Tài liệu Nghiên cứu nhân giống cây khoai môn (caladium esculenta) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.

  • Số trang: 55 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 542 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHẠM THẾ QUANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY KHOAI MÔN (CALADIUM ESCULENTA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học: : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHẠM THẾ QUANG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY KHOAI MÔN (CALADIUM ESCULENTA) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học: : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : 1. ThS. Vi Đại Lâm Giảng viên khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên : 2. ThS. Lê Thị Hảo Bộ môn công nghệ tế bào, Viện khoa học sự sống Thái Nguyên, năm 2014 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Khoai môn (Colocasia esculenta), là một loại cây lương thực phổ biến ở Việt Nam. Chúng có thể trồng ở vùng khô hạn, trung du, miền núi và đồng bằng. Sản phẩm chủ yếu là lấy củ và tận dụng lấy dọc khoai làm thực phẩm khi cần thiết [4]. Khoai môn là cây trồng truyền thống của khu vực Nam Á, Đông Nam Á nói chung và của Việt Nam nói riêng. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu, Khoai môn sọ là một trong những loại cây cổ sưa nhất, được phát hiện và thuần hóa cách đây hơn 5000 năm. Cùng với thời gian, cây trồng này ngày càng trở nên phổ biến và trở thành cây trồng có vị trí quan trọng không thể thay thế trong cơ cấu cây trồng của nhiều quốc gia. Khoai môn sọ được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: Củ được dùng để chế biến nhiều món ăn ngon và bổ dưỡng hoặc được dùng cho công nghiệp chế biến; Thân lá cây được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi và hầu hết các bộ phận của cây đều có tác dụng như những loại cây thảo dược thiên nhiên trong các bài thuốc cổ truyền. Do nhu cầu lớn của thị trường với loại cây trồng này mà diện tích canh tác và sản lượng khoai môn sọ trong những năm qua không ngừng gia tăng. Theo thống kê của tổ chức nông lương thế giới (FAO) trong vòng 10 năm từ 1992- 2002, diện tích canh tác khoai môn sọ trên thế giới đã tăng lên 5,8% và sản lượng tăng 7,1%, con số này được dự đoán là sẽ tiếp tục gia tăng trong thời gian tới [10]. Ở nước ta, khoai môn – sọ là loại cây có củ được trồng nhiều tại hầu hết các vùng sinh thái là cây đặc sản quý của một số địa phương. Tại một số tỉnh miền núi như: Bắc Kạn, Hòa Bình, Sơn La, Lạng Sơn có nhiều giống khoai môn chất lượng cao, được coi là loại cây góp phần đảm bảo an ninh lương thực và đáp ứng đòi hỏi khắt khe của thị trường [3]. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào đã được ứng dụng thành công trong việc nhân một số cây phục vụ sản xuất như: Khoai tây, chuối, dứa vv… nhưng đối với khoai môn thì việc nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào còn ít. Ưu điểm nổi bật của kĩ thuật nuôi cấy mô là cho hệ số nhân giống cao, chủ động 2 được thời gian cung cấp cây giống, đồng thời có thể phục tráng và làm sạch bệnh của các dòng giống khoai môn bị thoái hóa và hoặc bị nhiễm bệnh. Nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống cây khoai môn (Caladium esculenta) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.” 1.2. Mục đích của đề tài Nghiên cứu khả năng nhân nhanh và ra rễ của chồi khoai môn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. 1.3. Yêu cầu của đề tài Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi khoai môn. Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng ra rễ của chồi khoai môn. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng và học tập nghiên cứu khoa học. + Biết được các phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học. + Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân và chất lượng cây khoai môn mới. + Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy và sản xuất giống khoai môn thương phẩm có năng suất cao. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện quy trình kĩ thuật nhân giống cây khoai môn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm cung cấp giống với số lượng lớn, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu cung cấp giống khoai môn mới ra thị trường. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây khoai môn 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây Khoai môn 2.1.1.1. Nguồn gốc Cây khoai môn Colocasia esculenta (L.) Schott là cây một lá mầm thuộc chi Colocasia, họ Araceae. Nhiều nghiên cứu cho rằng khoai môn có nguồn gốc phát sinh tại các dải đất kéo dài từ Đông Nam Ấn Độ và Đông Nam Á tới New Guinea và Malaisia. Lịch sử trồng trọt cũng bắt đầu từ những vùng đất đó. Vào khoảng 100 năm trước công nguyên khoai môn đã được trồng ở Trung quốc và Ai Cập. Trong thời tiền sử, việc trồng trọt được mở rộng tới các quần đảo Thái Bình Dương, sau đó là vùng Địa Trung Hải và Tây Phi. Ngày nay, khoai môn được trồng phổ biến ở khắp các vùng nhiệt đới cũng như ôn đới ấm áp [5], [6]. 2.1.1.2. Phân loại Giới (Kingdom) : Plantae Ngành (division) : Magnoliophyta Lớp (class) : Liliopsida Bộ (order) : Alismatales Họ (family) : Araceae Chi (genus) : Colocasia Loài (species) : Colocasia esculenta Cây khoai môn thuộc chi Colocasia là một trong những chi quan trọng nhất của họ ráy (Araceae) vì có giá trị kinh tế hơn cả. Khoai môn trồng được phân loại như loài Colocasia esculenta, một loài đa hình. Chi Colocasia được Linnacus mô tả lần đầu tiên vào năm 1753 là Arum colocasia và Arum esculentum. Một số nhà phân loại thực vật học cho rằng có một loài đa hình là C. esculenta và ở mức độ dưới loài biết đến có C. 4 esculenta var. esculenta và C. esculenta var. antiquorum (Ghani, 1984). Một số khác lại cho rằng chi Colocasia có một loài đa hình C. antiquorum và ở mức độ dưới loài là C. antiquorum var. typica, C. antiquorum var. euchlora, C. antiquorum var. esculenta (Kumazawa et al., 1956). Tuy nhiên có trường phái lại cho rằng, chắc chắn có hai loài C. esculenta và C. antiquorum được phân biệt dựa vào những đặc điểm hình thái hoa [5]. Ở Việt Nam, đến nay tên của loài cây này trong các tài liệu được sử dụng rất khác nhau. Từ năm 1998, khi nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen khoai môn ở Việt Nam, các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Trương Văn Hộ, Nguyễn Văn Viết, Nguyễn Phùng Hà cho rằng giả thiết có hai loài phụ dưới loài Colocasia esculenta là C. esculenta var. esculenta và C. esculenta var. antiquorum với tên gọi khoai môn và khoai sọ là có lý hơn cả. Nguồn gen khoai môn bao gồm 3 biến dạng thực vật là khoai môn (Dasheen type) với 2n = 28, khoai sọ (Eddoe type) với 2n = 42 và nhóm trung gian. Ba biến dạng này có mối quan hệ khá gần gũi trong quá trình tiến hoá từ cây khoai nước đến khoai môn và sau cùng là cây khoai sọ. Nhóm khoai sọ có thể do nhóm khoai môn tự đa bội mà thành hoặc do sự tái tổ hợp giữa dạng nhị bội (2n) với dạng tứ bội (4n). Ranh giới giữa 3 nhóm không rõ ràng nếu chỉ dựa vào đặc điểm hình thái nông học. - Loài phụ C. esculenta var. esculenta có hai nhóm: Nhóm khoai nước (chịu ngập úng) và nhóm khoai môn (trồng trên đất cao). Hai nhóm này sử dụng củ cái để ăn, củ con để làm giống và dọc lá dùng để chăn nuôi. Hoa có phần phụ vô tính ngắn hơn so với phần cụm hoa đực. - Loài phụ C. esculenta var. antiquorum gồm nhóm khoai sọ. Nhóm này có củ cái kích thước nhỏ đến trung bình kèm theo nhiều củ con có tính ngủ nghỉ. Nhóm khoai sọ phân bố rộng có thể trồng trên đất ruộng lúa nước hoặc trên đất phẳng, thậm chí trên đất dốc. Hoa có phần phụ vô tính dài hơn phần cụm hoa đực [5], [6]. 