Tài liệu Nghiên cứu môi trường tái sinh cây dừa cạn (catharanthus roseus (l.) g. don) phục vụ chuyển gen

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ ANH NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ ANH NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 62.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ TÂM THÁI NGUYÊN - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015 Tác giả Trần Thị Anh Xác nhận của khoa chuyên môn Người hướng dẫn khoa học PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi nhận được sự quan tâm giúp đỡ của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hoàn thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm, GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên). Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện quá trình nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô giáo, cán bộ khoa, các thầy cô giáo thuộc khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015 Tác giả Trần Thị Anh ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ...........................................................................................................iii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... iv DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ v DANH MỤC HÌNH............................................................................................. vi MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 1.1. Giới thiệu chung về cây dừa cạn ............................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại ............................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn ...................................................... 3 1.1.3. Phân bố sinh thái.................................................................................... 5 1.1.4. Kỹ thuật trồng dừa cạn .......................................................................... 5 1.1.5. Ứng dụng của cây dừa cạn trong y học ................................................. 7 1.2. Nhân giống in vitro bằng công nghệ tế bào thực vật ................................ 9 1.2.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro .................................... 9 1.2.2. Quy trình nhân giống in vitro .............................................................. 13 1.3. Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật ............. 14 1.3.1. Auxin ................................................................................................... 14 1.3.2. Cytokinin ............................................................................................. 16 1.4. Một số nghiên cứu nuôi cấy dừa cạn bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro ..... 17 1.4.1. Tình hình nuôi cấy in vitro dừa cạn trên thế giới ................................ 17 iii 1.4.2. Tình hình nuôi cấy in vitro cây dừa cạn ở Việt Nam .......................... 20 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 22 2.1. Vật liệu, hoá chất ..................................................................................... 22 2.1.1. Vật liệu thực vật................................................................................... 22 2.1.2. Hóa chất, thiết bị.................................................................................. 22 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................... 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 22 2.2.1. Pha môi trường .................................................................................... 22 2.2.2. Khử trùng hạt ....................................................................................... 23 2.2.3. Nghiên cứu môi trường phát sinh chồi và sinh trưởng........................ 23 2.2.4. Phương pháp gây tổn thương tạo chồi................................................. 24 2.2.5. Nghiên cứu môi trường tạo rễ ............................................................. 24 2.2.6. Nghiên cứu giá thể đưa cây ra tự nhiên ............................................... 25 2.2.7. Xử lí và tính toán số liệu ..................................................................... 26 2.3. Điều kiện thí nghiệm ............................................................................... 26 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 27 3.1. Kết quả khử trùng hạt .............................................................................. 27 3.2. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm ............................................................................................................ 29 3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ................................................................ 30 3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ................................................................ 32 3.2.3. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm................................................................................................... 34 3.3. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA, BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách lá mầm dừa cạn ............................................................................................................ 36 3.3.1. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và NAA đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên ......................... 37 3.3.2. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên ......................... 39 3.3.3. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi dừa từ nách lá mầm.......................................................... 41 3.4. Kết quả tạo đa chồi bằng phương pháp gây tổn thương......................... 44 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA đến khả năng ra rễ của chồi dừa cạn trong ống nghiệm ........................................................... 46 3.5.1. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi dừa cạn trên môi trường MS................................................................................................... 46 3.5.2. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi dừa cạn trên môi trường MS .......................................................................................................... 47 3.5.3. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi dừa cạn trên môi trường ½ MS ...................................................................................................... 50 3.6. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh trưởng của cây con trong vườn ươm ....................................................................................... 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................ 54 PHỤ LỤC .............................................................................................................. DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine CS : Cộng sự CT : Công thức ĐC : Đối chứng DNA : Deoxyribonucleic acid HPLC : Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid KIN : Kinetin MS : Murashige và Skoog, 1962 NAA : Naphthalene acetic acid WHO : Tổ chức y tế thế giới. iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt (sau 10 ngày) ................................................. 27 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ......................................................... 30 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ........................................................................ 33 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm .................................................................................... 35 Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và NAA đến sự phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ................................. 38 Bảng 3.6. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và IBA đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ............................ 40 Bảng 3.7. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5mg/l và IBA đến sự phát sinh chồi sự sinh trưởng của chồi từ nách lá mầm ............................................................ 42 Bảng 3.8. Kết quả tạo đa chồi sau khi gây tổn thương ...................................... 44 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ .......................................... 47 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ ........................................ 48 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của dừa cạn (sau 8 tuần) ........................................................................................................ 50 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sinh trưởng của dừa cạn (sau 45 ngày) ................................................................................. 51 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây dừa cạn ......................................................................................... 