Tài liệu Nghiên cứu môi trường tái sinh của một số giống ngô (zea mays l.) phục vụ chuyển gen

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG TÁI SINH CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG TÁI SINH CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (Zea mays L.) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN VŨ THANH THANH THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên. Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này. Thái Nguyên, ngày 13 tháng 09 năm 2014 Tác giả luận văn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, khoa Khoa học sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên là ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xi - . - thu . , nghiên cứu. , ngày 13 tháng 09 năm 2014 Tác giả luận văn Ngô Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN .................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 ...................................................................................................... 1 ...................................................................................... 2 ..................................................................................... 2 4. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3 1.1. Sơ lƣợc về cây ngô ..................................................................................... 3 .............................. 3 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây ngô ...................................................................... 6 1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam .................................. 7 .............. 10 1.2.1. Nghiên cứu tái sinh ngô trên thế giới .................................................... 10 1.2.2. Nghiên cứu tái sinh ngô ở Việt Nam .................................................... 14 1.3.Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng và thành phần môi trƣờng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở ngô ............................................... 14 1.3.1. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng ............................................ 14 của thành phần môi trƣờng ....................................................... 17 1.3.3. in vitro ........................................................... 19 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 21 .................................................................................. 21 2.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 2.3. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 22 2.4. Địa điểm, thời gian tiến hành nghiên cứu ................................................ 22 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 22 2.5.1. Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non ......................................................... 23 2.5.2. Tạo mô sẹo từ phôi và thân non ............................................................ 24 2.5.3. Nghiên cứu khả năng tái sinh cây từ mô sẹo ........................................ 26 2.5.4. Nghiên cứu điều kiện đƣa cây in vitro ra ngoài môi trƣờng ................. 26 2.6. Xử lý số liệu ............................................................................................. 27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 28 3.1. Tái sinh cây trực tiếp từ phôi non ............................................................ 28 3.1.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tuổi phôi đến khả năng tái sinh cây trực tiếp từ phôi non ........................................................................................ 28 ........................................................................ 30 non.......................................... 35 non .......... 36 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non ............... 38 -proline đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi non ......... 41 3 đến 2,4-D khả năng tạo mô sẹo từ phôi non ............. 44 ................... 48 3.4. Nghiên cứu phôi non ................................................................................... 51 kiện đƣa cây in vitro ra ngoài môi trƣờng .................... 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 55 I. Kết luận ........................................................................................................ 55 II. Đề nghị ....................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 56 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ 6 – benzylaminopurine 1 BAP 2 đtg 3 IAA Indole-3-acetic acid 4 IBA Indole-3-butyric acid 5 MS Murashige & Skoog, 1962 6 NAA 1 - naphthaleneacetic acid 7 Nxb 8 N6 Chu et al., 1975 9 2,4-D 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn 2009 - 2011 ...................................................................................... 7 Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012 ......................... 9 .............................................. 21 ................................................................. 28 Bảng 3.2. cây từ phôi ........................................................ 