Tài liệu Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng lan huệ (hippeastrum equestre)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Thu Thủy NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ (Hippeastrum equestre) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Thu Thủy NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ (Hippeastrum equestre) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Trung Thành Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Trung Thành, thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Nguyễn Quang Thạch, TS. Nguyễn Hạnh Hoa và toàn thể tập thể cán bộ, nhân viên trong Viện Sinh học Nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện về cơ sở vật chất, chia sẻ kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đề tài này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn chia sẻ, động viên, giúp đỡ và góp ý cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Thị Thu Thủy i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BAP 6-benzylaminopurin CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) ĐC Đối chứng IBA Indol butyric acid MS Murashige và Skoog LSD0,05 Leant Significant Difference P - 0,05 ND Nước dừa α-NAA α-naphthylacetic acid ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................ii MỤC LỤC...........................................................................................................iii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ........................................................................................... vii MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 Chương 1 - TỔNG QUAN................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu chung về cây Lan huệ ..................................................................... 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ ....................................... 3 1.1.2. Giá trị kinh tế và sử dụng ............................................................................... 5 1.2. Một số phương pháp nhân giống vô tính cây Lan huệ ................................... 6 1.2.1. Phương pháp tách củ con .............................................................................. 6 1.2.2. Phương pháp cắt lát ...................................................................................... 7 1.2.3. Phương pháp nhân giống in vitro ................................................................... 9 1.3. Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô .............................................................. 20 1.3.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu ................................................................................. 20 1.3.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy .................................................................................. 21 1.3.3. Nhân nhanh chồi .......................................................................................... 21 1.3.4. Tái sinh rễ .................................................................................................... 21 1.3.5. Chuyển cây ra vườn ươm ............................................................................. 22 1.4. Tình hình nghiên cứu về cây Lan huệ........................................................... 22 1.4.1. Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ trên thế giới ........................................... 22 1.4.2. Tình hình nghiên cứu cây Lan huệ ở Việt Nam ............................................ 24 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................... 26 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................. 26 2.1.1. Đối tượng .................................................................................................... 26 2.1.2 Vật liệu ......................................................................................................... 27 iii 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy ....................................................................................... 28 2.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................................ 28 2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm..................................................................... 28 2.2.1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động ..................................................................... 29 2.2.2. Giai đoạn nhân nhanh ................................................................................. 29 2.2.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh ....................................................................... 32 2.2.4. Giai đoạn vườn ươm ................................................................................... 