4 Hình 1.2. Hoa của ba giống Catharanthus roseus................................................ 5 Hình 3.1. Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến sự nảy mầm của hạt dừa cạn.... 28 Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP 1,0mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) ............................................ 31 Hình 3.3. Ảnh hưởng của kinetin 1,0mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) ............................................ 34 Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP 0,5 mg/l đến phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm ........................................................................................... 36 Hình 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và NAA 0,4mg/l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau 8 tuần) ........................................................................................................ 39 Hình 3.6. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 1,0mg/l và IBA 0,6mg/l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên .................. 40 Hình 3.7. Ảnh hưởng kết hợp của BAP 0,5mg/l và IBA 0,4mg/l đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm .......................... 43 Hình 3.8. Kết quả tạo đa chồi sau khi gây tổn thương ...................................... 45 Hình 3.9. Rễ dừa cạn trong môi trường bổ sung NAA 0,2mg/l (sau 8 tuần) .... 47 Hình 3.10. Rễ dừa cạn trong môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l trên môi trường MS (sau 8 tuần) ....................................................................... 49 Hình 3.11. Rễ dừa cạn trong môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l trên môi trường ½ MS (sau 8 tuần) ................................................................... 51 Hình 3.12. Ảnh hưởng của giá thể đất hỗn hợp đất thịt + phù sa +cát đến sự sinh trưởng của dừa cạn ......................................................................... 52 vi MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, tỉ lệ ung thư trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng gia tăng rất nhanh, đặc biệt ung thư có tỉ lệ rất cao ở các nước đang phát triển. Theo thống kê tổ chức y tế thế giới WHO, tính đến năm 2012 mỗi năm có khoảng 14 triệu người mắc mới, 8,2 triệu người tử vong do ung thư, còn ở Việt Nam tính đến thời điểm hiện tại có khoảng 250.000 người mắc ung thư, hàng năm có thêm khoảng 150000 bệnh nhân mắc mới, số người tử vong mỗi năm 75.000 người. Hiện nay nhu cầu thuốc chưa ung thư nói riêng và các loại bệnh khác nói chung rất cao đặc biệt các chế phẩm thuốc từ cây dược liệu [27]. Tại “Chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” (được ban hành theo quyết định số 68/QĐ -TTg ngày 10/01/2014 của Thủ tướng Chính phủ), đưa ra mục tiêu cụ thể đến năm 2020 Việt Nam phấn đấu sản xuất được 20% nhu cầu nguyên liệu cho sản xuất thuốc trong nước. Thuốc sản xuất trong nước chiếm 80% tổng giá trị thuốc tiêu thụ trong năm, trong đó thuốc từ dược liệu chiếm 30%. Vì thế, cần tích cực trồng, bảo tồn bảo tồn cây dược liệu. Đẩy mạnh nghiên cứu, ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật để tạo ra các loại giống dược liệu có năng suất, chất lượng đáp ứng yêu cầu sản xuất. Dừa cạn là đối tượng cây dược liệu được nhà nước quan tâm để đưa vào sản xuất trên diện rộng [23]. Cây dừa cạn (Catharanthus roseu (L.) G.Don) thuộc họ Trúc Đào (Apocyinaceae) là một loại cây cảnh phổ biến đồng thời cũng là một loại thảo dược dân gian. Kinh nghiệm dùng dừa cạn chữa bệnh được ghi nhận ở Ấn Ðộ, Châu Úc, Nam Châu Phi, quần đảo Antilles [12]. Các nhà nghiên cứu khoa học đã khám phá ra khả năng chữa bệnh của dừa cạn nhờ nó chứa nhiều hợp chất alkaloid. Tất cả các alkaloid có trong dừa cạn thì vinblastine và vincritine là 2 chất có tác dụng tốt trong chữa một số loại ung thư, còn ajmalicine và serpentine là thuốc điều trị tim mạch rất tốt, đặc biệt rối loạn thần kinh tim. 1 Vinblastine và vincristine là thuốc lựa chọn hàng đầu trong điều trị ung thư máu [28]. Hàm lượng 2 loại alkaloid này trong dừa cạn tự nhiên rất thấp khoảng một phần vạn trong lá đối với vinblastine, đối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa [4]. Một trong những biện pháp tăng lượng alkaloid trong dừa cạn là phương pháp chuyển gen tăng hoạt tính của enzyme xúc tác các phản ứng tạo alkaloid. Tuy nhiên, để chuyển gen thành công điều kiện tiên quyết là phải xây dựng hệ thống tái sinh phù hợp. Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận văn: “Nghiên cứu môi trường tái sinh cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) phục vụ chuyển gen”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tìm được môi trường thích hợp cho tái sinh cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) phục vụ chuyển gen. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu khử trùng hạt tạo vật liệu ban đầu cho các bước nghiên cứu tiếp theo. (2) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm, đoạn thân mang mắt chồi bên. (3) Nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin và cytokinin đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng chồi từ nách lá mầm, đoạn thân mang mắt chồi bên. (4) Nghiên cứu phương pháp gây tổn thương tạo đa chồi. (5) Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin đến khả năng tạo rễ ở cây dừa cạn. (6) Xác định loại giá thể thích hợp để đưa cây ra ngoài tự nhiên. 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây dừa cạn 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại Tên gọi: Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L.) G. Don. Ngoài ra còn có các tên khác: Bông dừa, Hải đằng, Trường xuân hoa, Phjắc pót đông (Tày). Dừa cạn có tên nước ngoài là: Madagasca periwinkle, red periwinkle, pink periwinkle, rosy-flower Indian periwinkle, cape periwinkle, old maid (Anh); Pervenche malgache, Pervenche-tropicale (Pháp) [8], [26]. Phân loại: Dừa cạn thuộc giới thực vật (Plantae). Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta). Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida). Bộ Ngọc Lan (Apocynales). Họ Trúc đào (Apocynaceae). Chi Cantharanthus [8], [26]. Chi Catharanthus thuộc họ trúc đào (Apocynaceae), gồm 8 loài, hầu hết là cây thân thảo sống lâu năm, trong đó chỉ có 1 loài có nguồn gốc Ấn Độ còn lại có nguồn gốc Madagascar. Bộ nhiễm sắc thể của tất cả các loài là 2n = 16 [3], [12]. (1) Catharanthus coriaceus Markgr. (2) Catharanthus lanceus (Bojer ex A. DC.) Pichon. (3) Catharanthus longgifolius (Pichon) Pichon . (4) Catharanthus ovalis Markgr. Madagascar. (5) Catharanthus pusillus (Murray) G. Don. (6) Catharanthus roseus (L.) G. Don. (7) Catharanthus scitulus (Pichon) Pichon. (8) Catharanthus trichophyllus (Baker) Pichon. Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) Madagascar, có nguồn gốc Madagascar đã di nhập sang khu vực Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. 1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn 3 Dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân ở phía gốc hóa gỗ. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp. Kích thước lá dài 4 -6cm, rộng 2 - 3cm, hai mặt lá nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt. Hoa có màu trắng hoặc hồng tím, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn. Hoa có 3 loại: hoa có màu trắng, màu tím hồng, và loại hoa phía ngoài cánh hoa màu trắng phần tâm màu đỏ. Ống tràng dài 2,5 - 3cm, tràng hoa có đường kính 2cm - 4cm có 5 thùy tương tự như cánh hoa. Quả là một cặp quả đại dài 2 - 4 cm, rộng 3mm, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng trên mặt quả có các hạt nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa, quả gần như quanh năm [8], [26]. Hình 1.1. Cây dừa cạn Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole được phát hiện từ 3 giống cây khác nhau: (i) Catharanthus roseus var. roseus với hoa màu tím hồng; (ii) Catharanthus roseus var. ocellatus với hoa màu trắng; (iii) Catharanthus roseus var. albus với hoa màu trắng nhụy đỏ. 4 A B C Hình 1.2. Hoa của ba giống Catharanthus roseus (A: Catharanthus roseus var. roseus; B: Catharanthus roseus var. ocellatus C: Catharanthus roseus var. albus) 1.1.3. Phân bố sinh thái Dừa cạn mọc hoang dại và được trồng ở nhiều nước trên thế giới như Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Indonexya, Braxin, Châu phi, Châu Úc… Tại Châu Âu và Châu Mỹ những nơi nóng dừa cạn được trồng quanh năm, những nơi lạnh cây được trồng theo mùa [8]. Ở Việt Nam, cây dừa cạn mọc tự nhiên nhiều ở vùng bãi cát ven biển từ Hải Phòng đến Kiên Giang. Nơi tập trung nhiều nhất thuộc các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa. Ngoài ra, dừa cạn còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Ở những vùng ven biển dừa cạn mọc thuần trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc [8]. 