2.1.2. Đặc điểm thực vật học 2.1.2.1. Rễ Hệ rễ thuộc loại rễ chùm mọc ở đốt mầm, ngắn, phân bố chủ yếu ở tầng đất có độ sâu tối đa 1m. Rễ phát triển thành nhiều tầng. Số lượng rễ và chiều dài rễ phụ thuộc vào từng giống và đất trồng. Rễ thường có màu trắng. 5 2.1.2.2. Thân Thân cây khoai môn chỉ có thân giả trên mặt đất do toàn bộ phần dọc lá tạo thành. Củ cái được coi là cấu trúc thân chính của cây (được gọi là thân củ) nằm trong đất. Trên thân củ có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm phát triển thành nhánh. Sau mỗi dọc lá lụi đi thì trên thân củ thêm một đốt và thân củ dài thêm ra. Bề mặt củ được đánh dấu bởi vòng tròn gọi là chân dọc củ. Đó là điểm nối của những vảy lá hoặc lá già. Nhiều mầm bên phân bố trên những đốt củ. Đỉnh của củ cái chính là điểm sinh trưởng của cây. Sự mọc lên của cây đều bắt đầu từ đỉnh củ cái. 2.1.2.3. Lá Lá là phần duy nhất nhìn thấy trên mặt đất, quyết định chiều cao của cây. Mỗi lá được cấu tạo bởi một dọc lá thẳng và một phiến lá. Phiến lá của hầu hết các kiểu gen có dạng gốc hình tim, có rốn ở gần giữa. Phiến lá nhẵn, chiều dài có thể biến động từ 20-70cm và bề rộng từ 15-50cm. Kích thước của lá chịu ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh. Lá khoai môn đạt cỡ lớn nhất ở giai đoạn sắp ra hoa. Màu phiến lá biến động từ xanh nhạt đến tím thẫm phụ thuộc vào kiểu gen. Lá có thể chỉ có một màu hoặc thêm đốm. Lá khoai môn cũng có thể bị đổi màu khi bị bệnh, đặc biệt là khi bị nhiễm virus. Trên phiến lá có 3 tia gân chính, một gân chạy thẳng từ điểm nối dọc lá với phiến lá tới đỉnh phiến lá, hai gân còn lại chạy ngang về hai đỉnh của thùy lá. Từ 3 gân chính có nhiều gân nhỏ nổi phát ra tạo thành hình mắt lưới. 2.1.2.4. Dọc lá Dọc lá mập có bẹ ôm chặt ở phía gốc tạo nên thân giả. Chiều dài dọc lá biến động phụ thuộc vào kiểu gen từ 35-160cm. Màu dọc lá biến động từ xanh nhạt tới tím đậm, đôi khi có sọc màu tím hoặc xanh đậm. Dọc và lá không phải khi nào cũng cùng màu. Bẹ của dọc thường có chiều dài khoảng 1/3 chiều dài của dọc. Gần lúc thu hoạch củ, dọc lá càng ngày càng ngắn lại và phiến lá cũng nhỏ đi. 6 2.1.2.5. Hoa Hoa có dạng bông mo, mọc ra từ nách lá hoặc từ giữa bẹ của lá không mở. Mỗi cây có thể có từ 1 cụm hoa trở lên. Cụm hoa mọc đơn độc ngắn hơn cuống lá. Cụm hoa cấu tạo bởi một cuống ngắn, một bông mo và một bẹ mo. Bẹ mo có màu vàng nhạt đến vàng đậm, có chiều dài khoảng 20cm ôm lấy bông mo. Trục bông mo ngắn hơn bẹ mo, có 4 phần: Phần hoa cái dưới cùng, tiếp đến một phần không sinh sản, trên nữa là phần hoa đực, cuối cùng là phần phụ không sinh sản, hình nhọn. Hoa không có bao. Hoa đực có nhị tụ nhiều cạnh, bao phấn nứt rãnh [5]. 2.1.3. Đặc điểm sinh trưởng phát triển Nhiệt độ: Khoai môn yêu cầu nhiệt độ trung bình ngày trên 21oC để sinh trưởng phát triển bình thường, không thể sinh trưởng phát triển tốt trong điều kiện sương mù, vì đây là loại cây có nguồn gốc của vùng đất thấp, mẫn cảm với điều kiện nhiệt độ. Năng suất khoai môn có xu hướng giảm dần khi nơi trồng có độ cao tăng dần. Nước: Do có bề mặt thoát hơi nước lớn nên cây khoai môn có yêu cầu về độ ẩm đất cao: Lượng mưa hoặc tưới tối thiểu khoảng 1500-2000mm. Cây phát triển tốt nhất trong điều kiện đất ướt hoặc ngập. Trong điều kiện khô hạn cây giảm năng suất rõ rệt, củ thường có dạng quả tạ. Ánh sáng: Cây khoai môn đạt được năng suất cao nhất trong điều kiện cường độ ánh sáng cao, tuy nhiên nó là loại cây chịu được bóng râm hơn hầu hết các loại cây khác, có thể cho năng suất hợp lý thậm chí trong điều kiện che bóng nơi những cây trồng khác không thể phát triển được. Sự hình thành củ được tăng cường trong điều kiện ngày ngắn, trong khi hoa lại nở mạnh trong điều kiện ngày dài. Đất đai: Cây khoai môn là loại cây có thể thích ứng được với nhiều loại đất khác nhau và được trồng nhiều ở loại đất tương đối chua, thành phần tương đối nhẹ và nhiều mùn. Chất dinh dưỡng: Cây khoai môn - sọ phát triển tốt nhất trên đất có độ pH trong khoảng 5,5 - 6,5. Một đặc tính quý của khoai môn là một số giống có tính chống chịu mặn cao [5], [6]. 