Tài liệu Nghiên cứu một số gen liên quan đến khả năng kháng carbapenem của các chủng acinetobacter baumannii phân lập tại bệnh viện phổi trung ương​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- LƯU THỊ NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- LƯU THỊ NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN PHỔI TRUNG ƯƠNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07. LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. PHẠM BẢO YÊN Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phạm Bảo Yên, người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn cao học. Xin chân thành cám ơn cô vì đã luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Trường đại học khoa học tự nhiên, các cán bộ Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Khoa Vi sinh Bệnh viện Phổi Trung Ương cùng các thành viên nhóm nghiên cứu của đề tài Q6.17.60 đã tạo điều kiện và môi trường cho tôi thực hiện nghiên cứu. Xin cảm ơn các bạn sinh viên trong Phòng Thí nghiệm Enzyme học và Phân tích hoạt tính sinh học đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt những kiến thức quý báu và hỗ trợ cho tôi hoàn thành chương trình đào tạo thạc sĩ. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà Nội đã luôn tạo điều kiện, cổ vũ và động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Mặc dù đã cố gắng nỗ lực, nhưng luận văn không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế. Rất mong nhận được những đóng góp từ thầy cô, các nhà khoa học để tôi tiếp tục hoàn thiện công trình nghiên cứu. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 09 tháng 12 năm 2019 Học viên Lưu Thị Ngọc Hân DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ Chữ viết tắt, ký hiệu A. baumannii Acinetobacter baumannii AMEs Aminoglycoside-modifying enzymes CDC Centers for Disease Control and Prevention CTX-M Cefotaxime hydrolyzing capabilities DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate ECDC European Centre for Disease Prevention and Control Fw Forward GES Guiana extended spectrum ICU Intensive care unit IMP Imipenemase KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase LAMP Loop-mediated isothermal amplification LPS Lipopolysaccharide MATE Multidrug and toxic compound extrusion MDR Multidrug-resistant MFS Major facilitator superfamily MIC Minimum Inhibitory Concentration OXA Oxacillinase PBP Penicillin-Binding Protein PCR Polymerase Chain Reaction PDR Pandrug-resistant RNA Ribonucleic acid RND Resistance-nodulation-division Rv Reverse SHV Sulfhydryl Variable SIM Seoul Imipenemase SMR Small multidrug resistance TEM Temoneira VAP Ventilator Associated Pneumonia VEB Vietnam extended-spectrum β-lactamase VIM Verona Imipenemase WHO World Health Organization XDR Extensively drug-resistant DANH MỤC HÌNH Hình 1: Các vị trí tác dụng của kháng sinh …………………………………………4 Hình 2: Cấu trúc hóa học của carbapenem………………………………………….9 Hình 3: Hình ảnh tế bào vi khuẩn A. baumannii …………………………………..12 Hình 4: Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường thạch……………………………13 Hình 5: Các cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii…………………………..19 Hình 6: Nguyên tắc của kỹ thuật multiplex PCR…………………………………..25 Hình 7: Chu trình nhiệt đã được tối ưu của phản ứng multiplex PCR……………..31 Hình 8: Kết quả của phản ứng multiplex PCR……………………………………..33 Hình 9: Biểu đồ tỷ lệ % của các gen nghiên cứu…………………………………..34 Hình 10: Tỷ lệ % kháng carbapenem của các mẫu A. baumannii nghiên cứu…….40 Hình 11: Mức độ kháng của A. baumannii với các kháng sinh nhóm beta-lactam .42 Hình 12: Mức độ kháng của A. baumannii với một số kháng sinh khác…………..43 Hình 13: Kết quả giải trình tự gen OXA-51 với mồi xuôi và so sánh kết quả giải trình tự với ngân hàng gen…………………………………………………...