33 2.3. Các chỉ tiêu theo dõi ...................................................................................... 33 2.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................. 34 2.5. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 37 Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 38 3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu tạo nguồn vật liệu nuôi cấy cho nhân giống in vitro các dòng Lan huệ ......................................................... 38 Xác định thời gian khử trùng thích hợp ......................................................... 38 3.2. Ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh chồi và hệ số nhân từ vảy củ đôi ............................................. 39 3.2.1. Ảnh hưởng của BA tới sự phát sinh chồi của mẫu nuôi cấy ......................... 40 3.2.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh chồi từ vảy củ đôi ..................................................................................................... 41 3.2.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất auxin và cytokinin đến khả năng nhân nhanh ch 3.3. Nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái và nhân nhanh từ đế củ ............. 45 3.3.1. Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ ................... 45 3.3.2 Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh hình thái từ đế củ ............................ 46 3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái từ đế củ ......................................................................................................... 50 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro của 5 dòng Lan huệ ............................................................................. 54 3.4.1. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro ................. 54 3.4.2. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro ..................... 57 iv 3.5. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh ........................................................... 57 3.5.1. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ.............................. 58 3.5.2. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ ............... 61 3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro ngoài vườn ươm ........... 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 66 Kết luận ................................................................................................................ 66 Đề nghị ................................................................................................................. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 68 PHỤ LỤC ............................................................................................................... v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng vào mẫu của các dòng Lan huệ (sau 4 tuần) ............................................................................. 39 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của vảy củ đôi (sau 4 tuần) .................................................................................................. 40 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của vảy củ đôi (Sau 4 tuần) ............................................................ 44 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BA, Kinetin và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (Sau 4 tuần) ............................................................. 44 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của 2,4-D tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ (sau 4 tuần) ..................................................................................................... 48 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng phát sinh hình thái từ đế củ (sau 4 tuần) ..................................................................................................... 48 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái in vitro từ đế củ (Sau 4 tuần) ............................................................................. 52 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi của mô sẹo từ đế củ (Sau 4 tuần) ................................................................................. 52 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau 4 tuần) ..................................................................................................... 56 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro (sau 4 tuần) ..................................................................................................... 56 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ của 5 dòng Lan huệ (sau 4 tuần) .................................................................................... 