Tài liệu Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2012 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Chu Thanh Bình NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN PHƢƠNG NHUỆ Hà Nội – Năm 2012 2 Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Lê Gia Hy, TS. Nguyễn Phương Nhuệ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phí Quyết Tiến – trưởng phòng và các cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn các thày cô giáo Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Phân viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomyxin hydrochlorid công suất 1 kg/mẻ” mã số 032/2012/HĐĐTCNHD, thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghiệp Hóa dược đến năm 2020”. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Chu Thanh Bình 3 MỤC LỤC Lời cảm ơn …………………………………………………………............... Mục lục ……………………………………………………………….……... Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt…………………………………….... Danh mục các bảng ………………………………………………………….. Danh mục các hình vẽ, đồ thị………………………………………………... MỞ ĐẦU ……………………………………………………………...…….. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………...…..... 1 1.1. Chất kháng sinh vancomyxin ………………………………………… 1 1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin…………………………..... 1 1.1.2. Đặc tính của vancomyxin....................................................................... 2 1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin………………………………… 4 1.1.4. Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin……………………….. 7 1.2. Streptomyces orientalis và các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp vancomyxin …........................................................................................ 8 1.2.1. Streptomyces orientalis.......................................................................... 8 1.2.2. Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn……………………………….. 9 1.2.3. Nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất vancomyxin ………………. 11 1.3. Nghiên cứu duy trì và nâng cao hiệu suất chủng giống sản xuất vancomyxin………………………......………………………………... 14 1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất vancomyxin……...………............. 18 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……….. 21 2.1. Vật liệu .....………………... …………………………………………… 21 2.1.1. Chủng giống vi sinh vật …………………………………………......... 21 2.1.2. Hoá chất ……………………………………………………………..... 21 2.1.3. Thiết bị ………………………………………………………………... 21 2.1.4. Môi trƣờng …………………………………………………………… 22 2.1.5. Các dung dịch đệm 24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ……...…………………………………….... 24 2.2.1. Bảo quản giống ……………………………………………………….. 24 2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học …………………………………............... 25 4 2.2.3. Xác định sinh khối …………………………………………………..... 25 2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh……………………………………….... 25 2.2.5. Phƣơng pháp lên men............................................................................. 26 2.2.6. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm 28 2.2.7. Thu nhận tế bào trần xạ khuẩn………………………………………… 28 2.2.8. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh bằng xử lý UV và Nmetyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)…………………………... 29 2.2.9. Xây dựng đƣờng cong sống sót……………………………………….. 30 2.2.10. Xác định sự biến đổi hình thái khuẩn lạc và hoạt tính kháng sinh…. . 30 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………..... 32 3.1. Đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912................. 32 3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………….. 32 3.1.2. Đặc điểm hình thái…………………………………………………… . 33 3.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912.............. 34 3.3. Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912………... 36 3.3.1. Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S.orientalis 4912……………… 36 3.3.2. Nâng cao HTKS của chủng S. orientalis 4912 bằng phƣơng pháp gây đột biến dùng tia UV và N-metyl-N‟-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)…………………………………………………………………… 40 3.4. Một số đặc điểm sinh học của biến chủng Streptomyces orientalis 491281- 61………………………………………………..................... 46 3.5. Tối ƣu hóa quy trình lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61…. 48 3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống……………………………………... 48 3.5.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men……………………………………….... 48 3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61…………………………………… 48 3.5.4. Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 trong thiết bị lên men Bioflo…………. 57 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………….. 59 5 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Phổ kháng khuẩn của vancomyxin 3.1 Đặc điểm nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 32 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của chủng S. orientalis 4912 35 3.3 Ảnh hƣởng của nồng độ lysozym tới khả năng tạo TBT của chủng S. orientalis 4912 38 3.4 Ảnh hƣởng của nồng độ glyxin tới khả năng tạo TBT của chủng S. orientalis 4912 39 3.5 Ảnh hƣởng của nồng độ MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 41 3.6 Ảnh hƣởng của pH khi xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 41 3.7 Ảnh hƣởng của thời gian xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của chủng S. orientalis 4912 42 3.8 Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV và MNNG 44 3.9 Kết quả lên men các biến chủng sau khi đột biến 45 3.10 Một số đặc điểm sinh học của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 47 3.11 Khả năng sinh trƣởng của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 trên một số môi trƣờng 48 3.12 Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 49 3.13 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 50 7 6 3.14 Ảnh hƣởng của bột đậu tƣơng, glucoza và đƣờng saccaroza tới khả năng sinh tổng hợp vancomyxxin của biến chủng S. orientalis 491281-61 51 3.15 Ảnh hƣởng của CaCl2 đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 52 3.16 Ảnh hƣởng của CuSO4 đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 52 3.17 Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 54 3.18 Ảnh hƣởng của oxy hòa tan tới sinh trƣởng và sinh tổng hợp vancomyxin bởi biến chủng S.orientalis 4912-81-61 56 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc hóa học của vancomyxin 3 1.2 Các bƣớc tấn công thành tế bào vi khuẩn của vancomyxin 6 1.3 Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn 10 3.1 Khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 trên MT 48 33 3.2 Hình dạng bào tử của chủng S. orientalis 4912 33 3.3 Hình dạng khuẩn ty và chuỗi bào tử của chủng S. orientalis 4912 34 3.4 Hoạt tính kháng sinh kháng B. subtilis ATCC 6633 của chủng S. orientalis 4912 35 3.5 Tế bào trần chủng S. orientalis trên kính hiển vi 36 3.6 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tạo thành TBT của chủng S. orientalis 4912 37 3.7 Ảnh hƣởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng tạo thành TBT của chủng S. orientalis 4912 37 3.8 Khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử của chủng 4912 sau khi xử lý UV và MNNG 40 3.9 Hình dạng khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi chiếu tia UV tế bào trần 43 3.10 HTKS của biến chủng nhận đƣợc sau khi gây đột biến tế bào trần 45 3.11 Khuẩn lạc của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 (A) và chủng S. orientalis 4912 (B) 46 3.12 Ảnh hƣởng của độ thông khí tới khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 55 3.13 Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin bởi biến chủng S. orientalis 4912-81-61 trên thiết bị Bioflo 110 57 8 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BT Bào tử CKS Chất kháng sinh CMC Cacboxyl metyl xenluloza ĐKVVK Đƣờng kính vòng vô khuẩn HTKS Hoạt tính kháng sinh KS Kháng sinh KTCC Khuẩn ty cơ chất KTKS Khuẩn ty khí sinh MNNG N-metyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidin MT Môi trƣờng SK Sinh khối SKK Sinh khối khô SS Tế bào sống sót TBT Tế bào trần VSV Vi sinh vật 9 MỞ ĐẦU Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào những nƣớc nhập khẩu thuốc nhiều nhất thế giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD, trong đó kháng sinh chiếm thị phần tiêu thụ cao. Dự kiến đến năm 2020, cả nƣớc sẽ cần mỗi năm hơn 1,5 tỷ USD tiền thuốc, trong đó kháng sinh chiếm 30%. Theo Quyết định số 61/2007/QĐ- TTg ngày 07/5/2007 của Thủ tƣớng Chính phủ phê duyệt “Chương trình Nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020” thì mục tiêu của chƣơng trình là: “Nghiên cứu tạo ra những công nghệ có chất lƣợng cao phù hợp với điều kiện sản xuất ở trong nƣớc, làm chủ và ứng dụng công nghệ hiện đại của nƣớc ngoài, tiến tới chủ động việc sản xuất thuốc chữa bệnh trong nƣớc”. Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế, nhằm phát triển sản xuất kháng sinh ở Việt Nam là rất cần thiết. Vancomyxin là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo ra các loại kháng sinh bán tổng hợp với đặc tính chữa bệnh cao và chọn lọc. Chất kháng sinh này đƣợc sản xuất nhờ xạ khuẩn Streptomyces orientalis. Việc nâng cao khả năng sinh kháng sinh vancomyxin của chủng và hạ giá thành sản phẩm là rất cần thiết. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis” với các nội dung chính nhƣ sau: 1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S. orientalis 2. Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S. orientalis. 3. Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng và điều kiện lên men chủng S. orientalis. 10 Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mục tiêu: Nâng cao hoạt tính kháng sinh vancomyxin của xạ khuẩn S. orientalis 4912 hƣớng tới sản xuất kháng sinh này phù hợp với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và điều kiện môi trƣờng khí hậu của Việt Nam. 11 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN 1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin Vancomyxin là CKS tiêu biểu nhất trong nhóm KS glycopeptit, đƣợc Eli Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do xạ khuẩn S. orientalis phân lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh ra [45]. Ban đầu CKS này đƣợc gọi là hợp chất 05865, nhƣng sau đó đã đƣợc đặt tên là vancomyxin (do bắt nguồn từ “Vanquyshed” có nghĩa là “đánh bại”). Năm 1958, CKS này đƣợc đƣa vào điều trị thử nghiệm trên ngƣời. Năm 1964, Bộ Y tế Mỹ chấp thuận đƣa vancomyxin vào sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện. Khi CKS bán tổng hợp nhóm penixilin là metixilin đƣợc đƣa vào dùng trong chữa bệnh thì nhu cầu về vancomyxin đã giảm xuống trong một thời gian. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn S. auureus kháng metixilin vào 2 thập kỷ cuối thế kỷ XX đã làm kháng sinh glycopeptit đƣợc lựa chọn trong phác đồ điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kháng nhiều loại KS thông dụng gây ra. Lúc đó vancomyxin đƣợc ví nhƣ một loại thần dƣợc hay phƣơng thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng metixilin gây nên. Vancomyxin đã mở ra liệu pháp điều trị đầu tiên khi có sự nghi ngờ về khả năng kháng penixilin của các chủng Staphylococcus. Sau khi những nghi ngờ này đƣợc dẫn chứng bằng những số liệu cụ thể thì liệu pháp này đƣợc điều chỉnh cho phù hợp [18], [20], [22], [28], [36], [56]. Vancomyxin đƣợc sử dụng trong vòng hơn 30 năm mà không có những dẫn chứng đáng kể nào về sự kháng thuốc. Nhƣng sự lạm dụng trong việc dùng vancomyxin đã làm con ngƣời phải đối mặt trƣớc một thực tế là sự xuất hiện và gia tăng ngày càng nhiều của các chủng vi khuẩn kháng lại CKS từng đƣợc xem nhƣ hy vọng cuối cùng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm hiểm nghèo. Chủng vi sinh vật kháng vancomyxin đầu tiên đƣợc công bố vào cuối những năm 1980 và sau đó số lƣợng này tăng lên không ngừng. Do sự xuất hiện của những chủng vi sinh 12 vật kháng vancomyxin, nhu cầu tìm kiếm các CKS thay thế với mục đích ngăn chặn mối hiểm họa cho sức khỏe cộng đồng luôn luôn đƣợc thúc đẩy. Tuy nhiên, kể từ khi đƣợc phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomyxin đã luôn lôi cuốn sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành khác nhau. Kháng sinh này đã đƣợc xem nhƣ cấu trúc sinh học chủ yếu, từ đó biến đổi bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế với những đặc tính ƣu việt [37], [52], [58]. Dạng vancomyxin HCl đầu tiên đã đƣợc Eli Lilly đƣa ra thị trƣờng dƣới tên thƣơng mại là Vancoxyn. Giấy chứng nhận quyền sử dụng sản phẩm này hết hạn vào đầu những năm 1980. Ngày nay, các dạng thuốc mang đặc tính chung của vancomyxin đƣợc đƣa ra dƣới nhiều tên thƣơng mại khác nhau. Năm 2004, Eli Lilly đã đăng ký bản quyền cho Vancoxyn với ViroPharma tại Mỹ, Flynn Pharma tại Anh và Aspen Pharmacare tại Úc [58]. Vancomyxin không những là một loại thuốc kháng sinh sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng rất có hiệu quả, mà còn là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo các loại kháng sinh bán tổng hợp đang rất đƣợc quan tâm. Ngày nay, tầm quan trọng của vancomyxin vẫn đƣợc khẳng định, chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện khi kết hợp với các CKS nhóm - lactam [10], [69]. Cho đến nay, trên thị trƣờng ít nhất đã có 10 biệt dƣợc chứa vancomyxin do nhiều hãng thuốc nổi tiếng trên thế giới sản xuất nhƣ: Diatraxin (Dista, Tây Ban Nha), Hanomyxin (Samjin, Hàn Quốc), Lyphoxyn (Fujisawa, Mỹ), Vancoxyn (Lilly, Mỹ), Vancoxyna (Lilly, Mỹ), Vancoled (Lederle, Mỹ), Vancor (Andria, Mỹ), Vancolin, Vancomyxin (Dakota Pharm, Pháp), Voncon (Lilly, Mỹ) [72]. 1.1.2. Đặc tính của vancomyxin Vancomyxin có công thức tổng quát C66H75Cl2N9O24. Trong phân tử có chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, cấu trúc hóa học đƣợc thể hiện ở hình 1.1 [9], [16]. Vancomyxin có tổng số 18 trung tâm lập thể, với 9 trung tâm lập thể nằm trên lõi glycol và các trung tâm còn lại nằm tại các nhóm cacbonhydrat [58]. Cấu trúc hóa học lập thể quyết định cơ chế hoạt động của vancomyxin. Vancomyxin có một chuỗi hexapeptit đã glycozyl hóa, chứa 7 aminoaxit gồm các loại nhƣ chloro-β- 13 hydroxytyrozin, p-hydroxylphenylglyxin, N-metylleuxin và axit aspartic tạo thành bộ khung phân tử vững chắc [13], [43], [53], [64]. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của vancomyxin [58], [71] Trọng lƣợng phân tử của vancomyxin là 1449,3 Da. Các phân tử vancomyxin thƣờng không kết hợp với nhau nên vancomyxin là một chất vô định hình, không màu sắc và có tính chất lƣỡng tính [40]. Vancomyxin ở dạng clohydrat hòa tan rất tốt trong nƣớc, hòa tan vừa phải trong methanol, hòa tan ít trong rƣợu bậc cao, clorofoc, etylaxetat, butylaxetat, axeton và este. Giá trị pKa của vancomyxin là 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7. Theo những phân tích cơ bản đã chỉ ra rằng phân tử vancomyxin chứa khoảng 1,17% nitơ và 4,26% clo. Vancomyxin bền trong nƣớc ở pH = 3,0-7,0 và nhiệt độ 37oC trong 6 ngày, sau 6 ngày khả năng ức chế vi khuẩn còn 10%. Ở nhiệt độ phòng (khoảng 22oC) độ bền sẽ bị giảm sau 26 ngày. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ nâng nhẹ (trên 22oC) thì sự phân hủy có thể quan sát đƣợc [4], [40]. CKS này có thể hòa tan trong nƣớc tại pH 7 (khoảng 1 mg/ml) và hòa tan tốt hơn ở pH kiềm (khoảng pH 8,5 – 9,0). Vancomyxin bền ở dạng rắn và trong dịch lỏng tại nhiệt độ lớn hơn 70oC trong khoảng pH từ 2,5-9,0. Nhờ đặc điểm lƣỡng tính, vancomyxin phản ứng với axit vô cơ nhƣ: HCl, H2SO4, H3PO4 và các axit khác… [36], [40]. Vancomyxin có 3 hệ thống vòng, 2 nhóm cacbonhydrat, 5 vòng thơm, 9 nhóm OH trong đó có 3 nhóm phenol, 7 liên kết amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7,2. Vancomyxin khác 14 với các kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit khác bởi cấu trúc phức tạp. Sự khác biệt này thể hiện trong cấu trúc của vancomyxin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai (nhƣ đƣờng glucoza …) để tạo nên các vancomyxin bán tổng hợp có hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng. Đây là hƣớng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ KS mới có hoạt tính cao và chọn lọc [34], [58]. Theo “Sổ tay Kháng sinh” của Navashin, S.M. & Fomina, I.P., 1974, 1 mg vancomyxin dạng sunphat chuẩn cần đạt 1007 đơn vị hay một đơn vị vancomyxin dạng sunphat tƣơng đƣơng 0,993 mcg. Khi tiêm tĩnh mạch chuột nhắt trắng theo chuẩn dƣợc, độ nhạy độc của vancomyxin HCl biểu hiện ở LD50 (liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) đƣợc tìm thấy trong khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg. Ngƣời ta thƣờng sử dụng vancomyxin khi biết hoặc nghi ngờ về khả năng nhiễm trùng máu, hoặc sử dụng cho các bệnh nhân bị viêm xƣơng, viêm khớp, nhiễm trùng da và mô mềm [4], [10], [56]. Tác dụng của vancomyxin cao hơn khi kết hợp với các CKS khác (ví dụ KS nhóm β-lactam) trong điều trị một số loại vi sinh vật có thể thay đổi cấu trúc thành tế bào để kháng lại vancomyxin [28], [58]. 1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin Vancomyxin và các kháng sinh nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi sinh vật thông qua việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào. Vị trí mà các tác nhân tấn công vào thành tế bào là lớp peptidoglycan. Đây là lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó mà lớp peptidoglycan bị phá hủy thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh động, kết qủa tế bào bị chết [33]. Vancomyxin ức chế giai đoạn cuối của quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan qua 3 giai đoạn [58]: - Giai đoạn 1: Vancomyxin không xâm nhập vào tế bào chất để ức chế các bƣớc sinh tổng hợp thành tế bào tiếp theo mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế bào chất. Sự ức chế các chất màng trên đã ngăn cản chu trình lặp lại các chất mang C55 lipit làm gia tăng sự tích lũy tiền chất của tế bào chất. Đây là một cơ chế không 15 thƣờng xuyên xảy ra đối với một tác nhân kháng vi sinh vật bao gồm việc sử dụng cơ chất thay vì điều khiển hoạt tính của enzyme sinh tổng hợp. - Giai đoạn 2: Nhờ cấu tạo hình xoắn của phân tử mà gần đây ngƣời ta đã phát hiện ra khả năng kháng vi sinh vật của vancomyxin tác động ngƣợc lại với sự mẫn cảm penixilin. Ở màng ngoài tế bào vi khuẩn, enzyme transglycosylaza bổ sung các mảnh disacaryl pentapeptit để hình thành lớp peptidoglycan của tế bào. Sau đó, enzyme transpeptidaza nối các peptit ở bên trong với các sợi của lớp peptidoglycan ở bên ngoài bề mặt của màng tế bào. Đích tác dụng của vancomyxin là gắn với các peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt động của enzyme. Khi đó, phân tử vancomyxin có dạng hình chiếc cốc liên kết với ái lực cao nhờ bề mặt lõm của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-DAlanin của cầu liên kết chéo peptit chƣa nối với pentapeptit. - Giai đoạn 3: Liên kết của vancomyxin với chuỗi lipit-PP-Glc NACpentapeptit là liên kết