…….47 Hình 14: Mức độ tương đồng về nucleotide……………………………………….49 Hình 15: Mức độ tương đồng về acid amin………………………………………..50 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học………………………………..3 Bảng 2: Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii…………19 Bảng 3: Bảng danh mục các kháng sinh được sử dụng làm kháng sinh đồ để đánh giá mức độ nhạy cảm của Acinetobacter spp…………………………………………....29 Bảng 4: Trình tự các cặp mồi cho các gen OXA-23, OXA-51, VIM và IMP………..30 Bảng 5: Các thành phần tham gia phản ứng multiplex PCR………………………..31 Bảng 6: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-51 trên thế giới và Việt Nam.……..34 Bảng 7: Thống kê tần suất xuất hiện gen OXA-23 trên thế giới và Việt Nam ……….36 Bảng 8: Tổng hợp các tổ hợp gen đích……………………………………………...39 Bảng 9: Kết quả PCR và kháng sinh đồ của các mẫu A. baumannii…….…………44 Bảng 10: Kết quả PCR và kháng sinh đồ một số chủng được giải trình tự………….48 Bảng 11: Sự thay đổi nucleotide và acid amin so với trình tự tham chiếu………….48 MỤC LỤC MỞ ĐẦU………………………………………………………...………………….1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Kháng sinh …………………………………...……………………………...3 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh và phân loại theo cấu trúc hóa học…………………..3 1.1.2. Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh……………………………………...4 1.1.2.1. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein…….……….…….…………………5 1.1.2.2. Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic………………..………………..5 1.1.2.3. Kìm hãm các quá trình trao đổi chất……………………………………..…..6 1.1.2.4. Tác động lên thành tế bào vi khuẩn……………………………………..……6 1.1.2.5. Tác động lên màng tế bào vi khuẩn……………………………………….…7 1.1.3. Kháng sinh nhóm beta-lactam………………………………………………..7 1.1.3.1. Penicilin ………………………………………………………….………....8 1.1.3.2. Cephalosporin ..…………………………………………………………..…8 1.1.3.3. Monobactam……………………………………………………...………....9 1.1.3.4. Carbapenem …………………………………………………………...……9 1.1.3.5. Nhóm ức chế beta-lactamase…………………………………………….....10 1.1.4. Phối hợp kháng sinh trong điều trị ..…………………………………………10 1.2. Vi khuẩn Acinetobacter baumannii…………………………..…………….11 1.2.1. Giới thiệu chung và vị trí phân loại…………………………………………11 1.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa………………………………………12 1.2.3. Dịch tễ học……………………………………………………………..……13 1.2.4. Thực trạng kháng kháng sinh của A. baumannii………………………..…...15 1.2.4.1. Trên thế giới………………………………………………………………...15 1.2.4.2. Tại Việt Nam………………………………………………………………..16 1.2.4.3. Các cơ chế kháng kháng sinh của A. baumannii……………………………17 1.2.4.4. Tần suất xuất hiện các gen carbapenemase…………………………………19 1.2.4.5. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ kháng kháng sinh của A. baumannii…………21 1.3. Các phương pháp nghiên cứu A. baumannii ………………………….