hình thái ..................................................... 7 1.2.1.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử ........................................................... 8 1.2.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử trong nghiên cứu hệ thống học và quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật ................................................................. 10 1.2.2.1. Các phƣơng pháp xây dựng cây quan hệ phát sinh chủng loại .......................... 11 1.2.2.2. Cơ sở khoa học của việc sử dụng các trình tự DNA bảo thủ cao trong phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ở thực vật .......................................................... 11 1.2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền quần thể ............................................ 14 1.3. Vị trí hệ thống học và phân loại chi Panax, họ Araliaceae ...................................... 16 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới .................................................................................. 16 1.3.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ................................................................................ 22 1.4. Quan hê ̣ phát sinh chi Panax L. dƣ̣a trên hê ̣ thố ng ho ̣c mƣ́c đô ̣ phân tƣ̉ ................. 23 1.4.1. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong chi Panax không dựa vào giải trình tự DNA .......................................................... 25 1.4.1.1. Các nghiên cứu trên thế giới............................................................................... 25 1.4.1.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ............................................................................. 26 iii 1.4.2. Các nghiên cứu dựa trên giải trình tự các vùng DNA bảo thủ .............................. 27 1.4.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới ............................................................................... 27 1.4.2.2. Các nghiên cứu tại Việt Nam ............................................................................. 32 1.4.3. Các nghiên cứu về phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại các taxon trong chi Panax sử dụng DNA fingerprint từ các vùng DNA bảo thủ ............................ 33 1.5. Các nghiên cứu đánh giá đa da ̣ng di truyề n quần thể ở chi Panax .......................... 34 1.6. Nghiên cứu về thành phần hoạt chất ở chi Panax .................................................... 39 1.7. Nhận xét chung ......................................................................................................... 41 Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 33 2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................... 44 2.1.1. Vật liệu cho nghiên cứu vị trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại của sâm Lang Bian và các taxon Panax khác ............................................................... 44 2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian .................... 46 2.1.3. Vật liệu cho nghiên cứu sơ bộ thành phần saponin của sâm Lang Bian ............... 46 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 47 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 47 2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu ............................................................................................ 47 2.3.1.1. Thu thập, xử lý mẫu để nghiên cứu hình thái thực vật học, lƣu trữ và nghiên cứu quan hệ phát sinh chủng loại ................................................................ 50 2.3.1.2. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể ......................... 50 2.3.1.3. Thu thập mẫu nhằm nghiên cứu sơ bộ về thành phần saponin .......................... 51 2.3.2. Nghiên cứu về hình thái nhằm bổ sung dữ liệu cho xác định vị trí phân loại sâm Lang Bian ........................................................................................................ 51 2.3.3. Tách chiết DNA và kiểm tra chất lƣợng, hàm lƣợng DNA trong các mẫu ........... 52 2.3.4. Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự bảo thủ .......................................................................................................................... 52 2.3.4.1. Phân lập và khuếch đại các vùng DNA bảo thủ ................................................. 52 2.3.4.2. Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự DNA bảo thủ cao ........................................................................................................................... 55 2.3.5. Phân tích đa dạng và biến động di truyền trong quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy sinh bằng kỹ thuật ISSR................................................................. 55 2.3.5.1. Sử dụng kỹ thuâ ̣t ISSR để hình thành các DN A fingerprint .............................. 