7 2.1.4. Giá trị dinh dưỡng Phần có giá trị dinh dưỡng của khoai môn là củ cái, các củ con và dọc lá(ở một số giống). Tỷ trọng tươi của các chất trong củ khoai môn theo nghiên cứu của FAO (1994) như sau: Trong củ tươi, tùy thuộc vào giống, hydrat cacbon chiếm 13-29%, trong đó tinh bột chiếm tới 77,90% với 4/5 là amylopectin và 1/5 là amylose. Hạt tinh bột của khoai môn rất nhỏ nên dễ tiêu hoá. Chính yếu tố này đã tạo cho khoai môn phù hợp như là món ăn đặc biệt cho trẻ nhỏ bị dị ứng và những người bị rối loạn dinh dưỡng. Trong củ, tinh bột tập trung nhiều ở phần dưới củ. Củ khoai môn chứa 7% protein theo khối lượng khô, cao hơn khoai mỡ, sắn và khoai lang với thành phần rất nhiều axit amin cần thiết cho cơ thể. Một điểm đáng chú ý là lượng protein nằm ở phía gần vỏ củ hơn là ở trung tâm củ, vì vậy nếu gọt vỏ củ quá dày sẽ làm mất đi lượng protein trong củ. Lá khoai môn rất giàu protein, chứa khoảng 23% protein. Lá cũng giàu nguồn canxi, photpho, sắt, vitamin C, thiamin, riboflavin và niacin là những thành phần cần thiết cho chế độ ăn uống của chúng ta. Lá khoai môn tươi có 20% chất khô trong khi dọc lá chỉ có 6% [5], [6]. 2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ : “Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể” [18]. Năm 1902, Harberland là người đầu tiên đã quan niệm rằng bất kì một tế bào nào của cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Ông đã cho rằng “Bằng nuôi cấy tế bào đã phân lập, người ta có thể tạo ra các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng”. Ông cũng đã tiến hành nuôi cấy mẫu lá của một số cây một lá mầm như: Erythronium, Tradescantia, tuy nhiên đã không thành công [24]. Năm 1922, Kotte, học trò của Harberland và Robbins, người Mỹ, lặp lại thực nghiệm của Haberland với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây 8 hoà thảo. Trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo nên một hệ rễ nhỏ mang cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm dần và dừng lại, mặc dù các tác giả đã chuyển sang môi trường mới [19]. Năm 1934, được xem là giai đoạn thứ hai của nuôi cấy mô và tế bào thực vật khi White thành công trong việc duy trì mô rễ cây cà chua trong môi trường lỏng có chứa muối khoáng, đường saccarozơ và dịch chiết nấm men. Qua thí nghiệm, ông thấy rằng có thể thay dịch chiết nấm men bằng các vitamin nhóm B (B1, B3, B6) [23]. Năm 1939, độc lập với Nobercourt, Gautheret cũng đã duy trì được sinh trưởng của mô sẹo cà rốt trong một thời gian dài. Năm 1941, Van Overbeek và cộng sự đã phát hiện thấy nước dừa có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh phôi và tạo mô sẹo ở cây họ cà [22]. Cũng trong thời gian này, nhiều chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin như NAA, 2,4-D đã được tổng hợp. Nhiều tác giả xác nhận cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo thông qua phân chia tế bào ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy [16]. Năm 1954, Skoog bổ sung chế phẩm ADN chiết từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy mô thân cây thuốc lá. Ông nhận thấy chế phẩm này có tác dụng kích thích sinh trưởng mô nuôi cấy rõ rệt [24]. Một năm sau, Skoog và cộng sự đã xác nhận chất gây ra hiện tượng trên là 6-furfuryl amino purine và đặt tên là kinetin. Sau đó người ta đã tìm ra và tổng hợp một số chất có tác dụng kích thích phân bào tương tự như kinetin và cùng với kinetin gọi chung là nhóm cytokinin. Cytokinin được tách chiết từ thực vật bậc cao đầu tiên là zeatin có trong mầm ngô. Các hợp chất này có khả năng kích thích sự phân chia tế bào của các mô đã biệt hoá cao như tế bào thịt lá hoặc nội nhũ của hạt đã phơi khô [22]. Nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, Morel (1960) đã tạo ra được các protocorm (mô sẹo) từ địa lan. Khi để trong các điều kiện nhất định, các