…… 22 1.3.1. Phương pháp nuôi cấy………………………………………………………22 1.3.2. Phương pháp sinh học phân tử………………………………………………24 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu ……………………………………………………..27 2.2. Phương pháp nghiên cứu ………………………………………………….27 2.2.1. Nuôi cấy và định danh A. baumannii từ mẫu bệnh phẩm …………..………27 2.2.1.1. Nguyên tắc……………………………………………………………..…..27 2.2.1.2. Hóa chất sinh phẩm………………………………………………………...27 2.2.1.3. Các bước tiến hành…………………………………………….…………...27 2.2.2. Tách DNA …………………………………………………………..………28 2.2.3. Kháng sinh đồ ………………………………………………………………28 2.2.4. Multiplex PCR ……………………………………………………………...30 2.2.4.1. Hóa chất, thiết bị …………………………………………………………...30 2.2.4.2. Tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR……………………………………….30 2.2.4.3. Các cặp mồi sử dụng ……………………………………………………….29 2.2.4.4. Thành phần phản ứng………………………………………………………31 2.2.4.5. Chu trình nhiệt ……………………………………………………………..31 2.2.4.6. Điện di ……………………………………………………………………..31 2.2.5. Phân tích kết quả…...………………………………………………….…….32 2.2.5.1. Phân tích trình tự DNA ………………………………..…………………...32 2.2.5.2. Xử lý số liệu…….……………………………………………..………...…32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh của A. baumannii tại Bệnh viện Phổi Trung ương ……….………………………………………….33 3.1.1 Tần suất xuất hiện các gen đơn……………………………………………….33 3.1.2 Sự có mặt của các tổ hợp gen …………………………………………………38 3.2. Phân tích mức độ kháng kháng sinh của các mẫu A. baumannii thu được…39 3.2.1. Khả năng kháng beta-lactam carbapenem …………………………………..39 3.2.2. Các nhóm beta-lactam khác ………………………………………………...41 3.2.3. Các kháng sinh khác………………………………………………………...42 3.2.4. Đánh giá chung……………………………………………………………...43 3.3. So sánh kết quả về sự có mặt của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ và xác định mối liên quan ……………………………..….44 3.4. Phân tích trình tự một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới………………………………………………………………………….47 3.4.1. Phân tích trình tự nhằm khẳng định độ chính xác của phương pháp……….47 3.4.2. Phân tích những biến đổi trong trình tự của các chủng thu được và một số chủng khác trên thế giới……………………………………………………… 48 KẾT LUẬN…………………………………...…………………………………...51 KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO………...…………….52 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………..…53 MỞ ĐẦU Kháng sinh là một trong những phát hiện vĩ đại trong lịch sử loài người. Với khả năng kìm hãm và tiêu diệt tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất là vi khuẩn, kháng sinh đã trở thành loại thuốc không thể thiếu trong công tác điều trị ở mọi nơi trên thế giới. Việc sử dụng kháng sinh không chỉ cứu sống bệnh nhân mà còn giúp ngăn ngừa các dịch bệnh bùng phát trên toàn cầu. Tuy nhiên, trong nhiều năm trở lại đây, tình hình kháng kháng sinh đang ngày càng gia tăng với tốc độ nhanh chóng và biến đổi phức tạp. Các vi khuẩn không ngừng biến đổi để thích nghi và đề kháng lại các loại kháng sinh. Hiện nay trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều chủng đa kháng thuốc thậm chí có những chủng đã trở thành siêu kháng và toàn kháng. Điều này đã và đang trở thành một thách thức lớn trong công tác điều trị bệnh ở các bệnh viện trên mọi châu lục. Năm 2017, tổ chức Y tế thế giới WHO đưa ra danh sách 12 loài vi khuẩn nguy hiểm nhất với khả năng kháng thuốc kháng sinh mạnh và cần phải nghiên cứu phát triển một loại kháng sinh mới để đối phó với các tác nhân này. Trong đó ba loại vi khuẩn có khả