Tài liệu Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của vi tảo biển dunaliella salina phân lập từ ruộng muối giao thủy nam định (lv02363)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 TRỊNH MINH THU NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ, HÓA SINH CỦA VI TẢO BIỂN Dunaliella salina PHÂN LẬP TỪ RUỘNG MUỐI GIAO THỦY - NAM ĐỊNH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. TRẦN ĐĂNG KHOA Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Trần Đăng Khoa đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hoài Hà đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô trường ĐHSP Hà N i 2 và cán b Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học ĐHQGHN đã cung cấp những kiến thức nền tảng cơ bản hỗ trợ cho quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình người thân, bạn bè đã luôn đ ng viên giúp đỡ trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên T ịnh Minh Thu ỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu, số liệu trình bày trong luận văn là trung thực và không tr ng l p với c c đề tài kh c Tôi cũng xin cam đoan r ng c c thông tin tr ch dẫn trong luận văn đã được chỉ r ngu n gốc Hà Nội, tháng năm 2017 Học viên Trịnh Minh Thu MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 4 1.1. Giới thiệu về Dunaliella ................................................................................... 4 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu ..................................................................................... 4 1.1.2. Vị trí phân loại của Dunaliella ................................................................... 4 1 1 3 Đ c điểm sinh học của Dunaliella ............................................................. 5 1.1.4. Sinh sản ...................................................................................................... 6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng ................................................................................. 7 1.2. Carotenoid ....................................................................................................... 11 1.2.1. Caroten ..................................................................................................... 13 1.2.2. Xanthophyll .............................................................................................. 15 1.3. Tình hình nghiên cứu Dunaliella trong và ngoài nước .................................. 16 1.3.1. Tình hình nghiên cứu Dunaliella trong nước ........................................... 16 1.3.2. Tình hình nghiên cứu Dunaliella ngoài nước .......................................... 16 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 18 2 1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 18 2 1 1 Đối tượng .................................................................................................. 18 2 1 2 Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 18 2 1 3 Môi trường ................................................................................................ 18 2.1.4. Thiết bị ..................................................................................................... 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 19 2.2.1. Phân lập vi tảo .......................................................................................... 19 2 2 2 X c định khả năng sinh trưởng ................................................................ 20 2 2 3 Phương ph p phân loại ............................................................................. 20 2.2.4. Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp βcaroten của vi tảo Dunaliella.............................................................................. 