60 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ và chất lượng rễ của 5 dòng Lan huệ (sau 4 tuần) ..................................................................... 60 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro(Sau4 tuần)................................................ 63 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) ..................................................... 5 Hình 1.2. Phương pháp cắt lát củ của cây Lan huệ ................................................. 8 Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của vảy củ đôi (Sau 4 tuần) .................................................................................................. 41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA, Kinetin và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro từ vảy củ đôi (sau 4 tuần) ....................................... 45 Hình 3.4. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ (sau 4 tuần) .. 49 Hình 3.5. Ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ (sau 4 tuần) ..................................................................................................... 51 Hình 3.6. So sánh ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng tạo mô sẹo từ đế củ (sau 4 tuần ) .......................................................................................... 51 Hình 3.7. Ảnh hưởng của BA, Kinetin đến khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo của dòng Lan huệ H10 và H18 (sau 4 tuần) ................................................. 54 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nước dừa tới chất lượng chồi in vitro (sau 4 tuần) ........ 55 Hình 3.9. Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễvà chất lượng rễ của 5 dòng Lan huệ nuôi cấy in vitro (sau 4 tuần) .......................................................... 59 Hình 3.10. Ảnh hưởng của một số loại giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ sau in vitro ngoài vườn ươm ............................... 63 Hình 3.11. Ảnh hưởng của một số loại giá thểtới số lượng rễ mới và chiều dài rễ cây in vitro của 5 dòng Lan huệ (sau 2 tuần)…………………………………64 vii MỞ ĐẦU Lan huệ (Hippeastrum equestre)là một trong những loài hoa được yêu thích và rất có tiềm năng phát triển trong những năm gần đây. Lan huệ được trồng khá phổ biến để làm cảnh do màu sắc đa dạng, khả năng thương mại cao khi là hoa cắt cành hoặc được trồng trong chậu cảnh hay vào các dịp lễ, tết. Bên cạnh đó, đây còn là cây thuốc chữa bệnh vì theo đông y trong củ của nó có chứa các thành phần biệt dược có giá trị như các ankaloids [21], các lectins có khả năng chống ung thư, cầm máu, chữa lành vết thương… Lan huệ ở Việt Nam hiện nay còn nghèo nàn về màu sắc (chủ yếu là màu đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại khá muộn (khoảng từ giữa tháng 3 đến cuối tháng 5)nên khả năng phát triển loài hoa này còn rất nhiều hạn chế.Bằng con đường thu thập nguồn gen, lai hữu tính và chọn lọc có thể làm phong phú bộ giống hoa Lan huệ ở nước ta. Năm 2009 – 2010, Nguyễn Hạnh Hoa và cộng sự đã chọn tạo ra hàng loạt con lai có màu sắc lạ, đẹp, đa dạng, hoa có độ bền lâu và có thời gian ra hoa đáp ứng đúng thị trường, điển hình là các dòng H2, H4, H9, H10, H18. Tuy nhiên, các dòng Lan huệ này lại có nhược điểm là sinh sản vô tính kém (trong điều kiện tự nhiên), đặc biệt là các dòng Lan huệ H2, H4 và H18. Do vậy, những cá thể lai có đặc điểm ưu tú được chọn lọc cần phải nhân giống vô tính nhằm duy trì được tính trạng ban đầu.Từ nhiều năm nay, để nhân giống vô tính cây Lan huệ có thể sử dụng các phương pháp: Tách chồi hoặc củ nhỏ từ cụm cây mẹ; kỹ thuật cắt lát (Chipping); nhân giống bằng hạt; sử dụng phương pháp nhân giống in vitro. Mặc dù đơn giản nhưng hiệu quả khi nhân giống bằng phương pháp truyền thống không cao do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp, cây không đồng nhất cũng như không tạo được cây sạch bệnh. Phương pháp nhân giống in vitro đã khắc phục được những nhược điểm đó tạo được cây con sạch bệnh, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất, do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao và tính di truyền ổn định. Để đánh giá và duy trì nguồn vật liệu thì việc nghiên cứu nhân giống vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết. Năm 2009 – 1 2010, một số tác giả trong nướcđã bước đầu xác định kết quả để xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro hoa Loa kèn đỏ nhung (H. equestre Herb.) vàcây Lan huệ mạng (H. reticulatum var. striatifolium) [10,11]. Bên cạnh việc kế thừa một số kết quả trên cần phải có những nghiên cứu tiếp theo nhằm bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây hoa Lan huệ để nhân nhanh nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống. Xuất phát từ những yêu cầu đó, chúng tôi tiến hành đề tài:“Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ (Hippeastrum equestre)”.  Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được các giai đoạn cơ bản trong quy trình kỹ thuật nhân giống in vitrocủa một số dòng Lan huệ từ các nguồn vật liệu nuôi cấy khác nhau. - Góp phần bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitronhằm nhân nhanh một số dòng Lan huệ.  Ý nghĩa khoa họcvà thực tiễn - Cung cấp những dữ liệu khoa học mới về nhân giống vô tính cây Lan huệ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, góp phần làm phong phú cơ sở dữ liệu về kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa. - Cung cấp thông tin cần thiết làm cơ sở cho việc xây dựng hoàn thiện quy trình nhân giống Lan huệ thương mại có thương hiệu riêng và hiệu quả kinh tế cao. - Đáp ứng sản xuất cây giống Lan huệ có hiệu quả, chất lượng tốt, khắc phục được những hạn chế của nhân giống truyền thống, duy trì và nhân nhanh kiểu gen được chọn lọc. 2 Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu chung về cây Lan huệ 1.1.1.Đặc điểm thực vật học và phân bố của cây Lan huệ Cây Lan huệ có tên khoa học: Hippeastrum esquetre, thuộc họ Liliaceae, bộ Hành (Liliales), phân lớp Hành ( Liliidae), lớp thực vật một lá mầm (Monocotyledons) [2, 3]. Tên của loài hoa này có rất nhiều cách để Việt hóa như: Lan huệ,Loa kèn đỏ nhung, Huệ đất, Tứ diện xích lan, Huệ loa kèn, Mạc chu lan...Người châu Âu gọi là Valentine Flower bởi vì Lan huệ nở hoa trong khoảng đầu năm vào dịp lễ hội tình yêu (14/2). 1.1.1.1.Đặc điểm thực vật học của cây Lan huệ ở Việt Nam Lan huệ có dạng thân hành, hình cầu, có áo mỏng bao ở ngoài [4]. a. Lá cây Lá tập trung ở gốc gần như thành 2 dãy, phiến lá hình dải, màu xanh đậm, kích thước 45-50 cm x 2-4 cm, hình kiếm hoặc hình dải mác, hơi khum thành hình máng, dai, cứng, có nhiều gân sọc song song và gân phụ ngang song song, mép hơi cong xuống, chóp tù. Gốc lá dạng bẹ ôm lấy nhau. Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, gồm 2 cái, mỏng, kích thước 6-7 cm x 3-4 cm, màu trắng xanh. b. Hoa Cụm hoa tán, 2- 4 hoa, trên một cuống hoa chung có hình trụ, dài 30-50 cm, đường kính 1,5-2 cm ,thẳng đứng và rỗng, mặt ngoài phủ phấn trắng. Hoa to khi nở đường kính tới 15 cm, đều, lưỡng tính,màu sắc sặc sỡ, màu đỏ hoặc đỏ cam, có cuống dài 4-5 cm, gốc màu xanh, xanh vàng hoặc vàng trắng. Bao hoa hình phễu, dài 9-12 cm, nằm ngang hoặc rủ xuống, 6 mảnh, dạng tràng, phần dưới dính nhau thành ống, ngắn, dài 2-3,5 cm, họng có 1 vòng vảy ngắn hoặc 1 vòng tràng phụ cụp vào trong, phần trên 6 thùy, hình trứng xếp 2 vòng, các thùy bằng nhau hoặc các thùy vòng trong hẹp hơn. Nhị 6; chỉ nhị rời nhau, hình trụ dài 6-7 cm, đầu hơi cong đính ở họng ống bao hoa, nghiêng về một phía; bao phấn 3 hình trụ, dài 2-2,5 cm, màu trắng ngà,2 ô, đính lưng, hướng trong, mở bằng khe dọc. Bầu hoa, dài 1,2-1,5 cm 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi ô nhiều noãn; vòi nhụy dài tới 10 cm, mảnh; đầu nhụy dạng đầu hoặc 3 thùy, màu trắng. Hình 1.1: Hoa Lan huệ (Hippeastrum equestre) c. Củ và rễ Củ con: Lan huệ có các củ con (thân hành con) sinh ra từ củ mẹ, chu vi của củ con từ 3-6 cm, số lượng củ con trung bình từ 1-3 củ/cây. Rễ:docây thuộc bộ Lilliales nên có hệ rễ chùm gồm nhiều rễ phụ tương đối đồng đều về kích thước. d. Quả Quả nang, hình cầu hoặc hình thuôn, mở ở khe lưng ô thành 3 mảnh. Hạt nhiều, dẹp, màu đen nội nhũ nạc bao lấy phôi nhỏ. 1.1.1.2.Yêu cầu ngoại cảnh Cây Lan huệ mọc tự nhiên ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ, được nhập vào Việt Nam, trồng làm cảnh trong vườn hoặc trong chậu. Cây ra hoa vào giai đoạn xuânhè, do đó nếu muốn để hoa nở vào đúng dịp Tết thì các yếu tố ngoại cảnh là điều kiện vô cùng quan trọng cần chú ý đối với việc sinh trưởng phát triển của cây [2]. 4 a. Nhiệt độ Lan huệ có khả năng chịu nóng, ưa khí hậu lạnh và ẩm. Nhiệt độ thích hợp ban ngày từ 20-28oC, ban đêm 13-17oC, ở ngưỡng nhiệt độ dưới 5oC và trên 30oC cây sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù. Giai đoạn đầu nhiệt độ thấp có lợi cho sinh trưởng của rễ và sự phân hoá hoa. b . Ánh sáng Lan huệ là cây ưa cường độ ánh sáng trung bình, cường độ ánh sáng thích hợp từ 12.000-15.000lux nhất là thời kỳ cây cao 20-30cm. Muốn điều khiển độ dài của lá và chiều cao của vòi hoa, chỉ cần điều tiết ánh sáng. Cây nhiều ánh sáng có vòi hoa và lá ngắn, cây mọc trong bóng râm thường cao và lá dài. c . Nước Thời kỳ đầu cây rất cần nước, khi ra hoa giảm bớt nước. Nhiều nước dễ làm cho củ bị thối, rụng nụ. Độ ẩm đất thay đổi tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của cây (thường từ 70-85%). d . Đất Đất tơi xốp, không chứa mầm bệnh và thoát nước tốt. Lan huệ rất mẫn cảm với muối, nồng độ muối trong đất cao, cây không hút được nước ảnh hưởng tới sinh trưởng, ra hoa. Nói chung, hàm lượng muối trong đất không được cao quá 1,5mg/cm2, lượng hợp chất Clo không được vượt quá 1,5mmol/lít, pH = 6,5-7,0. 