56 2.3.5.2. Phân tích đa dạng và biến động di truyền dựa trên các DNA fingerprint thu nhận đƣợc ................................................................................................................ 57 2.3.6. Sơ bộ phân tích, so sánh thành phần saponin ....................................................... 59 iv Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 61 3.1. Vị trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và một số loài khác cùng chi dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự DNA bảo thủ .............. 61 3.1.1. Vị trí phân loại thực vật của sâm Lang Bian dựa trên đặc điểm hình thái ............ 61 3.1.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên các trình tự bảo thủ .......................................................................................... 66 3.1.2.1. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng gene matK ........................................................................................ 66 3.1.2.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 .................................................. 75 3.1.2.3. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi khác dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA .......................................................... 84 3.1.2.4. Khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại dựa vào việc phối hợp các vùng trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK .................... 90 3.1.3. Vị trí phân loại của sâm Lang Bian dựa trên quan hệ phát sinh chủng loại với các taxon Panax khác ở mức độ phân tử và đặc điểm hình thái ........................... 102 3.2. Đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian.......................................... 104 3.2.1. Kết quả thu thập, chuẩn bị mẫu và chọn lọc mồi phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền quần thể ......................................................................................... 104 3.2.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD ................................................ 110 3.2.3. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR ................................................ 116 3.2.4. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu .......................... 122 3.3. Kết quả nghiên cứu về phân tích, so sánh sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian và một số taxon cùng chi khác ............................................................ 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 132 1. Kết luận...................................................................................................................... 132 2. Kiến nghị ................................................................................................................... 132 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .. 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 135 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHỔ ĐỒ TRÌNH TỰ CÁC VÙNG DNA BẢO TỒN CỦA CÁC TAXON ĐƢỢC THU THẬP TRONG NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC 2: SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG BẢO TỒN GIỮA CÁC TAXON KHẢO SÁT PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐIỆN DI DNA KHUẾCH ĐẠI BẰNG CÁC MỒI ISSR v AFLP: DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amplified Fragment Length Polymorphism CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequence DDBJ: DR: DNA Data Bank of Janan Đam Rông G-Rb1: Ginsenoside Rb1 G-Rd: Ginsenoside Rd G-Re: Ginsenoside Re G-Rg1: Ginsenoside Rg1 He: expected heterozygosity ISSR: Inter Simple Sequence Repeats ITS: Internal transcribed spacer IUCN: International Union for Conservation of Nature LD: Lạc Dƣơng M-R2: Majonoside R2 NCBI: N-R1: National Centre for Biotechnology Information Notoginsenosid R1 PPB: PS: percentage of polymorphic bands Panax stipuleanatus (lá chét nguyên) PSDL: Panax stipuleanatus (lá chét xẻ) PV: Panax vietnamensis PVF: Panax vietnamensis var. fuscidiscus PVL: Panax vietnamensis var. langbianensis RAPD: Random Amplified Polymorphic RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism rRNA: ribosomal RNA SCAR: Sequence Characterized Amplified Region SNP: Single Nucleotide Polymorphism SSR: Simple sequence Repeat - Microsatellites VNTR: Variable Number of Tandem Repeats - Minisatellites vi DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 1.1. Đặc điểm hình thái tƣơng đồng và khác biệt giữa chi Aralia và chi Panax ......... 18 1.2. Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1970-1975 ......................................................... 19 1.3. Phân loại các taxon Panax ở châu Á theo quan điểm của các nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014 ......................................................... 20 1.4. Số lƣợng nhiễm sắc thể theo Yang (1981) ........................................................... 