32 ........................... 34 LVN 25, LVL 61, LVN 66, LVN 99, ... 36 hƣởng của 2,4-D ............................................................................ 39 Bảng 3.6 - ............................................................................ 43 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của AgNO3 ............................................................................ 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii - .......................................................................................... 48 ........................................................................................... 51 in vitro sau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu .................................................. 54 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC HÌNH .................................... 5 ở 3.1. ổi phôi đế từ phôi non 885 ............................................................................ 29 ở 3.2. đế từ phôi non LVN 885 ............................................................ 32 ........................................................................................... 35 ở 3.4. 885 ...................................................................................... 37 của 2,4-D ............................................................................................... 40 3.6. Mô 885 - .................... 41 - ............................................................................................... 44 3.8. Ảnh hƣởng của AgNO3 ....................................................................................................... 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix 25, LVN 61, LVN 66, LVN 99, LVN 885 AgNO3 ............................................... 46 25, LVN 61, ............................................................................................... 49 3.11. 99, LVN 885 - .................... 50 ..................................................................................................... 52 o phôi ................... 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Cây ngô (Zea mays L.) là cây lƣơng thực giàu dinh dƣỡng có vai trò quan trọng trong nền kinh tế t . - - hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Cây ngô đƣợc gieo . Theo thống kê của FAO, năm 2012 cây ngô diện tích 177,38 triệu ha, [56 . Những năm gần đây, nhờ việc sử dụng phƣơng pháp chuyển gen đã tạo ra nhiều giống ngô mới có giá trị dinh dƣỡng cao [38], [53]; có khả năng chống chịu với các điều kiện môi trƣờng hạn, ,… . Thực tế nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy in vitro gô . Mặt khác, nguồn vật liệu , quá trình tái sinh ngô thƣờng chỉ đƣợc thực hiện thông qua sự tái sinh phôi hoặc mô sẹo [41]. Trong đó, mô sẹo đƣợc hình thành từ phôi non hay từ lát cắt của thân cây non. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu môi trường tái sinh của một số giống ngô (Zea mays L.) phục vụ chuyển gen”. 2. Xác định đƣợc các điều kiện thích hợp để tái sinh cây từ phôi non và từ mô sẹo của 5 giống ngô. 3. - Xác định thành phần môi trƣờng nuôi cấy phù hợp để tái sinh cây trực tiếp từ phôi non của 5 giống ngô. - Xác định thành phần môi trƣờng phù hợp để tạo mô sẹo từ phôi non và thân non của 5 giống ngô. - Xác định môi trƣờng phù hợp để tái sinh cây từ mô sẹo hình thành từ phôi non của 5 giống ngô. - in vitro 4. Ý nghĩa khoa học . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ . 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về cây ngô Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., thuộc chi Maydeae, họ Hòa thảo (Poaceae), bộ Hòa thảo (Poales [55]. Có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc cây ngô dựa trên những kết quả nghiên cứu khảo cổ học, di truy . [7], [56]. Ở Việt Nam, cây ngô có nguồn gốc từ Trung Quốc, đƣợc trồng vào khoảng thế kỷ XVII, do (theo “Vân Đài loại ngữ” của Lê Quý Đôn). năm 1920, Sturtevantel đi (c ) sau đây [6]: 1- Ssp amilaceae - ngô bột 2- Ssp indentata - ngô răng ngựa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 3- Ssp indurate - ngô đá rắn 4- Ssp everta - ngô nổ 5- Ssp saccharata - ngô đƣờng 6- Ssp ceratina 7- Ssp tunicate Đây là cách phân loại theo đặc điểm thực vật học, ngoài ra ngô còn đƣợc phân loại theo nông học, sinh thái học, thời gian sinh trƣởng và thƣơng phẩm [10]. - phận sau: rễ, thân, lá, hoa (bông cờ, bắp ngô) và hạt.  : rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Rễ mầm (rễ tạm thời, rễ hạt) mọc từ trụ lá mầm, chức năng chính của rễ này là hút nƣớc, thức ăn khi cây còn non dƣới lên trên. Rễ đốt giúp cây hút nƣớc và dinh dƣỡng. Rễ chân kiềng (rễ chống) mọc quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này giúp cây chống đổ, bám chặt vào đất, tham gia hút nƣớc và thức ăn cho cây. Thân cây đặc và khá chắc, chia nhiều lóng (dóng) to dần từ dƣới lên, nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5  Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và đối xứng xen kẽ nhau, hình dải 50 - 100 cm, rộng 5 - 10 cm. Căn cứ vào vị trí và hình thái lá trên cây, lá ngô đƣợc chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá ngọn, lá bi.  