năng kháng carbapenem đứng đầu danh sách bao gồm: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeroginosa, Enterobacteriaceae . A. baumannii đang được xếp ở vị trí số một với mức báo động cao tại nhiều nơi trên thế giới với khả năng kháng với hầu hết kháng sinh kể cả những kháng sinh phổ rộng mạnh nhất. A. baumannii có nhiều cơ chế kháng kháng sinh như tổng hợp beta-lactamase, bơm đẩy ngược thuốc ra bên ngoài tế bào, chỉnh sửa cấu trúc aminoglycoside, thay đổi tính thấm thành tế bào vi khuẩn, thay đổi vị trí đích của thuốc. Trong đó cơ chế kháng beta-lactam dựa trên khả năng thủy phân và ức chế các kháng sinh của các betalactamase đóng vai trò quan trọng nhất đối với tính đa kháng sinh ở A. baumannii, đặc biệt đối với carbapenem-liệu pháp cuối cùng trước khi phải chỉ định colistin. Ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung vào mức độ kháng của A. baumannii đối với các kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị dựa trên kháng sinh đồ và thống kê tần suất của các chủng gây bệnh hoặc đưa ra tần suất xuất hiện các gen mà chưa xem xét đối mối liên quan giữa các yếu tố này. Tuy nhiên, với tình hình kháng kháng sinh mạnh của vi khuẩn do sự lan rộng của các gen mã hóa carbapenemase, việc kết hợp phân tích giữa mối liên quan của kháng sinh đồ với sự 1 có mặt của các gen liên quan đến tính nhạy cảm với kháng sinh là rất cần thiết trong hỗ trợ, chẩn đoán và điều trị bệnh. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số gen liên quan đến khả năng kháng carbapenem của các chủng Acinetobacter baumannnii phân lập tại Bệnh viện Phổi Trung ương” với các mục tiêu: 1. Thống kê tần suất có mặt của các gen kháng kháng sinh của A. baumannii tại Bệnh viện Phổi Trung ương. 2. Phân tích mức độ kháng kháng sinh của các mẫu A. baumannii thu được. 3. Nghiên cứu mối liên quan giữa khả năng kháng carbapenem với sự có mặt bốn gen đích mã hóa carbapenemase. So sánh kết quả về sự có mặt của các gen và khả năng kháng kháng sinh dựa trên kháng sinh đồ. 4. Phân tích tính trình tự của một số mẫu để khẳng định độ chính xác của phương pháp và tìm hiểu sự khác biệt giữa các chủng thu được với các chủng khác trên thế giới. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Kháng sinh 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh và phân loại theo cấu trúc hóa học Kháng sinh (antibiotics) là những chất kháng khuẩn (antibacterial substances) được tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes), có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác [58]. Theo quan điểm hiện đại, kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn gốc tổng hợp như các sulfonamid và quinolon. Hiện nay, có nhiều cách để phân loại kháng sinh nhưng cách phân loại phổ biến nhất là dựa trên cấu trúc phân tử, cơ chế tác động và phổ hoạt động của từng kháng sinh. Một vài cách phân loại khác trong đó có thể bao gồm đường đưa thuốc (đường tiêm, đường uống hay đường đặt trực tràng…). Kháng sinh trong cùng một nhóm cấu trúc sẽ thể hiện các đặc tính tương tự như nhau về hiệu quả tác dụng, độc tính và cả tác dụng không mong muốn. Bảng 1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học [58,20] STT 1 Tên nhóm Beta-lactam Đại diện Phân nhóm Penicilin penicilin G-V, amoxicilin, ampicilin … Cephalosporin cephalexin, cefixim, cefepim, ceftriaxon, … Carbapenem