21 2.1. Các mẫu sử dụng để tách chiết DNA cho phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ........................................................................................................................ 44 2.2. Mã truy cập các trình tự 18S rRNA; vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 và một phần gene matK của các mẫu thu thập tại Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại ..................................................... 45 2.3. Các trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8SrRNA-ITS2 và gen matK đƣợc lấy từ Genbank sử dụng trong nghiên cứu phân tích quan hệ phát sinh chủng loại ....... 45 3.1. So sánh đặc điểm hình thái giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus ................................................................................ 62 3.2. Thành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự một phần gene matK ở các taxon đƣợc khảo sát .............................................................................................. 68 3.3. Những vị trí khác biệt ở trình tự một phần gene matK của đối tƣợng nghiên cứu so với các taxon khác cùng chi ...................................................................... 69 3.4. Khoảng cách di truyền giữa các taxon đƣợc khảo sát dựa trên trình tự một phần vùng gene matK ........................................................................................... 70 3.5. Sự khác biệt giữa trình tự gene matK giữa Panax sp., P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus ................................................................................ 72 3.6. So sánh trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các mẫu thuộc taxon Panax vietnamensis từ các nguồn khác nhau................................................................... 77 3.7. Thành phần, số lƣợng nucleotide các trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 khảo sát .......................................................................................................................... 78 3.8. Những vị trí khác biệt ở trình tự ITS1-5,8S rRNA-ITS2 của đối tƣợng nghiên cứu so với các taxon cùng chi ................................................................... 79 3.9. Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dự trên trình tự vùng ITS1– 5,8SrRNA–ITS2 ................................................................................................... 81 3.10. Sai khác giữa sâm Lang Bian với Panax vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus dựa trên trình tự vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 ............................ 84 vii 3.11. Phành phần và số lƣợng nucleotide các trình tự vùng 18S rRNA ở các taxon đƣợc khảo sát ........................................................................................................ 86 3.12. Các vị trí khác biệt giữa các taxon Panax khảo sát dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA ..................................................................................................... 87 3.13. Khoảng cách di truyền giữa các taxon khảo sát dựa trên trình tự 18S rRNA ...... 88 3.14. Đặc điểm thành phần và số lƣợng nucleotide của các trình tự phối hợp ở các taxon khảo sát ....................................................................................................... 94 3.15. Khoảng cách di truyền giữa các taxon Panax đƣợc khảo sát dựa trên sự phối hợp ba trình tự DNA bảo thủ 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK .................................................................................................... 95 3.16. Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể LD ................... 105 3.17. Ký hiệu, độ tuổi và phân nhóm tuổi các cá thể thuộc quần thể DR ................... 106 3.18. Đặc điểm các mồi ISSR đƣợc chọn lọc và sử dụng để làm nảy sinh DNA fingerprint làm cơ sở đánh giá đa dạng di truyền ............................................... 107 3.19. Tỷ lệ band đa hình ở mức độ tổng thể mẫu nghiên cứu, quần thể và các nhóm tuổi trong quần thể .................................................................................... 109 3.20. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể LD ....................................................................................................................... 111 3.21. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể LD ....................................................................................................................... 112 3.22. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở quần thể LD ........................................................................................................ 113 3.23. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi lớn ở quần thể DR ....................................................................................................................... 117 3.24. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các mẫu thuộc nhóm tuổi nhỏ ở quần thể DR ....................................................................................................................... 118 3.25. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ hai nhóm tuổi lớn và nhỏ ở quần thể DR ........................................................................................................ 119 3.26a. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi lớn thuộc quần thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR............................................................ 123 3.26b. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các cặp mẫu từ nhóm tuổi nhỏ thuộc quần thể LD và tất cả mẫu thuộc quần thể DR ............................................................ 124 3.27. Thành phần saponin theo chất chuẩn của các mẫu khảo sát............................... 130 viii DANH MỤC HÌNH TT Tên hình Trang 1.1. Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Wen và cộng sự (1996) ................................................................................................................. 28 1.2. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên phối hợp trình tự gene trnK và gene 18S rRNA theo Komatsu và cộng sự (2003) ................................................. 32 2.1. Bản đồ địa hình điều tra thu thập mẫu đối với sâm Lang Bian ............................... 48 2.2. Bản đồ không ảnh tổng thể khu vực phân bố sâm Lang Bian ................................. 49 3.1. So sánh hình thái giữa sâm Lang Bian, Panax vietnamensis và Panax vietnamensis var. fuscidiscus .................................................................................. 63 3.2. Hình vẽ mô tả đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian ..................................... 64 3.3. Ảnh chụp đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian............................................. 65 3.4. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự một phần gene matK ............................ 66 3.5. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 71 3.6. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 71 3.7. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood sử dụng 5 chuẩn ngoại ............................................................................................................. 73 3.8. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining sử dụng 5 chuẩn ngoại........................................................................................................................ 73 3.9. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood sử dụng 8 chuẩn ngoại ............................................................................................................. 74 3.10 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining sử dụng 8 chuẩn ngoại........................................................................................................................ 75 3.11 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 ................... 76 3.12. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ............. 82 3.13 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining............................ 82 3.14. Cây quan hệ phát sinh chủng loại giữa các taxon Panax theo Yang và cộng sự (2001) ................................................................................................................. 83 ix 3.15 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự 18S rRNA............................................. 85 3.16 Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 89 3.17. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 89 3.18. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ........................... 96 3.19. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining .................................. 97 3.20. A. Mẫu tiêu bản Panax bipinnatifidus; B. Mẫu Lectotype của P. bipinnatifidus; C. Mẫu P. stipuleanatus ở Lai Châu, Việt Nam ; D. Mẫu P. bipinnatifidus ở Lai Châu, Việt Nam...................................................................... 99 3.21. Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood ................... 100 3.22. Cây quan hệ phát sinh chủng loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rDNA, vùng ITS1-5,8S rDNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Neiborgh joining.......................... 101 3.23. Cây quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum parsimony ................................... 101 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 844A ở quần thể LD .................... 107 3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR UBC873 ở quần thể LD ............... 108 3.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR 814 ở quần thể DR ....................... 108 3.27. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR HB12 ở quần thể DR ................... 