21 2 2 5 Phương ph p t ch chiết carotenoid .......................................................... 21 2 2 6 Phương ph p phân t ch sắc ký bản mỏng (TLC)...................................... 22 2.2.7. Phương ph p phân t ch sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ................................ 22 2.2.8. Các phân tích thống kê ............................................................................. 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 24 3.1. Phân lập và sàng lọc vi tảo Dunaliella ........................................................... 24 3 2 Đ c điểm hình th i học và hình thức sinh sản của Dunaliella DUN23.......... 25 3 3 Phân t ch giải trình tự 18S rDNA ................................................................... 27 3.4. Ảnh hưởng của c c điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng và t ch lũy caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ........................................................ 31 3.4.1. Ảnh hưởng của n ng đ NaCl đến sinh trưởng và t ch lũy -caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 .................................................................. 31 3.4.2. Ảnh hưởng của cường đ chiếu s ng đến sinh trưởng và t ch lũy caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ..................................................... 33 3.5. Lựa chọn phương ph p và dung môi th ch hợp cho tách chiết carotenoid ..... 35 3.6. Phân tích carotenoid b ng sắc ký bản mỏng TLC .......................................... 37 3.7. Phân tách carotenoid b ng phương ph p HPLC ............................................. 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 43 ANH MỤC CÁC CH Chữ viết tắt VIẾT TẮT Chữ viết đầy đủ EDTA Ethylene DiamineTetraacetic Acid Môi trường J Môi trường Johnsons HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng cao áp Tb Tế bào TLC Thin Layer Chromatography - Sắc ký bản mỏng TLK Trọng lượng khô VTB Vi tảo biển DANH MỤC ẢNG Bảng 2.1. Môi trường Johnsons (J) ........................................................................... 18 Bảng 2.2. Vị trí thu mẫu của 5 chủng Dunaliella ..................................................... 19 Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng và t ch lũy carotenoid của 5 chủng Dunaliella sau 16 ngày ................................................................................................ 24 Bảng 3.2. Các ký hiệu chi và mã GenBank 18S rDNA và ITS của các vi tảo tham khảo ................................................................................................... 29 ANH MỤC H NH Hình 1.1. Cấu tạo tế bào Dunaliella ........................................................................... 5 Hình 1.2. Hợp nhất dạng đỏ và xanh của D. salina và sự hình thành giao tử ............ 7 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hóa học chung của m t số carotenoid........................... 12 Hình 1.4. Mô hình cấu trúc hai đ ng phân của -caroten ......................................... 14 Hình 3.1. Hình dạng tế bào sinh dưỡng Dunaliella DUN23 (thanh k ch thước 5µm) ........................................................................................................... 25 Hình 3.2. Thể giao tử Dunaliella DUN23 (thanh k ch thước 5µm) ......................... 25 Hình 3.3. Sinh sản hữu tính của Dunaliella DUN23 ................................................ 26 Hình 3.4. Sinh sản vô tính của Dunaliella DUN23 .................................................. 27 Hình 3.5. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự18S rDNA của Dunaliella DUN23 và các chủng có quan hệ họ hàng gần .......................................... 