imipenem, doripenem, meropenem, ertapenem Monobactam aztreonam Các chất ức chế beta- sulbactam, tazobactam, acid clavulanic … lactamase 2 Aminoglycosid gentamycin, tobramycin, amikacin … 3 Macrolid erythromycin, spiramycin, azithromycin … 4 Lincosamid lincomycin, clidamycin… 5 Phenicol chloramphenicol 3 6 Tetracyclin tetracyclin, doxycyclin, mynocyclin 7 8 Peptid Glycopeptid vancomycin, teicoplanin Polypeptid polymyxin, colistin Lipopeptid daptomycin Quinolon ciprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin… 9 Sulfamide sulfamethoxazole, sulfanilid sulacetamide … 10 Các nhóm kháng metronidazole, sinh khác griseofulvin … nystatin, 1.1.2. Cơ chế và vị trí tác dụng của kháng sinh Hoạt tính kháng khuẩn của hầu hết các nhóm kháng sinh đều liên quan trực tiếp đến các đặc tính điển hình của cấu trúc vi khuẩn hoặc các quá trình trao đổi chất của chúng. Để tìm hiểu vị trí tác dụng của một loại kháng sinh cụ thể trước hết phải nắm được cấu trúc của kháng sinh và nơi nó có thể gắn kết (Hình 1). Hầu hết các đích của kháng sinh thường liên quan trực tiếp đến tế bào vi khuẩn thông qua việc ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào hoặc ức chế hình thành vật liệu di truyền [16]. Hình 1. Các vị trí tác dụng của kháng sinh [16] 4 1.1.2.1. Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein Kháng sinh ngăn cản sự khởi đầu quá trình tổng hợp protein bằng cách gắn vào tiểu đơn vị ribosom 30S và 50Svới các cơ chế bao gồm: Liên kết không đảo ngược với ribosom 30Svà ngăn cản phức hệ khởi đầu 30S (30SmRNA-tRNA): Các aminoglycosid (diệt khuẩn). Liên kết có thể đảo ngược với ribosom 30S và ức chế quá trình liên kết aminoacyl-tRNA với vị trí tiếp nhận trên ribosom 70S: Các tetracycline (kháng khuẩn). Cản trở có thể đảo ngược quá trình tương tác giữa mRNA và ribosom 30S mà không gây sai sót trong dịch mã mRNA như các aminoglycoside: spectinomycin (kháng khuẩn). Liên kết với ribosom 50S ức chế hoạt tính của peptidyl transferase: lincomycin, clindamycin, cloramphenicol (kháng khuẩn) Ức chế quá trình chuyển vị trí của peptidyl tRNA từ vị trí A đến P trên ribosom bằng cách liên kết với ribosom 50S-23S RNA: các marcrolid (kháng khuẩn) Ngoài cơ chế trên, các kháng sinh còn có khả năng tác động lên quá trình kéo dài chuỗi peptid nhờ vào liên kết với yếu tố kéo dài G (EF-G) và ức chế giải phóng EF-G từ phức hệ EF-G/GDP: acid fusidic (kháng khuẩn) 1.1.2.2. Ức chế quá trình sinh tổng hợp acid nucleic Kháng sinh có thể tác động quá trình sinh tổng hợp acid nucleic bao gồm cả sinh tổng hợp RNA và DNA. Quá trình ức chế sinh tổng hợp RNA nhờ vào liên kết với các RNA polymerase độc lập với DNA và ức chế sự khởi đầu tổng hợp RNA: rifampin, rifamycin, rifampicin (diệt khuẩn). Đối với sinh tổng hợp DNA, kháng sinh liên kết với tiểu đơn vị A của DNA gyrase (topoisomerase) và ngăn cản quá trình siêu cuộn xoắn của DNA bởi vậy ức chế quá trình tổng hợp DNA: quinolon, fluoroquinolone, acid oxolinic (diệt khuẩn). Bên cạnh cơ chế ức chế quá trình sinh tổng, một số kháng sinh còn là các tác nhân làm suy yếu chức năng của khuôn DNA. Về mặt lý thuyết không có loại nào trong số các tác nhân trên được sử dụng trong trị liệu. Cơ chế của chloroquine và miracil D (lucanthone) là ức chế plasmodia và schistosome tương ứng bằng cách xen 5 kẽ vào DNA và từ đó dẫn đến ức chế tổng hợp acid nucleic. Thuốc nhuộm acridine như proflavine cũng hoạt động theo cơ chế xen kẽ, nhưng vì chúng có độc tính và gây ung thư ở động vật có vú nên chúng cũng không được sử dụng làm chất kháng khuẩn. 