108 3.28. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể LD ............ 115 3.29. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể thuộc quần thể DR ............ 121 3.30. Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể trong tổng thể nghiên cứu......................................................................................................................... 126 3.31. Sơ đồ dạng cây vềquan hệ di truyền các cá thể thuộc hai nhóm lá chét nguyên và lá chét xẻ loài P. stipuleanatus theo Trieu và cộng sự (2016) ......................... 127 3.32. Sắc đồ sắc ký lớp mỏng saponin của các taxon đƣợc khảo sát và các chất chuẩn ..................................................................................................................... 129 x MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chi sâm (Panax L.) thuộc ho ̣ Araliaceae là một chi thực vật làm thuốc quan trọng và kinh điển trong Đông dƣợc cũng nhƣ trong y học hiện đại. Panax ginseng là một trong số các loài thuộc chi sâm đã góp phần đƣa Hàn Quốc trở nên nổi tiếng khắp thế giới về dƣợc liệu . Hiê ̣n nay trên thế giới đã phát hiê ̣n đƣơ ̣c nhiề u loài sâm nhƣ : Panax ginseng C.A.Mey., P. japonicus (T.Nees) Mey., P. quinquefolius L., P. notoginseng (Burkill) F.H.Chen, P. zingiberensis C.Y.Wu & Feng, P. vietnamensis Ha et Grushv., P. pseudoginseng Wall., P. stipuleanatus Tsai & Feng, P. trifolius L.…, phân bố ở Đông Á, vùng Himalaya, Indochina và Bắ c Mỹ . Do có giá trị làm thuốc cao nên nhiều loài sâm đã bị khai thác quá mức dẫn đến cạn kiệt trong tự nhiên. Các quốc gia trên thế giới có phân bố tự nhiên của các loài thuộc chi này nhƣ Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung Quốc… đều đã đƣa ra các chƣơng trình bảo tồn, phát triển và hạn chế khai thác tự nhiên để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này. Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên nhiều phƣơng diện về các loài thuộc chi Panax đã đƣợc tiế n hành tƣ̀ khá lâu , đă ̣c biê ̣t là loài P. vietnamensis vốn là đă ̣c hƣ̃u của Viê ̣t Nam và đế n nay đã trở thành cây thuốc trọng điểm quốc gia và đã đƣợc đầu tƣ nhiều tiền của, công sức để bảo tồn, phát triển. Kết quả từ các nghiên cứu gần nhất về thành phần loài và phân loại chi Panax đã chỉ ra rằng hiện nay ở Việt Nam có 3 loài: P. vietnamensis Ha và Grushv., P. bipinnatifidus Seem., P. stipuleanatus Tsai & Feng và một thứ là P. vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai là các taxon có phân bố tự nhiên và đang trong tình trạng nguy cấp theo tiêu chuẩn IUCN. Loài đầu tiên đƣợc Phạm Hoàng Hộ ghi nhận năm 1970 ở miền Nam Việt Nam là Panax schingseng Nees var. japonicum Mak.. Theo tác giả, loài này mọc dƣới tán rừng râ ̣m lá rô ̣ng, thƣờng xanh, ẩm ở vùng núi Lang Bian, tỉnh Lâm Đồng. Trong các công trình xuất bản sau đó về thành phần loài thực vật Việt Nam, tác giả này vẫn luôn ghi nhận về sự tồn tại của taxon này nhƣng dƣới tên khoa học khác là P. japonica (Nees) Mayer. Tuy vậy, trong những tài liệu gần nhất về thành phần loài chi Panax ở Việt Nam, taxon do Phạm Hoàng Hộ ghi nhận có phân bố ở vùng Lạc Dƣơng, Lâm Đồng không đƣợc nhắc đến, thay vào đó, một số tài liệu ghi nhận có sự phân bố tự nhiên của P. vietnamensis tại đây. Trong quá triǹ h điề u tra khảo sát khu hê ̣ thƣ̣c vâ ̣t ta ̣i vùng núi Lang Bian, huyện Lạc Dƣơng, tỉnh Lâm Đồ ng vào tháng 10 năm 2010, nơi mà Phạm Hoàng Hộ đã ghi nhận có sự phân bố của một taxon Panax từ năm 1970, chúng tôi đã phát hiê ̣n mô ̣t 1 quầ n thể sâm nhỏ thuô ̣c chi Panax mọc tự nhiên. Qua nghiên cứu về hình thái thân rễ, lá, hoa, quả ban đầ u cho thấ y các cá thể thuô ̣c quầ n thể có sự khác biệt về cấu trúc cơ quan dinh dƣỡng và sinh sản so với các taxon thuộc chi Panax khác. Do mới đƣợc tái phát hiện và rất thiếu các dữ liệu khoa học liên quan đến taxon này, trƣớc mắt cần phải có các nghiên cứu chuyên sâu về phân tử và sơ bộ về thành phần saponin để xác định rõ vị trí phân loại trong hệ thống phát sinh chi Panax và bƣớc đầu tìm hiểu khả năng làm thuốc của taxon này. Bên cạnh đó, do khu phân bố của quần thể sâm mới tái phát hiện rất hẹp, số lƣợng cá thể ít nên cần thông tin về tính đa dạng và biến động di truyền làm cơ sở cho việc bảo tồn và phát triển. Để có thêm cơ sở khoa ho ̣c cho viê ̣c phân loa ̣i , khẳ ng đinh ̣ nguồ n tài nguyên quý hiế m vừa phát hi ện nói trên của Viê ̣t Nam đố i với thế giới cũng nhƣ bảo tồ n và phát triể n chúng phu ̣c vu ̣ cho công tác nghiên cứu và sử dụng về sau , đề tài “Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng” đƣợc tiến hành. 2. Mục tiêu của đề tài Đề tài đƣợc tiến hành hƣớng tới mục tiêu làm sáng tỏ các vấn đề: - Quần thể sâm mới đƣợc phát hiện có các đặc điểm khác biệt về di truyền so với các taxon khác hay không?, quan hệ phát sinh chủng loại của nó đối với các taxon cùng chi khác thế nào?; - Tính đa dạng và biến động di truyền trong quần thể của đối tƣợng này ra sao?; - Taxon mới phát hiện này có chứa các saponin chính nhƣ một số taxon thuộc chi Panax hay không? và dựa trên các dƣợc chất này, có sự khác biệt giữa taxon khảo sát so với các taxon cùng chi khác không?. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả đề tài minh chứng cho sự tồn tại thực tế của một taxon thuộc chi Panax, họ Araliaceae tại vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng vốn đã gây nhiều tranh luận do một thời gian dài không tìm thấy mẫu vật, chỉ ra sự mở rộng phân bố của chi Panax trên thế giới về phía Nam. Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học để công bố, bổ sung vào Danh lục thực vật, Sách đỏ Việt Nam một taxon mới, đặc hữu và góp phần làm rõ về thành phần loài của chi Panax ở Việt Nam. Việc xây dựng cơ sở dữ liệu DNA bảo thủ cho các giống/loài, đăng ký ở ngân hàng gene thế giới là việc làm cần thiết để khẳng định chủ quyền quốc 2 gia về tài nguyên thực vật, đặc biệt là đối với nguồn tài nguyên đặc hữu, quý hiếm mới phát hiện lại nói trên. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả đánh giá đa dạng và biến động di truyền trong quần thể thực vật cho phép nhận thức rõ hơn về tình trạng các quần thể cũng nhƣ tổng thể taxon Panax phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng, tạo cơ sở cho việc đề xuất phƣơng án bảo tồn và phát triển trong tƣơng lai. Bên cạnh đó, các dữ liệu sơ bộ về thành phần saponin là cơ sở ban đầu cho việc xem xét giá trị làm thuốc taxon này. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu Trong nghiên cứu vị trí phân loại của taxon Panax phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng, đối tƣợng nghiên cứu là bản thân taxon thực vật này (Panax sp., đƣợc gọi là sâm Lang Bian), các taxon Panax khác phân bố tại Việt Nam và trên thế giới. Trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể, đối tƣợng nghiên cứu là tập hợp các cá thể thuộc hai quần thể sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng. Trong nghiên cứu về phân tích sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian, đối tƣợng nghiên cứu là thân rễ và rễ củ của các taxon thuộc chi Panax có phân bố tại Việt Nam. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi chuyên môn: Với hai nội dung chính của đề tài là nghiên cứu vị trí phân loại và đa dạng di truyền quần thể, sơ bộ phân tích hoạt chất đối với sâm Lang Bian, phạm vi nghiên cứu chuyên môn của luận án là: (1) Xác định vị trí phân loại dựa phƣơng pháp phân loại thực vật kinh điển dựa trên hình thái giải phẫu; (2) Xác định vị trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên dữ liệu trình tự DNA bảo thủ trong nhân và lạp thể; (3) Đánh giá đa dạng di truyền quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy sinh thông qua kỹ thuật ISSR và (4) Sơ bộ phân tích hoạt chất của sâm Lang Bian dựa trên phƣơng pháp phân tích hóa học kinh điển. Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu điều tra, phân loại và thu thập mẫu thực địa đƣợc tiến hành ở các vùng có phân bố các taxon thuộc chi Panax tại Việt Nam, tập trung vào khu vực phát hiện quần thể sâm Lang Bian phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng và các khu vực lân cận. 3 Nghiên cứu về phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên sinh học phân tử cũng nhƣ đa dạng di truyền quần thể đƣợc thực hiện tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Trung tâm Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong công nghiệp, trƣờng Đại học Đà Lạt. Nghiên cứu về hình thái giải phẫu, phân loại thực vật truyền thống và sơ bộ về thành phần saponin đƣợc thực hiện chủ yếu tại Bảo tàng thực vật Trƣờng Đại học Đà Lạt (DLU), Bảo tàng thực vật (VTN) và Phòng thí nghiệm hóa hợp chất thiên nhiên Viện Nghiên cứu khoa học Tây nguyên. Việc so sánh mẫu vật cũng đƣợc tiến hành tại một số bảo tàng, phòng lƣu trữ tiêu bản thực vật trong và ngoài nƣớc. Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu đƣợc tiến hành từ năm 2012 đến năm 2016. 5. Những đóng góp mới của luận án Chứng minh sự tồn tại thực tế của một taxon thuộc chi Panax, họ Araliaceae tại vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng, chỉ ra sự mở rộng phân bố của chi Panax trên thế giới về phía Nam. Tạo cơ sở khoa học để công bố, bổ sung vào Danh lục thực vật, danh lục cây thuốc và Sách đỏ Việt Nam một taxon mới đặc hữu. Góp phần làm rõ về thành phần loài của chi Panax ở Việt Nam. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA cho một chủng loại sâm mới, đăng ký ở ngân hàng gene thế giới để khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn tài nguyên này. Xây dựng cơ sở khoa học cho việc hình thành chiến lƣợc bảo tồn nguồn tài nguyên thực vật đặc hữu, quý hiếm thông qua kết quả đánh giá về điều tra phân bố, nghiên cứu đa dạng và biến động di truyền trong quần thể. 