28 Hình 3.6. Cây phân phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự ITS của Dunaliella DUN23 và các chủng có quan hệ họ hàng gần .......................................... 29 Hình 3.7. Ảnh hưởng của n ng đ NaCl đến sinh trưởng và hàm lượng caroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ............................................ 32 Hình 3.8. Ảnh hưởng của cường đ chiếu s ng đến sinh trưởng và t ch lũycaroten của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ............................................ 34 Hình 3 9 Hàm lượng carotenoid tách chiết b ng phương ph p (a) vortex (b) sonic, (c) hỗn hợp dung môi ...................................................................... 36 Hình 3.10. Sắc ký đ TLC carotenoid của vi tảo Dunaliella salina DUN23 ........... 38 Hình 3.11. Sắc ký đ chuẩn của Lutein 9.814; Astaxanthin 12.985; -caroten 14.299......................................................................................................... 39 Hình 3.12. Sắc ký đ HPLC của Dunaliella salina DUN23 (Thời gian lưu: Lutein 9.784; Astaxanthin 12.986; -caroten 14.298) ............................... 40 1 MỞ ĐẦU 1. do chọn đ tài Vi tảo là m t cấu thành quan trọng của sinh vật ph du đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và phát triển hệ sinh th i dưới nước. Chúng có giá trị dinh dưỡng cao và phạm vi ứng dụng r ng rãi như m t số loài vi tảo Chlorella, Dunaliella, Spirulina đã được nuôi cấy để sản xuất protein β-caroten, glycerol, nhiên liệu sinh học, các dạng dược phẩm… Vi tảo lục-cam Dunaliella (ngành tảo lục) là các loài có hình dạng khác nhau từ hình que tới dạng trứng đơn bào di đ ng (9 tới 11 µm), xuất hiện trong nhiều v ng nước m n như đại dương c c h nước m n c c đầm lầy, b n chứa và các mương ngập m n gần biển, chiếm ưu thế trong các thủy vực có chứa hàm lượng muối n ng đ 2M. M t vài loài vi tảo có thể t n tại trong c c điều kiện đ muối cao như c c ao bay hơi muối Để t n tại, những vi tảo này t ch lũy c c β-carotene và glycerol với n ng đ cao để bảo vệ chúng trước các yếu tố cường đ ánh sáng và áp suất khí quyển. Loài Dunaliella cũng được nghiên cứu nhiều do chúng có hoạt tính chống oxy hóa cao, chúng có khả năng t ch lũy lượng lớn các carotenoid. Chi Dunaliella có 22 loài và m t số dạng biến thể, các dạng sinh sống ở biển và các loài ưa m n, những vi tảo này được nuôi cấy tương đối đơn giản và không kết thành đ m hay c c dạng chuỗi Loài được biết tới nhiều nhất là Dunaliella salina ưa m n. Dunaliella là ngu n ch nh t ch lũy m t lượng carotenoid lớn trong tự nhiên[34] Trong môi trường nước m n, Dunaliella salina có màu lam. Tuy nhiên, trong c c điều kiện đ muối và cường đ ánh sáng cao, vi tảo này lại biến thành màu đỏ do sự sinh t ch lũy các carotenoid có chức năng bảo vệ tế bào. Công nghệ sinh học tảo có những ưu điểm lớn trong hàng thập kỷ qua và những kết quả nghiên cứu đã mang lại những giá trị to lớn cho con người. Hiện nay, carotenoid đang được quan tâm nhiều trên thị trường, chúng sử dụng như c c chất tạo màu trong các loại thực phẩm dinh dưỡng dược phẩm, mỹ phẩm. Những hợp chất này có c c đ c tính chống oxy hóa và thu hút được nhiều sự chú ý bởi c c đ c tính tiềm ẩn của chúng trong qu trình ngăn ngừa ung thư[28]. Trong số khoảng 2 1000 c c carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên, chỉ m t vài trong số chúng có chứa β-carotene (cà rốt), lycopene (cà chua) và lutein (sau bina). M c dù m t số loại carotenoid, ví dụ β-carotene và zeaxanthin có thể được tổng hợp nhân tạo, ngu n carotenoid từ vi tảo tự nhiên cũng như từ vi khuẩn và nấm men được sử dụng như các chất bổ sung vẫn tạo được sự