1.1.4. Kỹ thuật trồng dừa cạn Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm, có khả năng chịu được hạn. Trong điều kiện trồng trọt, khi được cung cấp các điều kiện cần thiết, cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng tươi thu được có thể cao gấp đôi cây mọc từ tự nhiên. 5 Trong tự nhiên, hạt nảy mầm đạt khoảng 40%, nếu được xử lí có thể tăng lên 90%. Cây trồng từ hạt ra hoa sau 4 - 5 tháng. Trong thời kì sinh trưởng, nếu bị cắt cây tái sinh chồi khỏe. Nguồn cây dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm. Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu từ cây trồng tại Phú Yên [8]. Vào năm 1970, Viện Dược Liệu tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng dừa cạn trên quy mô sản xuất lớn. Cây được nhân giống bằng hạt, mỗi hecta cần gieo 500 - 700gr hạt trong vườn ươm. Thời vụ gieo hạt vào tháng 9, 10 hoặc tháng 1, 2. Ngâm hạt 3 - 4 giờ, vớt ra để ráo rồi gieo lên luống của vườn ươm đã được chuẩn bị kỹ, sau đó phủ rơm rồi tưới nước. Sau khoảng một tuần, hạt nảy mầm, cần tháo bỏ rơm rạ. Khi cây có 3 - 4 lá thật (khoảng 45 ngày sau khi gieo) đánh đi trồng. Có thể gieo thẳng nhưng cách này tốn công chăm sóc [11]. Dừa cạn ưa đất pha cát, đất phù sa, chịu hạn, kém chịu úng. Đất cần làm kỹ, lên luống 20cm, mặt luống rộng 50 - 60cm, dùng 10-15 tấn phân chuồng (đã hoại mục) và 120-150kg super lân để bón lót. Trồng với khoảng cách 30x30cm, sau khi trồng cần tưới ngay để cây mau bén rễ. Tưới thúc cho mỗi hecta 100-200kg urê, tưới 2 lần, cách nhau 1 tháng. Mặc dù cây chịu được hạn nhưng phải giữ đủ ẩm thường xuyên [11]. Sau khi trồng 3-4 tháng cây cho thu hoạch, cành mang lá 10-15cm được cắt về phơi sấy khô. Ở đất thoát nước và chăm bón tốt có thể thu hoạch nhiều lứa, trung bình 1 hecta thu được 1-1,2 tấn cây khô mỗi lứa [11]. Dừa cạn là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và có thời gian canh tác ngắn. Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt cho thấy, cây dừa cạn có thể phát triển tốt trên đất cát khô hạn ven biển các tỉnh miền Trung, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và tích lũy đủ hàm lượng alkaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu [11]. 6 1.1.5. Ứng dụng của cây dừa cạn trong y học 1.1.5.1. Thành phần alkaloid trong cây dừa cạn Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính base, thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật. Trong cây dừa cạn, có trên 70 loại alkaloid, trong đó 2 alkaloid là vinblastine và vincristine là hai hợp chất quan trọng nhất. Alkaloid có trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong lá và rễ. Dừa cạn có tỷ lệ alkaloid toàn phần là 0,1- 0,2%. Rễ chính chứa hoạt chất 0,7 - 2,4%; thân 0,46%; lá: 0,37 1,15%; rễ phụ: 0,9 - 3,7%; hoa: 0,14 - 0,84%; vỏ quả 1,14; hạt 0,18%. Các chất chủ yếu là: vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, prinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicine [24], [26]. Căn cứ vào cấu tạo hóa học, alkaloid trong cây dừa cạn được chia làm ba nhóm chính [26]: Nhóm alkaloid nhân indol: Perivine, peviridine, perosine, catharanthine, cavicine, ajmalicine... Nhóm alkaloid nhân indolin: vindoline, ajmaline, lochnericine, lochneridine, lochrovine... Nhóm alkaloid có 2 vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indolin như leurosine, leubcosidine... đặc biệt các alkaloid có tác dụng chữa bệnh ung thư nhưng có hàm lượng rất thấp như: Vinblastine (vincaleucoblastine) 0,005 0,015% trong lá, vincristine (leucocristine) 0,003 - 0,005% trong lá . 1.1.5.2. Tác dụng dược lý của alkaloid chứa trong dừa cạn Năm 1952, y học đã phát hiện ra dược tính của dừa cạn. Đến năm 1958 bác sĩ Clark Noble Canada đã nghiên cứu và chiết xuất được alkaloid vinblastine. Sau đó vài năm người ta cũng tìm ra được vincristine từ lá dừa cạn [8]. Đây là những chất có tác dụng điều trị bệnh ung thư khi chuyển về dạng muối sunfat. Alkaloid vinblastine và vincristine, là những chất ức chế sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, phong bế sự tạo thành các 7 vi ống và gây ngừng phân chia tế bào. Ở nồng độ cao vinblastine và vincristine diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào. Trên thị trường, thuốc Vinblastine (có tên Velban) là thành phẩm độc bảng A, thường đóng ống 5-10mg chế phẩm khô kèm theo 1 ống dung môi. Riêng vinblastine ít ảnh hưởng đến hồng cầu và tiểu cầu [28]. Ngoài ra, dừa cạn có vị hơi đắng, tính mát, có tác dụng kháng ung thư, trấn tĩnh, an thần, hạ huyết áp, thanh nhiệt, giải độc, hoạt huyết, tiêu thũng. Dừa cạn được nghiên cứu làm thuốc kìm hãm sự phát triển tế bào và được chỉ định trong điều trị bệnh Hodgkin (một loại ung thư hệ bạch huyết), bệnh bạch cầu lymphô cấp và một số loại ung thư khác. Trong dân gian, dùng dừa cạn trị cao huyết áp, trị bệnh đái đường, điều kinh, chữa tiêu hóa kém và chữa lỵ, thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít. Có người dùng dừa cạn trị ung thư máu, ung thư phổi, ngăn cản sự phát triển của thai trên động vật mang thai và kháng một số chủng nấm gây bệnh [3]. 