vật lý tƣơng đối bền vững đã ngăn cản tác động tiếp theo của transglycosylaza/transpeptidaza. Vancomyxin không tấn công đƣợc disacaryl pentapeptit mà làm giảm các liên kết đồng hóa trị, giảm tính bền cơ học của lớp peptidoglycan và làm cho tế bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải nhờ những thay đổi xảy ra do áp suất thẩm thấu. Vancomyxin có hoạt tính mạnh với các cầu khuẩn và vi khuẩn Gram (+) nhƣ: Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Enterococcus và xoắn khuẩn (Bảng 1.2) [58], [62]. CKS này có khả năng tiêu diệt tốt vi khuẩn đang ở trong giai đoạn sinh sản, pH tối ƣu là 8,0 và hoạt tính giảm mạnh khi pH dƣới 6,0. Điều này đƣợc giải thích bởi hai nguyên nhân: một là do sự khác biệt của cấu trúc thành tế bào giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Gram (+) gồm có lớp peptidoglycan dầy, axit teichoic và axit teichoronic, có thể có hoặc không có màng protein hoặc polysaccarit bao quanh. Trong khi đó thành tế bào vi khuẩn Gram (-) gồm có lớp peptidoglycan mỏng, lipopolysacarit, lipoprotein, photpholipit và protein. Trong các tế bào vi khuẩn Gram (-), lớp peptidoglycan và lớp màng bên trong đƣợc bao bọc bởi một lớp màng ngoài ngăn 16 chặn sự khuếch tán vancomyxin đến lớp peptidoglycan. Ngƣợc lại, lớp peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+) đƣợc xác định trên bề mặt ngoài của thành tế bào và do đó nó mẫn cảm với kháng sinh vancomyxin. Hai là có thể do phân tử glycopeptit là những phân tử lớn, chúng không thể hòa tan lớp lipit của màng tế bào vi khuẩn Gram (-), do đó khó có thể xâm nhập đƣợc vào lớp bên trong của thành tế bào [40], [58], [71] Hình 1.2. Các bƣớc tấn công thành tế bào vi khuẩn của vancomyxin [71] 17 Bảng 1.1. Phổ kháng khuẩn của vancomyxin [58], [62] Vi sinh vật Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Streptococcus viridians Streptococcus faecalis Corynebacterium diphtheria Actinomyces israeli Bacillus anthracis Nồng độ ức chế Vi sinh vật tối thiểu (mcg/ml) 0,2 – 6,2 Haemophilus influenza 0,2 – 0,3 Clostridium sp Nồng độ ức chế tối thiểu (mcg/ml) 100 và hơn 100 0,3 – 20 100 và hơn 100 0,3 – 30 Escherrichia coli Klebssiellae 0,3 – 1,0 Pasteurllae 100 và hơn 100 1,5 – 4,0 Shigellae 100 và hơn 100 2,5 Salmonella 100 và hơn 100 0,3 - 0,5 100 và hơn 100 Ngoài ra, vancomyxin còn có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp ARN. Mặt khác, cũng nhƣ penixilin, nó có thể tác dụng thẳng lên màng tế bào chất theo cơ chế tác dụng giống nhƣ ristomyxin và baxitraxin. Có thể do cơ chế tác động kép này mà sự kháng vancomyxin ít xảy ra. Những vi sinh vật nhạy cảm với vancomyxin thƣờng bị tiêu diệt ở nồng độ từ 1-5 mcg/ml, kể cả những chủng kháng metixilin [53] 1.1.4. Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin Vancomyxin từng đƣợc xem nhƣ phƣơng thuốc cuối cùng, chỉ sử dụng sau khi việc điều trị bệnh bằng các kháng sinh khác không có hiệu quả. Không lâu sau khi đƣợc phát hiện, vancomyxin đƣợc xếp vào danh mục những loại dƣợc phẩm hàng đầu và đƣợc đƣa vào dùng rộng rãi trong bệnh viện để điều trị các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các vi sinh vật kháng KS nhóm β-lactam gây nên [15], [58] Vancomyxin đặc biệt có hiệu quả cao khi dùng trong điều trị các bệnh do MRSA gây nên, vi khuẩn này là mối nguy hiểm với bệnh nhân cao tuổi, bệnh nhân sau phẫu thuật và những ngƣời có hệ miễn dịch suy giảm [30]. Vancomyxin còn đƣợc chỉ định để điều trị cho các bệnh nhân dị ứng với penixilin, các bệnh nhân 18 không thể sử dụng các loại thuốc nhƣ penixilin hoặc cephalosporin và sử dụng khi những chủng vi sinh vật mẫn cảm với vancomyxin. Dƣới tác dụng của vancomyxin tính bền vững vốn có của các cầu khuẩn Gram (+) đối với penixilin không phát hiện thấy [58]. Mặc dù có nhiều CKS chữa trị các bệnh do vi khuẩn Gram (+) gây ra đã đƣợc công bố trong những năm gần đây, nhƣng vancomyxin vẫn là kháng sinh không thể thay thế trong việc chữa trị những bệnh do Staphyloccus, Enterococcus và các chủng vi sinh vật kháng nhiều loại kháng sinh thông dụng gây nên [5], [30]. Vancomyxin có tác dụng cao khi dùng phối hợp hoặc thay thế kháng sinh nhóm β-lactam để chữa các bệnh nhiễm trùng do các loại vi khuẩn đã nhờn với kháng sinh thông dụng gây nên nhƣ: bệnh nhiễm trùng máu, viêm xƣơng, viêm đƣờng hô hấp … [17], [34]. Ngoài ra, CKS này còn có tác dụng điều trị bệnh do vi khuẩn bạch hầu gây nên [41], [45]. Các chủng Staphylococcus có khả năng đề kháng với penixilin G, streptomyxin, tetraxyclin, macrolit và các loại khác, nhƣng mẫn cảm với vancomyxin [36], [44]. 1.2. Streptomyces orientalis VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI SINH TỔNG HỢP VANCOMYXIN 1.2.1. Streptomyces orientalis Streptomyces orientalis có khả năng sinh CKS vancomyxin. Lúc đầu, khi mới phát hiện, xạ khuẩn này có tên là Amycolatopsis orientalis, đƣợc xếp vào chi Nocardia, sau đó loài này đƣợc phân loại lại và xếp vào chi Streptomyces, đặt tên là S. orientalis, tuy nhiên, nhiều tài liệu vẫn gọi tên truyền thống là Amycolatopsis orientalis. Cho đến nay, vẫn chỉ phát hiện thấy kháng sinh vancomyxin từ loài xạ khuẩn này [23], [26], [31], [35], [51]. S. orientalis đƣợc phân biệt với các loài khác thuộc chi Streptomyces bởi các đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý, sinh hóa… [23]. Hình thái hiển vi: Khi nuôi trên môi trƣờng thạch tổng hợp, quan sát thấy khuẩn ty khí sinh dạng thẳng hoặc tạo thành các chuỗi nhánh không đồng đều. Bào tử của chủng có dạng từ hình trụ đến hình trứng, có kích thƣớc 0,7-1,0 x 1,4-1,8 µm, có chuỗi bào tử hình xoắn rõ ràng. 19 Hình dáng khuẩn lạc lồi cao hoặc hơi lồi, khô, xù xì, tạo rãnh, có vùng khuẩn ty màu trắng nhạt rất mỏng bao quanh, mặt dƣới không màu. Đặc điểm nuôi cấy riêng: khi nuôi trên môi trƣờng thạch tổng hợp, khuẩn ty cơ chất có màu vàng kem sau 7 ngày và chuyển sang màu vàng sẫm sau 14 ngày, khuẩn ty khí sinh có màu trắng sau 7 ngày và có màu xám sau 14 ngày nuôi do có sự hình thành bào tử, không có sắc tố tan trên môi trƣờng nuôi cấy. Trong tự nhiên, sự phát triển của vi sinh vật, trong đó có xạ khuẩn, liên quan mật thiết đến nguồn thức ăn và mối liên hệ của chúng với nhau. Mối quan hệ đối kháng giữa các vi sinh vật đã đƣợc Pasteur (1887) khẳng định là hiện tƣợng phổ biến. Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt. Kháng sinh là trƣờng hợp riêng của tính đối kháng, hiện tƣợng một vi sinh vật với sản phẩm trao đổi chất của mình tạo điều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật khác [8], [20], [23]. Cơ chế hình thành CKS: - Đối với các CKS tƣơng tự với các chất trao đổi sơ cấp (axit amin, nucleotit, coenzyme) thì sự sinh tổng hợp giống nhƣ sự sinh tổng hợp của các chất trao đổi sơ cấp. - Đối với kháng sinh đƣợc tạo ra bằng con đƣờng polymer hóa bao gồm: các chất là dẫn xuất polypeptit đƣợc tạo thành bằng cách ngƣng tụ axit amin, mạch polypeptit đƣợc tạo thành có thể bị cải biến trong các phản ứng tiếp theo (sự ngƣng tụ axit amin không theo cơ chế cổ điển sinh tổng hợp protein); các chất đƣợc tạo thành từ các đơn vị axetat và propionate thì theo con đƣờng tổng hợp axit béo; các chất tecpen đƣợc tạo thành từ các đơn vị izopren (chỉ do khuẩn ty sinh ra); đối với các chất aminoglucozit thì tạo thành bằng con đƣờng ngƣng tụ các phân tử đƣờng, axit amin thông thƣờng và các rƣợu amin mạch vòng [14], [27], [46]. 1.2.2. Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn Cũng giống nhƣ con đƣờng sinh tổng hợp KS nhóm glycopeptit, vancomyxin đƣợc tổng hợp bằng cách ngƣng tụ các đơn vị nhỏ mà mỗi đơn vị này lại đƣợc tạo thành từ các con đƣờng sinh tổng hợp riêng (Hình 1.3). 20