chú ý lớn của c ng đ ng thế giới. Ngày nay, vi tảo Dunaliella đang thu hút được nhiều sự chú ý do khả năng t ch lũy β-carotene của nó. M t phân tử β-carotene có thể trung hòa tới hơn 1000 phân tử oxy gốc tự do. Nam Định là vựa muối lớn nhất của miền Bắc với 870 ha có thể sử dụng cho sản xuất muối. Giao Thuỷ là huyện ven biển, ở cực nam đ ng b ng châu thổ sông H ng ph a Nam và Đông Nam tiếp giáp với biển Đông Việt Nam, tiếp giáp các huyện Xuân Trường, Hải Hậu (Nam Định) và Kiến Xương Tiền Hải (Thái Bình). Hai xã Giao Phong và Bạch Long thu c huyện Giao Thủy là hai trong những xã có sản lượng muối cao của tỉnh. Ru ng muối thu c xã Giao Phong n m sát phía trong đê trung ương gi p thị trấn Quất Lâm. Từ 250 ha ru ng muối, mỗi năm xã Bạch Long đóng góp khoảng 40000 tấn muối. Gần đây do sự gia tăng nhiệt đ , quá trình bay hơi nước trực tiếp đ muối tăng lên; quần thể Artemia (loài giáp xác) giảm và do đó sự đa dạng về mật đ Dunaliella ở ru ng muối của hai xã tăng lên màu đỏ của ru ng muối cũng từ đó mà hình thành Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của vi tảo biển Dunaliella salina phân lập từ ruộng muối Giao Thủy-Nam Định” nh m tạo cơ sở cho việc đưa chủng vi tảo Dunaliella salina vào nhân nuôi trên quy mô công nghiệp, nh m đạt hiệu quả cao trong việc khai thác giá trị kinh tế to lớn của chủng vi tảo này. 2. Mục đ ch nghiên cứu X c định m t số chỉ tiêu sinh lý hóa sinh của vi tảo biển Dunaliella salina. Tuyển chọn được vi tảo biển Dunaliella tiềm năng sinh tổng hợp carotenoid. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu Phân lập x c định chỉ tiêu sinh lý hóa sinh vi tảo biển Dunaliella salina. 3 Nghiên cứu c c yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và t ch lũy β-caroten của vi tảo Dunaliella salina. T ch chiết carotenoid từ vi tảo Dunaliella salina. 4. Điểm mới của luận văn Cung cấp m t số dẫn liệu cập nhật về ngu n gen vi tảo biển Dunaliella ở các đ ng muối tại khu vực nghiên cứu. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Ý nghĩa khoa học Góp phần bổ sung vốn kiến thức cho chuyên ngành sinh học thực nghiệm sinh thái học và là cơ sở khoa học cho những nghiên cứu về ngu n gen vi tảo biển đa dạng sinh học và nuôi tr ng thủy sản. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài phục vụ trực tiếp việc bảo t n ngu n gen vi tảo trong c c đ ng muối Nam Định, tuyển chọn được vi tảo biển Dunaliella đưa vào khai th c nhân nuôi trên quy mô công nghiệp. 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Giới thiệu v Dunaliella 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu Năm 1838, Dunal mô tả đầu tiên về loài vi tảo đỏ đơn bào hai roi, sống trong nước biển cô đ c. Ông đã công bố sự có m t của m t nhóm sinh vật trong các ru ng muối ở Montpellier thu c bờ biển Mediterranean nước Ph p mà ngày nay được biết đến là Dunaliella salina [26]. Trong suốt thế kỷ 19, các nhà sinh học cũng quan sát thấy vi tảo đỏ có roi của Dunal trong các h nước m n và tại các khu vực có đ m n cao ở Crimea, Algeria, Lorraine, Pháp và Romania [7]. Năm 1905, Teodoresco (Bucharest) và Clara Hamburger (Heidelberg) công bố hai bài báo mô tả chi tiết thêm về Dunaliella như là m t chi mới. Teodoresco đã nghiên cứu mẫu thu thập từ ru ng muối ở Romani, trong khi Hamburger nghiên cứu trên các mẫu vật được gửi tới từ các ru ng muối ở Cagliari, Sardinia. Cả hai tác giả đều trình bày bản vẽ chi tiết của sinh vật về hình thái, cấu trúc, sinh sản, tập tính và sinh thái học. Trong phân loại, chi Dunaliella được đ t tên Dunal vì sự kính trọng đối với ông người đầu tiên quan sát thấy sinh vật này trong các ru ng muối ở Pháp c ch đây gần 70 năm với hai loài đầu tiên trong chi này đã được công bố năm 1906 là Dunaliella salina và Dunaliella viridis [26]. 