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vai trò của các loại sâm trong đời sống Sâm (Ginseng) đƣợc hiểu là bất kỳ loài nào trong số các loài cây thảo lƣu niên có củ nạc sinh trƣởng chậm thuộc chi Panax, họ Araliaceae. Các loài sâm đƣợc đặc trƣng bởi khả năng làm thuốc nhờ có chứa các loại ginsenoside. Ginsenoside hay còn gọi là panaxoside có bản chất là steroid glycoside và triterpene saponin vốn có nhiều hoạt tính sinh học và giá trị làm thuốc cao. Lịch sử sử dụng sâm bắt đầu từ 4.500 năm trƣớc và tài liệu ghi nhận về sâm sớm nhất đƣợc biết đã có từ 2.000 năm trƣớc. Về giá trị kinh tế, các loại sâm là những nguồn cây thuốc có giá trị kinh tế rất cao đối với nhân loại, đƣợc mua bán tại trên 35 quốc gia với kim ngạch đạt đến 2,1 tỷ USD vào năm 2013 và khoảng một nửa trong số đó là từ Hàn Quốc. Trong nhiều năm lịch sử, Triều Tiên – Hàn Quốc là các quốc gia cung cấp lớn nhất và Trung quốc là quốc gia tiêu thụ sâm lớn nhất thế giới (Baeg và So, 2013). Giá trị của các loại sâm rất khác nhau tùy vào loài, xuất xứ, độ tuổi, có nguồn gốc trồng hay từ tự nhiên. Theo ghi nhận thực tế của chúng tôi trong quá trình điều tra, trong khi giá bán của P. vietnamensis 15-30 triệu đồng/kg tại Kon Tum thì giá bán của P. vietnamensis var. fuscidiscus là 4-6 triệu đồng/kg; của P. stipuleanatus là 3-5 triệu đồng/kg và của P. bipinnatifidus là 2-4 triệu đồng/kg tại Lai Châu. Trong khi giá bán tại Hàn Quốc của P. ginseng (Nhân sâm đỏ) trồng là 250 USD/kg thì giá 1 củ sâm tự nhiên cùng loại là 2.000 – 20.000USD/kg tùy vào tuổi. Chính vì có giá trị kinh tế cao mà nhiều loài thuộc chi Panax đã đƣợc trồng dƣới nhiều hình thức: mô hình vƣờn rừng (Li và cộng sự, 2011; Artyukova và cộng sự, 2004), trồng thuần thâm canh cũng nhƣ đƣợc sản xuất in vitro công nghiệp (Nguyen Trung Thanh và cộng sự, 2014; Grażyna và cộng sự, 2013). Những hoạt động này đã hình thành nên nghề trồng sâm hay các nhà máy sản xuất lớn, tạo việc làm cho nhiều ngƣời (Proctor và cộng sự, 2011). Do có giá trị làm thuốc và giá trị kinh tế lớn mà những quốc gia trên thế giới có sự phân bố tự nhiên của các loài thuộc chi Panax nhƣ Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung Quốc… đều đã đƣa ra các chƣơng trình bảo tồn, phát triển và khai thác đôi khi đến mức nghiêm ngặt để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này (Bai và cộng sự, 1997; Jennifer và Hamrick, 2004; Eidus và Leopold, 2013). Ở nƣớc ta đã có nhiều chƣơng 5 trình, dự án nghiên cứu triển khai để bảo tồn, phát triển tập trung vào đối tƣợng đƣợc xem là đặc hữu của Việt Nam là P. vietnamensis. Hiện nay, Trung tâm Sâm và Dƣợc liệu thành phố Hồ Chí Minh đƣợc xem là một trong những đơn vị đƣợc đầu tƣ để nghiên cứu và phát triển Sâm Ngọc Linh. Gần đây nhất là việc xây dựng Trung tâm quốc gia nghiên cứu phát triển Sâm Ngọc Linh, là hạng mục đầu tiên của Dự án đầu tƣ “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân giống, canh tác, mở rộng sản xuất, xây dựng và phát triển thƣơng hiệu quốc gia cho Sâm Ngọc Linh”, đƣợc thực hiện trên cơ sở thỏa thuận hợp tác giữa Bộ Khoa học và Công nghệ với Ủy ban nhân dân tỉnh Kon Tum và giao cho Cục Phát triển thị trƣờng và Doanh nghiệp - Bộ Khoa học và công nghệ chủ trì thực hiện (http://www.most.gov.vn). Do có giá trị cao mà nhiều loài Nhân sâm bị làm giả, có thể bằng các loài khác cùng chi Panax hay thậm chí những loài có quan hệ phát sinh chủng loại rất xa. Ví dụ, Mirabilis jalapa L. và Phytolacca acinosa Roxb. là hai loài thƣờng đƣợc dùng làm giả cho P. ginseng, P. notoginseng, P. japonicus, P. trifolius và P. mayor (Ngan và cộng sự, 1999); Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) bị làm giả bởi Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var. fuscidiscus), Tam thất hoang (P. stipuleanatus), Sâm Vũ diệp (P. stipuleanatus lá xẻ, từng đƣợc xem là P. bipinnatifidus) để bán tại các vùng Kon Tum, Quảng Nam, Lâm Đồng. Các taxon thuộc chi Panax đã biết đều là các đối tƣợng có giá trị dƣợc dụng cao và đƣợc xem là thần dƣợc cuộc sống bởi khả năng chống các bệnh kinh niên, chống oxy hóa của chúng (Lee và cộng sự, 2016), do vậy đã có hàng loạt các công trình nghiên cứu trên thế giới và cũng nhƣ ở Việt Nam đƣợc tiến hành nhằm thúc đẩy sản xuất, khai thác, sử dụng hiệu quả. Nhiều nhất là các nghiên cứu về thành phần hóa dƣợc và dƣợc lý, tiếp đến là nghiên cứu về nhân giống, canh tác, chế biến, hệ thống học thực vật, đa dạng di truyền, bảo tồn đa dạng nguồn gene… và kết quả là có một số lƣợng lớn các công trình đƣợc công bố trên các tạp chí, sách chuyên khảo và các thông tin trên các phƣơng tiện đại chúng liên quan đến sâm. Nói cách khác, các loại sâm là đối tƣợng thực vật có một sự cuốn hút lớn đối với những ngƣời làm công tác nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực trên toàn thế giới. Những công trình nghiên cứu về sâm vẫn đang đƣợc triển khai cho dù những phát hiện đột phá về mặt thành phần loài gần đây không nhiều. 6 1.2. Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật 1.2.1. Các chỉ thị đặc điểm ở thực vật Cơ sở nền tảng của việc phân loại, xây dựng quan hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền ở sinh vật chính là nghiên cứu sự giống hay khác nhau giữa chúng, sự khác nhau đó có thể nhận biết bằng hình thái hay thông qua các phƣơng pháp sinh học phân tử. Tùy vào các mục đích và hoàn cảnh nghiên cứu cụ thể mà sự tƣơng đồng hay khác nhau của sinh vật đƣợc xem xét ở những mức độ khác nhau về số lƣợng cá thể khảo sát, đặc điểm hình thái ghi nhận hay phƣơng pháp làm nảy sinh DNA fingerprint bao gồm cả các DNA barcode (Duminil và Michele, 2009). 1.2.1.1. Các phƣơng pháp dựa trên đặc điểm hình thái Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật đƣợc sử dụng từ rất sớm. Nguyên tắc cơ bản của phƣơng pháp này là hai đơn vị phân loại (taxon) càng có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon càng gần nhau. Bất cứ sự khác nhau nào giữa hai cá thể đều đƣợc nghiên cứu, nhƣng không phải bất cứ đặc điểm nào cũng có thể dùng làm đặc điểm phân loại. Những đặc điểm phân loại ổn định, biến đổi chậm, liên quan đến những cấu trúc ít biến đổi của cơ thể sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng để phân biệt và xác định các taxon bậc cao, những biến đổi nhanh hoặc liên quan đến cơ chế cách ly sinh sản đƣợc dùng để xác định các taxon bậc thấp. Các nhà nghiên cứu thƣờng kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả so sánh (Pellegrino và cộng sự, 2005). Mặc dù phƣơng pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái có ƣu điểm là tiện lợi, nhanh chóng, kinh tế, có thể so sánh các đặc điểm giữa các loài hoá thạch với các loài đang sống để tìm kiếm mối quan hệ họ hàng giữa chúng, nhƣng việc lựa chọn và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là một trong những khâu khó nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức mà còn đòi hỏi kinh nghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại học. Bên cạnh đó, phƣơng pháp này nhiều khi không chính xác vì có hiện tƣợng đồng quy tính trạng và không phân biệt đƣợc các loài đồng hình (Krishnan và cộng sự, 2011). Mặt khác, bởi hình thái chính là kết quả của biểu hiện gene trong một điều kiện ngoại cảnh nhất định nên việc hoàn toàn dựa vào hình thái đôi khi dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có mức độ thƣờng biến cao. Hơn nữa, các đặc điểm hình thái có nhiều điểm hạn chế nhƣ: các biến đổi hình thái không phát hiện đƣợc ở một số loài; các nghiên cứu sử dụng đặc 7 điểm hình thái nói chung thƣờng giới hạn trong một hay một vài locus trong toàn bộ bộ gene; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát đƣợc vào cuối chu kỳ sống; nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà mang tính liên tục và chồng lấp giữa các sinh vật đƣợc khảo sát gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền của quần thể (Duminil và Michele, 2009). 1.2.1.2. Các phƣơng pháp dựa trên chỉ thị phân tử Chỉ thị (Marker) phân tử đã có những đóng góp lớn vào lĩnh vực nghiên cứu sự đa dạng quần thể thông qua các kỹ thuật làm nảy sinh các DNA fingerprint và phát hiện những biến động di truyền giữa các cá thể, quần thể và loài. Trƣớc đây, khi sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền chƣa phát triển, thì chỉ thị hình thái thƣờng đƣợc sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng này. Trong những thập kỷ qua, việc sử dụng các marker phân tử để phản ánh các đa hình ở mức độ DNA đã đóng vai trò ngày càng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật và đặc biệt là lĩnh vực nghiên cứu di truyền. Có thể chia marker phân tử thành hai loại chính: marker sinh hóa và marker phân tử dựa trên cơ sở DNA. Những marker phân tử dựa trên cơ sở DNA có thể phân biệt thành 2 kiểu, thứ nhất là các marker không dựa trên cơ sở PCR (RFLP) và thứ hai là kiểu marker dựa trên cơ sở PCR (RAPD, AFLP, SSR, ISSR SNP …).. Việc phát triển các kiểu marker mới và đặc trƣng ngày càng đóng vai trò quan trọng trong tìm hiểu về biến động bộ gene cũng nhƣ tính đa dạng di truyền ở các thực vật cùng hay khác loài (Kumar và cộng sự, 2009). Các kiểu khác nhau của marker phân tử đƣợc sử dụng để đánh giá đa hình DNA đƣợc phân thành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ sở phản ứng chuỗi polymer hóa (PCR). Những marker phân tử thƣờng đƣợc sử dụng bao gồm: RFLP, RAPD, AFLP, VNTR, SSR, ISSR, CAPS, SCAR, SNP, Kỹ thuật giải trình tự DNA (Weising và cộng sự, 2005). Giới thiệu về kỹ thuật ISSR ISSR là các đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 100-3000 bp nằm giữa các microsatellite cận kề và ngƣợc hƣớng nhau. Kỹ thuật này do Zietkiewicz và cộng sự báo cáo năm 1994. Các mồi dựa trên trình tự microsatellte đƣợc sử dụng để khuếch đại các trình tự DNA nằm giữa các SSR. ISSR đƣợc khuếch đại bằng PCR sử dụng trình tự lõi microsatellite với vai trò là các mồi cùng với một số nucleotide chọn lọc với vai trò là các neo giữ vào các vùng không lặp cận kề (16-18bp). Khi sử dụng kỹ thuật ISSR, khoảng 10-60 các đoạn DNA từ nhiều locus đƣợc hình thành đồng thời, tách 8