1.1.5.3. Một số bài thuốc dân gian từ cây dừa cạn Theo kinh nghiệm sử dụng trong y học dân tộc của một số nước trên thế giới như Ấn Độ, Trung Quốc.. và theo y học dân tộc Việt Nam, rễ dừa cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt. Thân và lá có tác dụng làm săn da, lọc máu, dùng chữa một số bệnh ngoài da và nhất là chữa đái đường [8]. Dừa cạn còn có tác dụng chữa nhiều loại bệnh [25]: Bệnh máu trắng: Lấy thân và lá cây dừa cạn sắc uống khoảng 15g khô/ngày. Tăng huyết áp: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và 20g lá dâu, sắc lấy nước, chia uống từ 2 - 3 lần mỗi ngày. Cách khác, lấy 6g hoa dừa cạn, 10g nụ hoa hoè (hoặc 10g cúc hoa), hãm với nước sôi trong bình kín khoảng 20 phút. Uống thay nước trà mỗi ngày. Ung thư máu, viêm đại tràng: Lấy từ 15 - 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng, sắc, chia từ 2 - 3 lần uống trong ngày. 8 Mất ngủ: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng, 12g lá vông nem, 12g hạt muồng sao đen, sắc uống trước khi đi ngủ. Rong kinh: Lấy từ 20 - 30g dừa cạn sao vàng (toàn cây có cả hoa và rễ), sắc lấy nước, uống liên tục từ 3 - 5 ngày. Chữa bỏng nước sôi: Lá dừa cạn tươi lượng vừa đủ, giã nát, nhuyễn với chút gạo, đắp lên tổn thương bỏng. Điều trị Zôna thần kinh: Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16g, thổ linh 16g, bạch linh 10g, kinh giới 12g, chi tử 10g, nam tục đoạn 16g, cam thảo đất 16g, hạ khô thảo 16g. Sắc uống ngày 1 thang, sắc 3 lần, uống 3 lần. Thuốc đắp: lá dừa cạn, lá cây hòe. Hai thứ lượng bằng nhau, giã nhỏ đắp lên các tổn thương, băng lại. Tác dụng: làm giảm đau nhức. Điều trị lị trực trùng: Đi ngoài nhiều lần, bụng đau từng cơn, phân có chất nhầy, có máu mũi, sút cân nhanh. Bài thuốc: dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 20g, cỏ sữa 20g, cỏ mực 20g, chi tử 10g, lá khổ sâm 20g, hoàng liên 10g, rau má 20g, đinh lăng 20g. Đổ 3 bát nước sắc lấy 1,5 bát, chia 3 lần uống trong ngày. U xơ tuyến tiền liệt: Dừa cạn 12g, huyền sâm 12g, xuyên sơn 10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g, đinh lăng 16g. Sắc uống ngày 1 thang, chia 3 lần. 1.2. Nhân giống in vitro bằng công nghệ tế bào thực vật 1.2.1. Ưu thế và các phương thức nhân giống in vitro 1.2.1.1. Ưu thế nhân giống in vitro Kĩ thuật nhân giống in vitro phát triển và mở rộng trong những năm gần đây do nhu cầu về lượng giống cây trồng tăng cao. Các giống cây trồng cần lượng lớn nhằm phục vụ dự án trồng lại rừng, sản xuất lương thực, thực phẩm, dược liệu, thức ăn gia súc và bảo vệ môi trường. Nhân giống in vitro có những ưu điểm nổi bật mà các loại hình nhân giống khác không có được, đó là: (1) Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kì có thể tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di truyền[1], [2], [6], [14]. 9 (2) Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ một cây trong vòng 1 - 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây [1], [2], [6]. (3) Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ nhân dòng, tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp [1], [2], [14] (4) Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính theo phương pháp truyền thống [1], [2], [14] . (5) Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp hữu hiệu để loại trừ virut, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng suất 15 - 30% so với giống gốc [1], [14]. (6) Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay thân củ [1], [6], [9]. (7) Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy định về vệ sinh thực vật quốc tế [6], [9], [14]. (8) Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kì thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [6], [9], [14]. 1.2.1.2. Các phương thức nhân giống in vitro * Nuôi cấy mô phân sinh (đỉnh sinh trưởng) Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của tháp sinh 10