1.1.2. Vị trí phân loại của Dunaliella Theo Avron và Ben-Amotz, phân loại khoa học của Dunaliella như sau [6]: Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae B : Volvocales Họ: Dunaliellaceae Chi: Dunaliella 5 1.1.3. Đặc điểm sinh học của Dunaliella Dunaliella là vi tảo đơn bào sống đơn lẻ có hai roi. Tế bào không có lớp màng polysaccharide cứng, được bao bọc bởi màng đàn h i mỏng và phủ m t lớp áo là màng nhầy nguyên sinh chất. Việc thiếu m t polysaccharide cứng giúp tế bào nhanh thay đổi về khối lượng để đ p ứng áp lực thẩm thấu trong tế bào b ng c ch loại bỏ glycerol qu trình chấm dứt khi thể t ch trở về với gi trị ban đầu [10]. Tế bào Dunaliella có hình dạng khác nhau: hình trứng, hình cầu, hình quả lê ho c hình elip với c c k ch thước: chiều dài 5-25µm, chiều r ng 3-13µm [20]. Tế bào của m t loài nhất định có thể thay đổi hình dạng khi c c điều kiện sống thay đổi trong điều kiện không thuận lợi tế bào thường có dạng hình cầu K ch thước tế bào cũng có thể thay đổi khi điều kiện sinh trưởng và cường đ nh s ng thay đổi [33]. Hạt nhân thường bị che khuất bởi m t số hạt nhỏ, nó chiếm hầu hết diện tích phần trước của tế bào và thường được bao quanh bởi th y trước lục lạp [33]. Những tế bào di đ ng này chuyển đ ng nhờ hai roi, trong đó m t roi n m ở điểm cuối ph a trước của tế bào, chiều dài của roi phụ thu c vào loài. Hình 1.1. Cấu tạo tế bào Dunaliella [10] Tế bào chứa duy nhất m t lục lạp đơn hình chén lục lạp này bao g m m t hạt tinh b t ở trung tâm được bao quanh bởi tinh b t. Lục lạp chiếm hầu hết diện t ch cơ thể. Thể lục lạp khắc thành nhiều thùy, các màng thylakoid trong lục lạp xếp ch ng lên nhau dày đ c. Lục lạp có thể t ch lũy m t lượng lớn β-caroten làm cho các tế bào có màu cam ho c đỏ thay vì màu xanh lá cây. Khi nuôi cấy ở n ng đ 6 muối thấp tế bào có thể bị mất màu cam. Nghiên cứu siêu cấu trúc cho thấy tế bào có m t màng xốp được bao quanh bởi chất dị nhiễm sắc kết tụ. Ty thể có thể n m trong các b phận khác nhau của tế bào ở phần mỏng. Số lượng và k ch thước của ty thể khác nhau giữa các tế bào và ở giai đoạn phát triển khác nhau. Số lượng b máy golgi trong tế bào có thể có từ 2 đến 4, g m 10-15 túi màng dẹt xếp ch ng nhau Điểm mắt n m ở ngoại vi của lục lạp. Các loài trong chi Dunaliella được phân lập từ môi trường nước m n như biển và các h muối với m t dải r ng các thành phần hóa học và n ng đ muối dao đ ng từ 0,5% đến bão hòa khoảng 35%. Cơ chế thích nghi với dải n ng đ muối r ng ở Dunaliella dựa trên khả năng thay đổi n ng đ glycerol trong tế bào. Khi Dunaliella được nuôi cấy ở đ m n cao thì n ng đ glycerol n i bào vượt quá 50%. Trong điều kiện này glycerol đóng vai trò như m t “chất tan tương th ch” bảo vệ chống lại cả hai enzyme bất hoạt và ức chế. Cũng thấy r ng dưới ánh sáng ho c trong tối tổng hợp glycerol trong điều kiện ưu trương và loại bỏ trong điều kiện nhược trương đ c lập với tổng hợp protein [10]. M t khác, những nghiên cứu gần đây cho r ng Dunaliella có m t khả năng đ c biệt trong việc loại bỏ các ion Na+ trong môi trường m n cao b ng cách sử dụng m t kênh bơm natri theo hướng oxy hóa khử mới [22]. Các kết quả nghiên cứu proteomic cũng chỉ thêm r ng ngoài các phương ph p trên, Dunaliella đ p ứng với thay đổi đ m n cao b ng cách tăng cường quang tổng hợp để đ ng hóa CO2 [26]. Ngoài sự thích nghi với điều kiện môi trường n ng đ muối cao của hầu hết các loài Dunaliella thì Dunaliella acidophila có thể phát triển trong môi trường axit (pH 0-1), Dunaliella antarctica phát triển mạnh ở nhiệt đ thấp và m t số chủng D. salina có thể chịu được cường đ ánh sáng cao. Dunaliella là sinh vật có khả năng th ch nghi được với nhiều điều kiện môi