protocorm có thể phát triển thành cây lan con và hoàn toàn sạch bệnh. Cùng năm đó, Cocking ở trường đại học tổng hợp Nottingham đã thu được các tế bào trần (protoplast) dùng cho nuôi cấy từ mô thực vật được xử lý với enzym 9 xenlulaza. Năm 1966, Guha và cộng sự đã tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn của cây cà độc dược (Datura inoxia). Việc tạo cây đơn bội thành công ở nhiều loài thực vật thông qua nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã đóng góp rất lớn cho các ngiên cứu di truyền và lai tạo giống [17]. Từ những năm 1970 trở đi, các nhà khoa học đã chú ý vào triển vọng của kỹ thuật nuôi cấy protoplast, khi hai tác giả người Nhật Bản là Nagata và Takebe đã thành công trong việc làm cho protoplast thuốc lá tái tạo được xenlulozơ. Năm 1978, Melchers và cộng sự đã lai tạo thành công protoplast của cà chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở thực vật [17]. 2.2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2.1. Tính toàn năng (Totipence ) của tế bào thực vật Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiến hành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng. Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Ông nhận thấy, mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trình phân bào nguyên nhiễm. Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽ chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh. Khi gặp điều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham. Unio) đã thành công khi thực nghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tế bào. Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [17]. Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Cơ thể thực vật hình thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau. Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào 10 hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau [14]. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị: Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào. Phân hóa tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào Sơ đồ các giai đoạn phân hóa tế bào Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [14]. 2.2.3. Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật Trong nhiều thập kỉ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới. Có thể nói đây là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. 11 Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần… con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Điều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian để đưa một giống mới và sản xuất với quy mô lớn [9], [16]. Ngoài ra, dựa vào kĩ thuật nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản được nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài thực vật sinh sản sinh dưỡng. Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt di truyền mà phương pháp lai giống cổ điển không thực hiện được. Bên cạnh đó, các nhà nghiên cứu đã thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn đến sự ổn định và ñộc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên " mở ra triển vọng sử dụng kĩ thuật này ñể nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học để thu nhận các hợp chất trên quy mô công nghiệp " [8]. Ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong điều kiện in vitro để sản xuất các hợp chất thứ cấp: + Các tế bào thực vật có thể được nuôi cấy trong điều kiện nhân tạo mà không phụ thuộc vào thời tiết và địa lý. Không cần thiết để vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô. + Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất sản phẩm bằng cách loại bỏ những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của nguyên liệu thô, sự đồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản. + Một số sản phẩm trao đổi chất được sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [9]. + Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… một kỹ thuật tiến bộ với những ưu thế như tính khả thi rộng, tốc độ nhân giống cực kỳ cao và có tiềm năng công nghiệp hóa [1]. 