1.1.2.3. Kìm hãm các quá trình trao đổi chất Cơ chế này thông qua quá trình ức chế sinh tổng hợp acid folic. Đây là chất rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cả acid nucleic và acid amin. Một số loại kháng sinh như sulphonamid và trimethoprim thể hiện tính chất như một cơ chất giả cần thiết cho quá trình trao đổi chất ở tế bào vi khuẩn. Cơ chế này làm cho enzyme của vi khuẩn gắn với kháng sinh thay vì gắn với cơ chế thông thường. Cụ thế đối với sulfonamid, đóng vai trò như tetrahydrofolate là một thành phần quan trọng trong việc tổng hợp acid folic ở tế bào vi khuẩn. Các chất tương tự acid para-aminobenzoic ức chế cạnh tranh đối với sự hình thành acid folic: sulfonamid, sulfone, para-aminosalicylic, depsone (kháng khuẩn). Liên kết với dihydrofolate reductase và ức chế sự hình thành acid tetrahydrofolic: trimethoprim, methotrexate, pyrimethamine (kháng khuẩn). 1.1.2.4. Tác động lên thành tế bào vi khuẩn Kháng sinh đại diện cho cơ chế ức chế sinh tổng hợp acid mycolic, một thành phần của thành tế bào vi khuẩn, là isoniazid. Tuy nhiên cơ chế chính tác động lên thành tế bào vi khuẩn của kháng sinh đó là quá trình ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Quá trình tổng hợp peptidoglycan diễn ra theo ba bước, và mỗi bước đều có thể trở thành đích tác động của kháng sinh. Trong đó giai đoạn thứ ba của quá trình tổng hợp thành tế bào bao gồm quá trình polymer hóa và gắn peptidoglycan mới sinh vào thành tế bào là giai đoạn tác động chủ yếu của kháng sinh. Giai đoạn này có sự tham gia của các PBP đó là các enzyme thuộc họ transglycosylase và transpeptidase. Hai loại enzyme này đóng vai trò then chốt trong việc hình thành peptidoglycan bằng cách thêm các pentapeptide disaccarid để mở rộng chuỗi glycan của phân tử peptidoglycan đã có và cả chuỗi liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan chưa trưởng thành. Các loại thuốc thuộc nhóm beta-lactam như penicillin, carbapenem và cephalosporin có thể ngăn chặn liên kết ngang của các đơn vị peptidoglycan bằng cách ức chế sự hình thành liên kết peptide được xúc tác bởi các PBP. 6 1.1.2.5. Tác động lên màng tế bào vi khuẩn Kháng sinh có thể thay đổi tính thấm của màng với các ion natri và kali. Valinomycin thay đổi tính thấm của màng đối với ion K+ của cả tế bào nhân sơ và nhân chuẩn bởi vậy nó không phải là chất kháng khuẩn được dùng trong hóa trị liệu. Tuy nhiên monensin (ở gia súc) và salinomycin (ở heo) được sử dụng rộng rãi trong thú y và có thể tức chế cả vi khuẩn, protozoa và metazoan ký sinh. Ngoài ra một số nhóm kháng sinh có thể liên kết với màng tế bào chất và khử cực, ví dụ như daptomycin khử cực màng phụ thuộc canxi, và điều đó dẫn đến sự ngừng tổng hợp đại phân tử và phá vỡ màng tế bào ở vi khuẩn. Một đích tác dụng quan trọng khác của kháng sinh trên màng tế bào đó là LPS. Kháng sinh sẽ liên kết với LPS để phá hủy lớp màng ngoài. LPS có vài điểm tích điện âm có khả năng tương tác với các kháng sinh cyclopeptid như polymyxin và colistin tích điện dương, ngoài ra một vài phản ứng kỵ nước giữa hai phân tử cũng dẫn tới làm phân ra lớp màng ngoài. Các kháng sinh nhóm polyen tạo kênh ion giả