Hoa ngô ; hoa cái mọc sát nhau, đƣợc bao bằng lá bắc to, vòi nhụy dài, quả dĩnh, hạt xếp thành hàng, các bắp ngô là các cụm hoa cái hình bông đƣợc bao bọc trong một số lớp lá và đƣợc bao chặt vào thân [2], [10]. Hạt ngô gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơron, phôi, nội nhũ và chân hạt. Vỏ hạt là một màng nhẵn bao xung quanh hạt. Lớp alơron nằm dƣới vỏ hạt và bao lấy nội nhũ . Phôi ngô Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6 chiếm 1/3 thể tích của hạt, gồm có các phần: ngù (phần ngăn cách giữa nội nhũ và phôi), lá mầm, trụ dƣới lá mầm, rễ mầm và chồi mầm [12]. 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây ngô Ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu, ngô đứng thứ 3 sau lúa mì và lúa gạo. Nhƣng ngô lại giàu dinh dƣỡng hơn lúa mì và lúa gạo, góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, đặc biệt các nƣớc thuộc châu Mỹ La Tinh. đƣợc ứng dụng nhiều thành tựu khoa học về các lĩnh vực di truyền học, chọn giống, công nghệ sinh học, cơ giới hóa, điện khí hóa và tin học vào công tác nghiên cứu và sản xuất [12]. . Với tỷ nguyên liệu cho công nghiệp. gƣời ta đã sản xuất khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lƣơng thực - thực phẩm, công nghiệp dƣợc và công nghiệp nhẹ ngô xu . Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng trong thức ăn tổng hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tƣởng cho gia súc, đặc biệt là bò sữa tỷ tỷ lệ này rất cao nhƣ Mỹ 76%, Bồ Đào Nha 91%, Malaysia 91% (CIMMYT, 2001). , cần khoảng 4 triệu tấn ngô mỗi năm. Riên 2,33 [57] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 7 ilin, Streptomicin, sản xuất axit acetic. nhƣ aceton, nhựa hóa học. Phôi ngô chứa 17,2 - 56,8% lipid nên có thể dùng để ép dầu [2]. 1.1.3. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới Ngô là cây trồng có địa bàn phân bố rộng, đƣợc gieo trồng khắp trên thế giới với sản lƣợng hàng năm cao hơn bất kỳ cây lƣơng thực nào. Năm 1961, năng suất ngô trung bình trên thế giới chỉ đạt 20 tạ/ha thì đến năm 2011 đã l 51,84 tạ/ha, tăng gấp 1,5 lần. Ngô đƣợc trồng ở hầu hết các nơi trên thế giới nhƣ Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi và Châu Á. Do điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng, tập quán canh tác dẫn đến diện tích, sản lƣợng và năng suất ngô ở các khu vực có sự chênh lệch nhau, điều đó đƣợc thể hiện ở bảng 1.1 [54]. Bảng 1.1. Tình hình sản xuất ngô ở một số khu vực trên thế giới giai đoạn 2009 - 2011 Diện tích (triệu ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lƣợng (triệu tấn) Khu vực 2009 2010 2011 2009 2010 2011 2009 2010 2011 Châu Âu 13,8 14,1 16,45 60,7 60,6 65,99 84,0 85,6 108,5 Châu Á 53,5 53,7 54,81 43,8 45,8 49,41 234,5 246,1 270,9 Châu Mỹ 61,4 63,1 64,5 71,9 71,0 67,96 441,5 447,9 438,4 Thế giới 158,8 161,9 170,39 51,6 52,1 51,84 819,7 844,4 883,4 (Nguồn FAOSTAT, 2012) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 8 Qua bảng 1.1 cho thấy, châu Mỹ . Châu Mỹ chiếm 37,85% diện tích và 49,65% sản lƣợng. thứ hai là châu Á với diện tích trồng ngô chiếm 32,2% diện tích trồng ngô thế giới nhƣng năng suất thấp chỉ đạt 49,41 tạ/ha (năm 2011) và xếp ở vị trí thứ ba. Châu Âu có năng suất khá cao nhƣng diện tích trồng ngô rất thấp, chiếm chƣa đến 10% diện tích trồng ngô thế giới, do đó sản lƣợng chỉ đạt 12,28% tổng sản lƣợng thế giới. Trong những năm gần đây, diện tích trồng ngô ở châu Á và châu Âu đang mở rộng, cho sản lƣợng ngô của châu Âu tăng vọt thêm 26,8% chỉ trong 1 năm (2010 2011). Ngƣợc lại, ở Châu Mỹ diện tích trồng ngô tăng nhƣng năng suất và sản lƣợng giảm. Những năm gần đây áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật tiên tiến, đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngô lai nên năng suất và sản lƣợng ngô thế giới có sự nhảy vọt, nhất là ở các nƣớc có nền kinh tế phát triển thâm canh và sử dụng 100% giống ngô lai trong sản xuất. Bên cạnh đó, việc ứng dụng công nghệ sinh học tạo ra các giống ngô chuyển gen năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh cũng góp phần sản lƣợng ngô thế giới. 1.1.3.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam Ngô đƣợc đƣa vào nƣớc ta cách đây khoảng 300 năm và trở thành cây lƣơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây thêm tiến bộ kỹ thuật, đặc biệt là về giống, cây ngô đã có những bƣớc tăng trƣởng đáng kể về diện tích, sản lƣợng và năng suất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 9 Bảng 1.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 - 2012 Diện tích Sản lƣợng Năng suất (triệu ha) (triệu tấn) (tạ/ha) 1975 0,267 0,28 10,51 1990 0,432 0,67 15,54 2000 0,730 2,01 27,47 2006 1,033 3,85 37,31 2007 1,096 4,30 39,26 2008 1,440 4,57 31,75 2009 1,089 4,37 40,14 2010 1,126 4,61 40,90 2011 1,121 4,84 43,13 2012 1,118 4,80 42,95 Năm (Nguồn: FAOSTAT 2013 [55]) . Năm 1975, diện tích ngô chƣa đến 300 nghìn ha, năng suất 10,51 tạ/ha. Nếu nhƣ năm 1990, năng (3,85 triệu tấn). trồng ngô lai, kết hợp áp dụ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/