12 Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền – đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở các tế bà thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…[16]. 2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.3.1.Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy. 2.2.3.2. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật a) Điều kiện vô trùng Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trường hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro [15]. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thường hay sử dụng một số hoá chất như: NaOCl, cồn 70o, Ca(OCl)2, HgCl2 0,1% … để khử trùng. b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH - Ánh sáng Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: Thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo. Ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 13 7000 lux, ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 - 40cm [15]. - Nhiệt độ Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25±2oC [12]. - pH pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trường được điều chỉnh giữa 5,5-6 trước khi hấp khử trùng. pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng [17]. 2.2.3.3. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng, phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy mô đều gồm các thành phần sau: các khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường làm nguồn cacbon, cac vitamin, các chất điều hoà sinh trưởng. Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,..) và một số chất có thành phần không xác định như nước dừa, dịch trích nấm men… a) Nước Cần đặc biệt chú ý đến thành phần này vì nước chiếm đến 95% môi trường dinh dưỡng. Nên sử dụng nước cất khi tiến hành các thí nghiệm 14 nghiên cứu. Nếu môi trường chuẩn bị cho nuôi cấy protoplast, tế bào hay meristem thì nên dùng nước cất 2 lần. Hoàn toàn không nên sử dụng nước máy trong nuôi cấy mô. Trong trường hợp không có sẵn cũng chỉ nên sử dụng nước khử ion, mặc dầu nước này vẫn có thể chứa nguồn lây nhiễm hữu cơ và các loài vi khuẩn [12]. b) Dinh dưỡng vô cơ Dinh dưỡng vô cơ được chia ra làm 2 loại: Các nguyên tố dinh dưỡng đa lượng và nguyên tố dinh dưỡng vi lượng. Trong tự nhiên cây trồng muốn sinh trưởng và phát triển mạnh thì cần phải lấy từ đất các nguyên tố sau [12]: - Các nguyên tố đa lượng: Các ion của nitơ (N), photpho (P), kali (K), canxi (Ca), magie (Mg) và lưu huỳnh (S). - Các nguyên tố vi lượng: Sắt (Fe), niken (Ni), clo (Cl), mangan (Mn), kẽm (Zn), bo (B), đồng (Cu), và molipden (Mo). Các nguyên tố trên cùng với cacbon, oxy, hidro được xem là các nguyên tố dinh dưỡng thiết yếu của thực vật. Nhu cầu của mô thực vật nuôi cấy đối với nguyên tố dinh dưỡng khoáng khác nhau so với thực vật ngoài đồng ruộng. Hệ rễ thực vật lấy dinh dưỡng từ đất chủ yếu theo phương thức hấp thu chủ động, còn mô nuôi cấy dinh dưỡng khoáng từ môi trường theo phương thức hấp thu bị động là chính. Theo nguyên tắc thành phần môi trường nuôi cấy sẽ được xây dựng trên thành phần các nguyên tố dinh dưỡng có mặt trong mô. Môi trường nhân tạo sử dụng phổ biến nhất thường được sử dụng trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật là môi trường MS (Murashige và Skoog (1962) cũng được thiết lập dựa trên nguyên tắc này [12]. c) Đường Đường là thành phần quan trọng trong tất cả các môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô thực vật. Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển vì quá trình quang hợp của mô hoặc cây nuôi cấy là không đủ cho sự sinh trưởng của chúng được đặt trong điều kiện không thích hợp cho quang hợp hay thậm chí hoàn toàn không có quang hợp (nuôi cấy trong bóng tối). Các mô có màu xanh cũng không đủ khả năng để tự dưỡng in vitro. Mặt 15 khác, quá trình quang hợp cũng bị hạn chế ở nồng độ CO2 trong bình cấy. Trên thực tế việc bổ sung CO2 là rất khó khăn và tốn kém. Đường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường saccharose ở nồng độ 1-5%. Đường sucrose là dạng đường được tổng hợp và vận chuyển tự nhiên trong cây nên rất thuận lợi cho các mô nuôi cấy. Cũng có thể sử dụng đường glucose hoặc fructose trong nuôi cấy mô thực vật. Nồng độ đường sử dụng phụ thuộc vào loại và tuổi của mẫu cấy [12]. d) Vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình trao đổi chất. Đại đa số tế bào thực vật nuôi cấy đều có thể tự tổng hợp vitamin cần thiết, nhưng số lượng thấp, có thể không đủ duy trì sự sinh trưởng của nó. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamin (vitamin B1), nicotinic acid, pyridoxine (vitamin B6) và myo-inositol. Vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn cacbon của môi trường nuôi cấy [12]. e) Agar Agar là một loại polysaccarit của tảo. Agar là chất keo đông thường được sử dụng nhất, nguồn gốc chủ yếu của nó là rong biển đỏ, là một phức chất polysaccarit do đường saccloze và galactose tạo thành. Nồng độ của thạch dùng trong nuôi cấy thay đổi phụ thuộc vào mục tiêu nuôi cấy (thường 4-12g/l, trung bình 6-12g/l) nếu nồng độ quá cao môi trường dinh dưỡng sẽ rất cứng chất dinh dưỡng khó khuếch tán để nuôi dưỡng mô cấy. Ở 800C thì ngậm nước chuyển sang trạng thái lỏng còn ở 400C thì trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của thạch khá cao: 6-12g/l nước. Thạch ở dạng gel nhưng vẫn để cho các ion vận chuyển dễ dàng [12]. f) Chất điều hoà sinh trưởng Các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật nuôi cấy mô. Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: Nồng độ sử dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó [9]. Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin, ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan. 16 Auxin Auxin được chia thành 2 loại: Auxin tự nhiên và auxin tổng hợp. auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3- acetic acid (IAA) và auxin tổng hợp là indole-3-butylric acid (IBA), 2,4-diclorophenolxy acetic acid (2,4-D), 1-napthalene acetic acid (NAA). Hoạt tính của các chất điều tiết sinh trưởng này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4-D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng do đó không ổn đinh trong môi trường nuôi cấy mô. NAA và 2,4-D không bị biến tính trong quá trình hấp tiệt trùng. Tuy nhiên chất 2,4-D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng rất nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus. Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính. Tùy loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay hình thành callus. Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,12mg/l tùy từng chất và đối tượng nuôi cấy. Cytokinin Nhóm chất cytokinin kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hóa chồi. Tỉ lệ auxin/cytokinin quyết định sự phân hóa của mô th eo hướng tạo rễ, chồi hay mô sẹo. Nồng độ sử dụng là 0,1-2mg/l. Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Các cytokinin thường được sử dụng là Benzyladenin (BA) hay Benzyl amino purin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyladenin (2 iP) và Zeatin (cytokinin tự nhiên). Trong các chất này, BAP và sau đó kinetin được dùng phổ biến nhất vì có hoạt tính cao và giá không đắt. Zeatin là một loại cytokinin có hoạt tính mạnh. Trong nhiều trường hợp, người ta còn sử dụng một số chất cytokinin khác như Diphenylurea, Thidiazuron (TDZ) trong đó TDZ là một cytokinin có hoạt tính cao thường dùng trong nuôi cấy nhân nhanh cây thân gỗ [12]. 