gắn với màng sterol của màng tế bào nấm tạo ra phức hệ màng-polyen có thể thay đổi tính thấm của màng, dẫn tới làm thất thoát các thành phần của tế bào như ester phosphate, acid hữu cơ, nucleotide và thậm chí cả các protein tế bào. Cơ chế cuối cùng tác động lên màng tế bào là cản trở quá trình tổng hợp màng lipid. Những kháng sinh này ức chế quá trình liên kết của các tiểu đơn vị tạo thành ergosterol và có thể trực tiếp phả hủy màng tế bào nấm: các kháng sinh này thuộc nhóm imidazoles: miconazole, ketoconazole, clotrimazole, và fluconazole. 1.1.3. Kháng sinh nhóm beta-lactam Đây là nhóm kháng sinh lớn và được sử dụng rộng rãi trong công tác điều trị tại nhiều nơi. Việc đặt tên là kháng sinh beta-lactam dựa trên cấu trúc phân tử có vòng beta-lactam, một amid nội phân tử mà nhóm amin ở vị trí beta so với nhóm chức acid. Các kháng sinh nhóm này gắn vào PBP và ngăn cản quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan ở thành tế bào làm cho tế bào vi khuẩn bị ly giải và chết. Nhóm kháng sinh này bao gồm 5 phân nhóm là: penicillin, cephalosporin, monobactam, carbapenem và nhóm chất ức chế beta-lactamase. 7 1.1.3.1. Penicillin [20,72] Đây là nhóm được Alexander Fleming phân lập đầu tiên từ môi trường nuôi cấy nấm Penicillium notatum. Dựa trên phổ tác dụng chúng được chia thành 4 loại: Penicillin tự nhiên: Tác dụng mạnh trên các cầu khuẩn Gram (+) không sinh penicillinase. Penicillin kháng penicillinase: Có phổ hẹp, được nghiên cứu chỉ nhằm tiêu diệt các tụ cầu sinh penicillinase mà loại penicillin tự nhiên không tác dụng. Aminopenicillin: Có phổ mở rộng. Tác dụng tương tự như penicillin tự nhiên trên vi khuẩn Gram (+) nhưng yếu hơn, tuy nhiên lại mở rộng tác dụng trên một số vi khuẩn Gram (-) như Haemophilus influenza, Salmonella, Escherichia coli, … Penicillin phổ rộng: loại này có tác dụng mạnh hơn các loại khác trên các vi khuẩn Gram (-) (đặc biệt Pseudomonas và Proteus) do tăng tính thấm qua màng tế bào vi khuẩn. Ưu điểm chủ yếu của nhóm này là có tác dụng lên Pseudomonas aeruginosa. 1.1.3.2. Cephalosporin Năm 1948, Abraham và cộng sự đã phân lập được từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium hợp chất đặt tên là cephalosporin C. Hợp chất này có tác dụng kháng khuẩn nhưng rất yếu, tuy nhiên nó lại chính là tiền đề cho việc tổng hợp ra các loại cephalosporin sau này. Hiện nay có bốn thế hệ cephalosporin được phân loại dựa trên phổ tác dụng đối với vi khuẩn Gram (-) và độ bền của chúng đối với các beta-lactamase [72]. Thế hệ I: Tác dụng mạnh nhất trên các vi khuẩn Gram (+) và yếu nhất trên vi khuẩn Gram (-). Không bền và dễ bị beta-lactamase phá hủy. Thế hệ II: Gồm các chất tác dụng mạnh hơn trên vi khuẩn Gram (-) và yếu hơn trên vi khuẩn Gram (+) so với thế hệ I, trong đó đáng chú ý và tác dụng mạnh hơn trên H. influenza. Giống như thế hệ I, các chất thuộc thế hệ II không tác dụng lên P. aeruginosa. Tuy nhiên chúng tương đối bền với beta-lactamase. Thế hệ III: Tác dụng trên vi khuẩn Gram (+), đặc biệt tụ cầu, tuy nhiên kém hơn cephalosporin thế hệ I, nhưng có phổ rộng tác dụng mạnh trên vi khuẩn Gram (-). Khả năng kháng beta-lactamase của vi khuẩn Gram (-) mạnh hơn so với thế hệ II. 8 Thế hệ IV: Đây là các cephalosporin phổ rộng. Trên vi khuẩn Gram (+) chúng có hoạt tính tương tự cephalosporin thế hệ I. Trên vi khuẩn Gram (-), do các