1.1.1.3.Phân bố Lan huệ có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được trồng khắp Châu Mỹ nhiệt đới, từ Mêhico và phía Nam Tây Ấn đến Brazil và Chile [3,4]. Chi Hippeastrumhiện có 7076 loài. Ở Việt Nam, chi Hippeastrumcó 2 loài, 1 thứ thường được trồng làm cảnh. 1.1.2.Giá trị kinh tế và sử dụng Trên thế giới, nhiều loài thuộc chi Hippeastrum được trồng làm cảnh bởi chúng có ưu điểm là hoa to, đẹp, khá đa dạng về màu sắc, có thể sử dụng dưới dạng hoa cắt cành, trồng chậu hoặc trồng thảm. Hoa được sử dụng trong ngày lễ, ngày tết, được trang trí trong nội thất, hoặc làm quà tặng rất trang trọng. Hoa mang hương thơm mát dịu, màu sắc thanh nhã, tính thẩm mỹ cao [5]. 5 Ở ViệtNam, hoa được sử dụng trong những ngày lễ, ngày tết, được trang trí trong hội trường, công viên, trong gia đình và làm quà tặng rất trang trọng. Trong Đông dược, Lan huệ là một vị thuốc quan trọng vì củ có vị ngọt cay, tính ấm có độc, có tác động tán ứ, tiêu thũng. Thân hành của cây được dùng giã nát đắp cầm máu và trị tổn thương khi té ngã. Bên cạnh đó, Lan huệ là một trong những loài hoa có tiềm năng phát triển của chi Hippeastrum do củ của nó có chứa các biệt dược giá trị như các loại alkaloids [21], các lectins có hoạt tính chống siêu vi trùng, chống sưng viêm, chống ung thư, chữa bệnh Alzheimer, cầm máu và chữa vết thương. Các alkaloids trong Lan huệ đang được nghiên cứu về một số tác động dược học. Trong số các alkaloids, lycorine (tên cũ Narcissine) là chất được chú ý nhất. Lycorine là một alkaloid loại isoquinolone (chuyển hóa từ phena thridine), có các hoạt tính sinh học loại cholino mimetic; ức chế hoạt tính sinh học của men acetylcholinesterase. Các hoạt tính của Lycorine có tác dụng chống siêu vi trùng, có tác dụng chống sưng-viêm do ức chế sự sản xuất TNF-alpha (tumor necrosis factor) nơi các đại thực bào của chuột thử nghiệm; ức chế tiến trình sinh tổng hợp proteins. Vì TNF-alpha là một chất cytokine căn bản điều hòa tiến trình sưng viêm nên lycorine có triển vọng được dùng làm thuốc chống sưng, trị thấp khớp. Hoa Lan huệ ở nước ta hầu như chỉ có màu đỏ, hoa nở trong 1 thời gian ngắn còn quanh năm nó chỉ có màu xanh biếc của lá.Hoa Lan huệ chỉ trổ bông mỗi năm một lần, có khi đôi lần nhưng không nhiều cây ra hoa được như thế [5]. 1.2.Một số phương pháp nhân giống vô tính cây Lan huệ 1.2.1.Phương pháp tách củ con Trong quá trình sinh trưởng phát triển, một củ Lan huệ có thể đẻ ra nhiều củ con ở xung quanh. Có thể tách những củ con đem trồng. Củ con sau khi tách có khả năng sống rất cao và sớm cho hoa, thông thường sau 18-24 tháng cây sẽ cho hoa. Khi đường kính củ con được 2-3 cm thì tách khỏi cây mẹ, có thể trồng trong chậu đất hoặc chậu nhựa, nếu trồng trong chậu đất thì cần phải tưới nước thường xuyên hơn là trong chậu nhựa. Nhúng phần đế của củ cùng với bộ rễ trong nước ấm, 6 điều này có tác dụng làm mềm rễ và thuận lợi cho bộ rễ lan ra khắp chậu. Khoét một hố trên bề mặt đất rộng hơn đường kính củ, đặt củ vào hố sao cho 1/3 củ nổi trên mặt đất [20]. 1.2.2.Phương pháp cắt lát Kỹ thuật cắt lát (chipping) được sử dụng khá phổ biến nhất là đối với những cây họ Hành có củ (là những lớp vảy xếp khít nhau xung quanh đỉnh sinh trưởng trung tâm) như chi Hippeastrum, Narcissus (hoa thủy tiên), Galanthus. Các bước tiến hành [20]: 1. Chọn những củ Lan huệ bố mẹ khoẻ mạnh không bị nấm bệnh, nhổ củ khi củ còn ở trạng thái ngủ nghỉ. 2. Dùng dao sắc nhọn sao cho khi cắt lát cắt phẳng, mịn không làm dập nát củ. Khử trùng bề mặt củ và dao cắt. 3. Cắt bớt phần rễ và phần trên của củ, dùng dao cắt dọc chia đôi củ từ đỉnh củ xuống phần đế củ, tiếp tục chia nhỏ các nửa hành sao cho mỗi lát đều mang một phần đế củ. Một củ có thể chia thành 8-16 lát. 4. Các lát được ngâm trong dung dịch thuốc diệt nấm khoảng 10-15 phút lắc đều, sau đó được vớt ra để ráo nước. 5. Cho mỗi lát vào trong 1 túi nilon có chứa đá trân châu có thêm chất khoáng, cho nhiều khí vào túi và buộc kín túi. Đưa vào nơi mát và tối với nhiệt độ thích hợp 20-21oC, thường xuyên kiểm tra dấu hiệu thối hỏng. 6. Sau khoảng 12 tuần các hành con sẽ xuất hiện ở gốc của lát cắt. Tách các cây con trồng vào giá thể tơi xốp và thoát nước. Cây con rất bé và yếu ớt nên cần đặt dưới ánh sáng tán xạ một thời gian trước khi đưa ra ngoài ánh sáng trực tiếp. Phải mất khoảng 2-4 năm cây mới sinh trưởng phát triển thành thục và cho hoa. Ở Việt Nam, mùa đông không có tuyết và sương giá nên cây sẽ lớn nhanh hơn và cho hoa sớm hơn so các nước ở xứ lạnh. Nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát củ đã được rất nhiều nhóm tác giả nghiên cứu cả trong điều kiện in vivovà in vitro. Epharath và cộng sự (2001) đã sử dụng 7 phương pháp cắt củ [20], chia củ mẹ thành 2, 4, 8, 12, 16, 32 và 48 lát cắt, mỗi lát cắt đều mang 1 phần đế củ và giâm vào túi nilon có chứa chất khoáng bón cho cây. Các túi này được đặt trong điều kiện nhiệt