trường sống khắc nghiệt nhất. 1.1.4. Sinh sản Dunaliella có m t chu trình sinh trưởng phức tạp bao g m cả sinh sản hữu tính và vô tính. Sự hợp nhất của hai đ ng giao tử thành m t hợp tử đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu trước đây Các nghiên cứu của Lerche đã chỉ ra 7 phương thức sinh sản hữu tính của Dunaliella, sự hình thành hợp tử hữu tính của 5 trong số 6 loài được nghiên cứu bao g m D. salina, D. parva, D. peircei, D. euchlora, D. minuta. Sự hình thành hợp tử ở D. salina được hoạt hoá bởi sự giảm n ng đ muối từ 10 đến 3%. Bắt đầu quá trình, các roi tiếp xúc với nhau, tiếp sau đó các giao tử tạo nên m t cầu sinh chất và hợp nhất. Hợp tử có lớp phía ngoài dày, chúng có thể chịu được môi trường nước ngọt và cũng có thể kéo dài được sự sống trong điều kiện khô hạn. Những hợp tử này nảy mầm b ng cách phóng thích lên tới 32 tế bào con khi phá vỡ bào nang Tuy nhiên trong trường hợp này, tế bào hình thành vỏ dày và tròn đã diễn ra vào thời điểm đ m n của nước tăng lên Sinh sản hữu tính ở Dunaliella là phổ biến hơn sinh sản vô tính [26]. Sinh sản vô tính b ng cách phân chia theo chiều dọc tế bào thành nhiều đ ng bào tử. G p điều kiến bất lợi Dunaliella hình thành bào tử nghỉ (dạng cyst) có vách dày chống chịu được với điều kiện khắc nghiệt. Khi g p điều kiện thuận lợi chúng phát triển thành cơ thể mới. Hình 1.2. Hợp nhất dạng đỏ và xanh của D. salina và sự hình thành giao tử [26] 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng Dunaliella có thể sinh trưởng trong môi trường có n ng đ NaCl cao. N ng đ NaCl có ảnh hưởng cao đến sinh trưởng và phát triển của Dunaliella. Ngoài ra 8 các yếu tố kh c như dinh dưỡng, nhiệt đ , pH, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng của Dunaliella. 1.1.5.1. Ánh sáng Dunaliella là sinh vật quang tự dưỡng bắt bu c, ánh sáng là ngu n năng lượng duy nhất cho sự trao đổi chất của Dunaliella [12]. Trong hệ thống ao mở, ngu n ánh sáng là ánh sáng m t trời trong khi đó ở các bể phản ứng quang sinh ánh sáng có thể được cung cấp b ng cách sử dụng m t trong hai: đèn huỳnh quang trắng hay ánh sáng m t trời. Sự sinh trưởng và tổng hợp carotenoid khác nhau với các dạng ánh sáng khác nhau. Cảm ứng carotenoid không phụ thu c bước sóng mà phụ thu c nhiều vào cường đ ánh sáng [9]. Jahnkecho cho r ng không giống như UVB, UV-A bức xạ tạo ra sự t ch lũy lớn carotenoid của D. bardawil mà không làm chậm quá trình sinh trưởng [21]. 1.1.5.2. Nhiệt độ Dunaliella có khả năng sinh trưởng trong m t dải nhiệt đ từ dưới 0 đến 450C.Trong phòng thí nghiệm, nhiệt đ tối ưu cho sự sinh trưởng của Dunaliella là 320C và thích hợp ở dải nhiệt đ 25 - 350C. Nhiệt đ thấp làm giảm tốc đ sinh trưởng dẫn đến giảm số lượng tế bào. M t khác, nhiệt đ ở 40oC sẽ thúc đẩy cảm ứng carotenoid nhưng đ ng thời cũng làm chậm tỷ lệ sinh trưởng [12]. Ngoài ra, nhiệt đ cao hơn 40oC vi tảo Dunaliella sinh glycerol nhiều vào môi trường, đây là m t ngu n cacbon hữu cơ là điều kiện tốt cho vi khuẩn và nấm sợi phát triển dẫn đến cạnh tranh với vi tảo [20]. 1.1.5.3. pH Dunaliella có khả năng chịu pH từ 011 nhưng pH tối ưu cho D.salina n m trong khoảng 9  11. Trong nuôi cấy vi tảo tự dưỡng, pH tăng lên do vi khuẩn quang hợp cố định CO2 với NO3- góp phần làm tăng n ng đ OH- [9]. Khi pH môi trường cao sẽ có nguy cơ kết tủa m t số các muối canxi và keo tụ sinh khối vi tảo. Điều này dẫn đến giảm sinh trưởng của vi tảo bởi vậy trong nuôi cấy cần tr nh tăng pH lên trên 8 [9]. Trong hệ thống ao mở được vận hành pH thường được duy trì ở mức 7,5 ± 0,2 b ng điều khiển kép (CO2 và HCl) tại đầu vào của hệ thống nuôi cấy. 9 Đ ng thời trong quá trình nuôi cấy, bổ sung CO2 và HCl. Trong m t số ao mở và các bể phản ứng quang