17 g) Than hoạt tính Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy có tác dụng khử độc. Than hoạt tính cho vào môi trường để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol… trong trường hợp những chất đó gây ức chế sinh trưởng của mẫu nghiên cứu. Than hoạt tính làm thay đổi môi trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có nó vì thế có sự kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ. Than hoạt tính còn là một trong những chất chống oxy hóa tốt. Nhìn chung nó có ảnh hưởng trên 3 mặt: Hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy hoặc làm đen môi trường [12]. 2.3. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây khoai môn bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 2.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây khoai môn trên thế giới Năm 1999, Chand H và cs Nghiên cứu kĩ thuật nhân giống cây khoai môn bằng phương pháp nuôi cấy mô. Đưa ra kết quả: Môi trường tối ưu cho nhân nhanh là MS bổ sung kinetin 1,0mg/l + IAA 1,0mg/l. Môi trường ra rễ thích hợp cho cây khoai môn là MS bổ sung IBA 0,5mg/l [20]. Năm 2009, Deo, P. C. và cs đã nghiên cứu thành công quy trình tái sinh cây khoai môn. Tác giả đưa ra môi trường tạo mô sẹo, sau 20 ngày nuôi cấy trong tối sử dụng MS bổ sung 2,4 D 2,0mg/l, TDZ 1,0mg/l. Đồng thời tác giả cũng tìm ra được môi trường tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng: MS bổ sung IAA 0,1mg/l, BAP 0,05 mg/l [21]. 2.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây khoai môn ở Việt Nam Năm 2009, Trần thị Lệ và cs đã đưa ra quy trình nhân giống cây khoai môn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, kết quả như sau: Sử dụng HgCl2 0,1% trong 9 phút có hiệu quả khử trùng chồi mầm khoai môn là tốt nhất. Môi trường MS có bổ sung kinetin1mg/l + IAA 0,6 mg/l là thích hợp nhất cho việc tái sinh chồi từ mầm khoai môn. Môi trường MS bổ sung BAP 10mg/l và IBA 0,6mg/l thích hợp cho việc nhân nhanh chồi. Môi trường MS bổ sung 0,6mg/l α-NAA thích hợp nhất cho việc ra rễ đối với chồi khoai môn. Trồng cây con trên giá thể: Đất + tro trấu + phân vi sinh (3:1:1) kết hợp phun α-NAA 5mg/l trong 2 tuần đầu là thích hợp nhất ở giai đoạn vườn ươm [7]. 18 Năm 2009, Đặng Trọng Lương và cs đã nghiên cứu một số kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây khoai môn Bắc Kạn. Kết quả thu được: Môi trường thích hợp cho việc nhân chồi khoai môn Bắc Kạn là môi trường MS bổ sung một trong 3 tổ hợp chất kích thích sinh trưởng: Tổ hợp NAA 0,1mg/l và BAP 1-1,5 mg/l, tổ hợp NAA 0,1mg/l và kinetin 2mg/l hoặc tổ hợp TDZ 0,4mg/l và BAP 0,5 mg/l. Cả ba công thức này đều cho hệ số nhân chồi cao và chất lượng chồi tốt. Hệ số nhân chồi khoai môn trên các môi trường này lần lượt là 3,98-4,08, 3,64, 4,93. Môi trường thích hợp ra rễ của chồi khoai môn Bắc Kạn in vitro là môi trường MS bổ sung NAA 0,3mg/l. Trên môi trường 100% chồi khoai môn ra rễ với chiều dài rễ trung bình là 2,23 và số rễ trung bình là 12,3 rễ/chồi. Giá thể thích hợp cho việc thích nghi của cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên là giá thể cát đen hoặc giá thể đất phù sa, sơ dừa (tỷ lệ 8:2). Tỷ lệ cây sống trên hai giá thể sau 14 ngày lần lượt là 97,8 % và 99,7%, cây sinh trưởng và phát triển tốt [10]. Năm 2010, Nguyễn Quang Thạch và cs, nghiên cứu nhân giống cây khoai môn sọ bằng phương pháp in vitro. Chế độ khử trùng tối ưu cho mẫu mắt ngủ khoai môn sọ là chế độ khử trùng kép, sử dụng dung dịch HgCl2 0.1% trong 15 phút sau đó ngâm mẫu vào dung dịch Johnson trong 15 phút, với phương pháp đạt tỷ lệ mẫu sạch trên các giống đạt từ 66,67 – 86,67%. Trên nền môi trường MS + TDZ 1,5 mg/l cho hệ số nhân dao động từ 8,07 – 9,12 lần sau 8 tuần nuôi cấy. Môi trường ra rễ hiệu quả là môi trường MS không có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng. Việc tạo củ môn sọ in vitro trong điều kiện ánh sáng phòng thí nghiệm trên môi trường MS bổ sung 140g/l đường là tối ưu, có thể áp dụng để tạo củ môn sọ in vitro sạch bệnh [13].
- Xem thêm -