cephalosporin thế hệ IV là các ion lưỡng cực nên có thể thấm qua màng ngoài của vi khuẩn Gram (-) và có tác dụng kháng beta-lactamase mạnh hơn thế III. 1.1.3.3. Monobactam Các kháng sinh này là một phần của nhóm beta-lactam nhưng lại không như các loại beta-lactam khác, vòng beta-lactam của monobactam chỉ đứng đơn độc thay vì liên kết với các vòng khác. Aztreonam là loại kháng sinh monobactam duy nhất được bán trên thị trường và chỉ có hoạt tính đối với vi khuẩn Gram âm hiếu khí như Nesseria và Pseudomonas. Kháng sinh này được sử dụng để điều trị viêm phổi, nhiễm trùng máu và nhiễm trùng đường tiết niệu do các nhóm vi khuẩn trên gây ra. Monobactam không có hiệu quả đối với vi khuẩn gram dương hoặc vi khuẩn kỵ khí [72]. 1.1.3.4. Carbapenem Hình 2. Cấu trúc hóa học của carbapenem [20] Nhóm kháng sinh này được tìm ra vào năm 1976, chúng đóng vai trò rất quan trọng trong việc chống lại các bệnh nhiễm khuẩn. Nguyên nhân là do chúng có khả năng kháng lại được sự thủy phân của các enzyme beta-lactamase. Trong số hàng trăm loại kháng sinh beta-lactam đã biết, carbapenem có phổ rộng nhất và có hoạt tính mạnh lên cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Hình 2). Chính bởi vậy chúng thường được gọi là “sự lựa chọn cuối cùng” và chỉ được chỉ định khi tình trạng của bệnh nhân trở nên trầm trọng hoặc nghi ngờ có sự kháng kháng sinh. Một số đại diện trong nhóm này bao gồm: 9 Imipenem: có phổ tác dụng hiệu quả đối với cả tác nhân hiếu khí và kị khí, thường dùng đường uống, hoạt động với liều thấp và ít tác dụng không mong muốn. Meropenem: có phổ tác dụng hiệu quả lên trực khuẩn Gram âm, đặc biệt có với các bệnh nhiễm khuẩn cơ hội. Doripenem: có phổ tác dụng hiệu quả đáng kể đối với Pseudomonas aeruginosa Ertapenem: có phổ tác dụng giới hạn với các trực khuẩn Gram âm không lên men. Tuy nhiên, hiện nay tình trạng báo động về các vi khuẩn kháng lại dòng kháng sinh hiệu quả này đã được ghi nhận. Đáng lo ngại hơn nữa, các vi khuẩn có khả năng kháng carbapenem đang ngày càng gia tăng trên toàn cầu và nhanh chóng trở thành vấn đề đáng quan tâm của thế giới. 1.1.3.5. Nhóm ức chế beta-lactamase Các chất này cũng có cấu trúc beta-lactam, nhưng không có hoạt tính kháng khuẩn, mà chỉ có vai trò ức chế beta-lactamase của vi khuẩn bằng cách ức chế không thuận nghịch nhiều beta-lactamase làm thay đổi enzyme, bất hoạt và không cho chúng giải phóng trở lại. Các chất hiện hay được sử dụng trên lâm sàng là acid clavulanic, sulbactam và tazobactam [72]. 1.1.4. Phối hợp kháng sinh trong điều trị Trên thực tế để nâng cao hiệu quả điều trị, việc phối hợp kháng sinh là rất cần thiết nhằm mục đích [58]: Làm giảm khả năng xuất hiện các chủng đề kháng. Điều trị nhiễm khuẩn do nhiều chủng vi khuẩn gây ra. Làm tăng khả năng diệt khuẩn. Mỗi kháng sinh đều có ít nhiều tác dụng không mong muốn; khi phối hợp thì những tác dụng phụ này cũng sẽ cộng lại hoặc tăng lên. Không nên hy vọng phối hợp thì hạ được liều lượng từng thuốc vì có thể dẫn đến nguy cơ xuất hiện vi khuẩn kháng kháng sinh. Phối hợp kháng sinh có thể dẫn đến tác dụng cộng (addition) hoặc hiệp đồng (synergism) hoặc đối kháng (antagonism) hay không thay đổi (indifference) so với một thuốc đơn lẻ. Khi phối hợp, cần dùng đủ liều và nên lựa chọn những kháng sinh có tính chất dược động học gần nhau hoặc có tác dụng hiệp đồng [58]. 10