sinh, ngu n cung cấp chính cacbon vô cơ là ion HCO3-, pH được điều khiển b ng cách cho thêm HCl. 1.1.5.4. Nhu cầu dinh dưỡng Dunaliella là sinh vật quang tự dưỡng, sử dụng CO2 và HCO3- như ngu n cacbon vô cơ Việc thiếu m t ngu n cacbon vô cơ th ch hợp là yếu tố hạn chế sinh trưởng dưới c c điều kiện trong nuôi cấy D. salina như đ m n cao, pH cao và nhiệt đ cao [12]. Các thiết bị sục khí, bơm CO2 được sử dụng trong hệ thống nuôi cấy nh m cung cấp đủ lượng CO2 cần cho sinh trưởng. Ngoài ra, bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10 mmol/l NaHCO3 là cần thiết cho sinh trưởng tối ưu Ngu n nitơ tốt nhất cho D. salina là nitrate. Trong thực tế, bổ sung vào môi trường 5 mmol/lNaNO3 ho c KNO3 sẽ cho vi tảo sinh trưởng tốt. M t khác, thiếu hụt nitrate là m t trong những cách phổ biến nhất để giảm tốc đ sinh trưởng đ ng thời sẽ kích hoạt cảm ứng sản xuất carotenoid. Tuy nhiên, kéo dài thiếu hụt nitơ trong nuôi cấy, có thể dẫn đến tỷ lệ tử vong cao của các tế bào cũng như gây giảm nghiêm trọng hàm lượng carotenoid trong mỗi thể tích nuôi cấy. Ngu n nitơ kh c như muối amoni và urê là không thích hợp vì chúng có thể gây chết vi tảo dưới điều kiện nhất định. Nghiên cứu cũng chỉ ra r ng việc sử dụng NH4NO3 hay (NH4)2CO3 như ngu n nitơ sẽ gây đ c hại đối với sự phát triển của D. salina [13]. Phốt pho trong KH2PO4 ho c NaH2PO4 cho kết quả tốt nhất. Yêu cầu hàm lượng photphat tối ưu cho sự phát triển là khoảng 0,2 mg/l KH2PO4. Trong ao mở, n ng đ cao hơn có thể ức chế sự sinh trưởng vì sự có m t đ ng thời của photphat và canxi đ c biệt là ở pH cao hơn 8 có thể dẫn đến kết tủa Ca3PO4 và keo tụ vi tảo [18]. Dunaliella cũng cần n ng đ sunphat cao (khoảng 2 mmol/l) để phát triển tối ưu nhưng sunphat rất ít khi phải thêm vào trong môi trường ao thương mại vì ngu n nước tự nhiên như nước biển ho c nước máy chứa hàm lượng sunphat cao (khoảng 30 mmol/l) [9]. Các yếu tố khác cũng cần cho sinh trưởng của D.salina bao g m: K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, Na+, sắt chelated và m t số yếu tố khác. Các chỉ số của Mg2+/Ca2+ và Cl- 10 /SO42- trong môi trường cũng ảnh hưởng đến tốc đ sinh trưởng và tổng hợp caroten. Dunaliella có thể chịu được phạm vi r ng của tỷ lệ Mg2+/Ca2+ từ 0,8 – 2,0. Tỷ lệ Cl-/SO42- tốt nhất cho sinh trưởng tối ưu của D. salina được nghiên cứu là 3,2, trong khi đó tỷ lệ tối ưu cho t ch lũy carotenoid là khoảng 8,6. Fe3+ thường được thêm vào nuôi cấy dưới hình thức bổ sung FeCl3-EDTA ho c bổ sung sắt dạng phức-EDTA. Nghiên cứu của Borowitzka và Borowitzka cho thấy, so với bổ sung sắt dạng phức thì bổ sung FeCl3 dẫn đến tốc đ sinh trưởng tăng nhanh hơn so với sinh trưởng ban đầu của D. Salina[13]. Tuy nhiên, khi bổ sung sắt dạng phức thì cho số lượng tế bào cao hơn so với FeCl3. Bốn nguyên tố vi lượng, bao g m cả mangan, kẽm coban và đ ng cũng cần thiết cho sự sinh trưởng tối ưu của Dunaliella. Tuy nhiên, không cần phải thêm các yếu tố đó vào môi trường nếu môi trường đó bao g m các muối công nghiệp ho c nước biển [9]. 1.1.5.5. Hệ thống nuôi cấy Nuôi cấy đại trà vi tảo đã được phát triển trong các hệ thống nuôi cấy bao g m ao mở ao tròn ao mương túi lớn, bể chứa, thùng lên men dị dưỡng và m t số loại bể phản ứng quang sinh k n C c đ c điểm sinh học của vi tảo là m t trong những yếu tố quan trọng nhất để xem xét cho lựa chọn m t hệ thống nuôi cấy thực tế.  