độ 230C trong 4 tháng. Kết quả 7 cho thấy, khi cắt củ thành 48 phần thì số lượng chồi thu được là cao nhất, 34 chồi/mẫu. Năm 1991, O’Rourke và cộng sự đã cắt củ nhỏ in vitro tạo ra từ vảy củ đôi trên môi trường tạo củ của loài Hippeastrum hybridum "Apple Blossom” thành 2 hoặc 4 phần và tiếp tục nuôi cấy trong 10 - 12 tuần. Sau 26 - 28 tuần nuôi cấy, hệ số nhân thu được đã tăng lên 100 chồi/mẫu ban đầu [32]. Bằng phương pháp cắt củ này, Slabbert và cộng sự (1993) cũng đã thu được 700 - 1000 cây từ 1 củ ban đầu sau 12 tháng, cây con thu được khỏe, có sức sống cao [38]. Hình 1.2. Phương pháp cắt lát củ của cây Lan huệ 8 1.2.3.Phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp này có ưu điểm là tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên cây có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao. Đồng thời, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định, có thể cung ứng cho sản xuất trên quy mô rộng. Đã có một số nghiên cứu bước đầu về nhân in vitro cây Lan huệ, các tác giả cho biết: Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo chồi ở cây Loa kèn đỏ nhung (Hippeastrum equestre Herb.) là môi trường MS có bổ sung 5,0 mg/l BA và cây Lan huệ mạng là môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l BA, 100% mẫu tái sinh tạo chồi và củ nhỏ. Chồi và củ nhỏ tạo ra được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh. Đa số các chồi đều ra rễ. Các cây con in vitro hoàn chỉnh được đưa ra thích nghi với điều kiện giá thể cát và trấu hun theo tỷ lệ 1:1 [10,11]. 1.2.3.1.Cơ sở khoa học Tính toàn năng của tế bào (totipotency), từ năm 1902 nhà khoa học người Đức HaberLandt đã đề xướng ra phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông, mỗi tế bào được lấy từ bất kỳ cơ quan sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Khả năng này do mỗi tế bào đều chứa bộ gen mang thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể, khi được đặt vào môi trường thích hợp tế bào này sẽ có khả năng giống như một hợp tử ban đầu [8]. Một đặc tính quan trọng khác, làm cơ sở cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào. Khả năng biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ tế bào phôi thành toàn bộ các tế bào chức năng trong các cơ quan của cơ thể. Ngược lại, khi được đặt vào môi trường thích hợp, các tế bào chuyên hóa của cơ thể có thể trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên sinh ra nó – tế bào phôi. Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chứng minh, khả năng phản biệt hóa của các tế bào là khác nhau, các tế bào chuyên hóa sâu như tế bào của hệ thống mạch dẫn thực vật, tế 9 bào thần kinh động vật, khả năng biệt hóa rất khó xảy ra. Đối với thực vật, khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc [25]. Trong tự nhiên, tất cả các loài sinh vật đều tồn tại trong mình tiềm năng sinh sản dù là vô tính hay hữu tính, như thế các loài mới có thể duy trì được kiểu gen của mình, chiến thắng trong quá trình tiến hóa. Nhưng ngay từ khi ra đời, công nghệ nuôi cấy mô đã trở thành công cụ đắc lực phục vụ mục đích nhân giống của con người [1]. 1.2.3.2.Ý nghĩa của phương pháp nhân giống in vitro Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính. Đối với nhiều loại thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitrolà công cụ vô cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitrolà do: Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa học. Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp, vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với các cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất [1,8]. Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ, nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho 10 sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy, phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp. Bên cạnh đó, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém. Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống, một phương pháp nhân giống khác đã áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi trội như: - Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 /năm, cao hơn bất cứ phương thức nhân giống nào. - Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt với cây bố mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế. - Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo được những giống cây hoàn toàn sạch virus. - Nhân giống in vitrocó thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong những điều kiện sinh thái nhất định. - Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng, nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm. - Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội. - Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen. Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitrovẫn không tránh khỏi một số nhược điểm như: 11