Hệ thống ao mở Ngày nay, các hệ thống thương mại phổ biến nhất cho nuôi sinh khối của Dunaliella là ao mở ngoài trời. Nhà máy sản xuất Dunaliella n m trong khu vực có khí hậu nóng và khô với đ che phủ thấp và thường n m ở ngu n nước muối ho c gần ngu n nước muối. Để kiểm so t đ m n thì nước biển với n ng đ muối thấp được bơm từ c c đầm phá vào các h nước sau đó bổ sung các chất dinh dưỡng thích hợp. Sau khi các tế bào vi tảo trong ao đạt n ng đ -caroten thích hợp, sẽ được chuyển sang các nhà máy thu hoạch trên bờ và môi trường còn lại được bơm lại vào các ao [33]. Ngoài ra, ở m t số nơi sử dụng cánh khuấy nhỏ để tr n đều chất dinh dưỡng, CO2 và tế bào vi tảo. Cung cấp khí CO2 với vai trò là ngu n cacbon vô cơ đ ng thời nh m kiểm soát pH. Nuôi cấy ngoài trời có thể được vận hành theo mẻ ho c bán 11 liên tục. Sự pha tr n của các hình thức nuôi cấy có nhiều ưu điểm: có hiệu quả ngăn ch n các tế bào sa lắng, phân tầng nhiệt, hỗ trợ chất dinh dưỡng, phân phối khí và loại bỏ oxy dư thừa [33]. Các thông số ảnh hưởng đến năng suất của vi tảo trong ao như: tỷ lệ tr n đ sâu của hệ thống nuôi cấy k ch thước của các chủng… cần được tối ưu hóa trong bất kỳ trường hợp nghiên cứu nào vì kết quả có thể thay đổi từ m t điều kiện thử nghiệm khác.  Hệ thống khép kín Bể phản ứng quang sinh công nghiệp là hệ thống tuyệt vời cho việc kiểm soát nhiều thông số nuôi cấy và do đó được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật quang hợp như vi tảo và tế bào thực vật. Sinh khối vi tảo thu được xử lý để sản xuất các sản phẩm dinh dưỡng, tổng hợp các thành phần có giá trị như axit béo bão hòa và carotenoid, làm thức ăn trong c c ngành công nghiệp nuôi tr ng thủy sản. Bể phản ứng được thiết kế để phân phối ánh sáng và chất dinh dưỡng đều và tăng cường trao đổi khí. Trong sản xuất Dunaliella thì các thông số như: nhiệt đ , pH, chất dinh dưỡng luôn được theo dõi và kiểm soát ch t chẽ. Tuy hệ thống khép kín đạt n ng đ sinh khối cao và kiểm soát các thông số môi trường và các thông số kỹ thuật khác là tốt hơn như giảm nguy cơ ô nhiễm, giảm thiếu hụt CO2 và có điều kiện tái canh tác sản xuất Nhưng gần đây c c số liệu đã chỉ ra r ng: năng suất trên m t đơn vị thể tích và chi phí sản xuất trong hệ thống này không tốt hơn so với ao mở [24]. So với ao mở, thiết kế của bể phản ứng quang sinh là phức tạp hơn tốn kém và khó áp dụng với quy mô r ng Tuy nhiên đối với các ứng dụng trong tương lai sử dụng bể phản ứng quang sinh có tiềm năng trong sản xuất hơn sử dụng hệ thống ao mở. 1.2. Carotenoid Carotenoid là m t họ của các hợp chất có sắc tố được tổng hợp từ thực vật, vi sinh vật và đ ng vật. Trong thực vật, chúng tham gia vào b máy quang hợp và bảo vệ thực vật chống lại bức xạ m t trời. Trái cây và rau quả tạo thành các ngu n chính của carotenoid trong chế đ ăn uống của người. Carotenoid có tác dụng ngăn 12 ngừa các bệnh như bệnh tim mạch ung thư và c c bệnh mãn tính khác. Chúng cũng là tiền chất của vitamin A. Hình 1.3. Mô hình cấu trúc hóa học chung của một số carotenoid [23] Trong những năm gần đây c c đ c tính chống oxy hóa của carotenoid đã được quan tâm nghiên cứu [25] Cho đến nay có đến hơn 600 carotenoid được xác định trong tự nhiên. Tuy nhiên, chỉ có khoảng 40 có m t trong m t chế đ ăn uống phổ biến của con người. Trong số 40 carotenoid này thì có khoảng 20 carotenoid được tìm thấy trong máu và các mô của người. Gần 90% carotenoid trong chế đ ăn uống và cơ thể người được đại diện bởi -caroten, -caroten, lycopen, lutein và cryptoxanthin [17]. Carotenoid có cấu trúc polyisoprenoid g m 40 nguyên tử cacbon, là m t chuỗi dài liên hợp của liên kết đôi Được cấu tạo bởi 8 đơn vị isoprence liên tiếp nhau ở trung tâm phân tử tạo nên cấu trúc đối xứng. Có vài carotenoid mạch thẳng, nhưng đa số là những hợp chất có vòng 6 cạnh (ho c vòng 5 cạnh) ở m t đầu hay cả hai đầu của phân tử. Những carotenoid khác nhau bởi tận cùng chứa các nhóm chức kh c nhau nhưng đều có cấu trúc phân tử trung tâm giống nhau. Theo cấu trúc hóa học carotenoid được chia thành 2 loại là: caroten và xanthophyll.