Tài liệu Nghiên cứu khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng curcuma longa l. nhằm định hướng tăng năng suất và chất lượng củ nghệ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Hoàng Kim Chi NGHIÊN CỨU KHU HỆ VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY NGHỆ VÀNG Curcuma longa L. NHẰM ĐỊNH HƯỚNG TĂNG NĂNG SUẤT VÀ CHẤT LƯỢNG CỦ NGHỆ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. Lê Mai Hương 2. TS. Trần Thị Như Hằng Hà Nội – 2020 MỤC LỤC Trang MỤC LỤC .................................................................................................................................. i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................... v LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................................... vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................................... ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ................................................................................. xi MỞ ĐẦU.................................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................................... 3 1.1 Một số vấn đề liên quan đến phân bón và năng suất cây trồng ............................. 3 1.1.1 Phân bón hóa học, phân bón hữu cơ hay phân bón sinh học?......................... 3 1.1.2 Quản lý dinh dưỡng tổng hợp ............................................................................. 5 1.1.3 Một số nhóm VSV hữu hiệu trong sản xuất phân sinh học .............................. 6 1.2 Cây nghệ vàng Cucuma longa L. và hợp chất curcumin trong củ nghệ ............... 9 1.2.1 Hợp chất curcumin trong củ nghệ vàng ........................................................... 10 1.2.1.1 Thành phần hóa học của củ nghệ vàng ........................................................... 10 1.2.1.2 Hoạt tính sinh y dược học của hoạt chất curcumin trong củ nghệ vàng ......... 11 1.2.2 Một số khía cạnh liên quan đến năng suất nghệ vàng .................................... 12 1.2.2.1 Khía cạnh sinh học .......................................................................................... 12 1.2.2.2 Khía cạnh nông nghiệp ................................................................................... 14 1.2.2.3 Chất lượng đất trồng, phân bón và năng suất nghệ vàng ................................ 15 1.3 Vi sinh vật vùng rễ cộng sinh với cây nghệ vàng .................................................. 16 1.3.1 Vi sinh vật vùng rễ thực vật .............................................................................. 16 1.3.2 Một số nhóm VSVVR liên quan đến năng suất cây nghệ vàng ....................... 19 1.3.2.1 Vi khuẩn rễ kích thích sinh trưởng trên cây nghệ vàng .................................. 20 1.3.2.2 Nấm rễ cộng sinh trên cây nghệ vàng ............................................................. 21 1.3.3 Mối liên hệ giữa khu hệ vi sinh vật cộng sinh và hàm lượng curcumin trong cây nghệ vàng ................................................................................................................... 22 1.3.3.1 Sự tổng hợp curcuminoid trong cây nghệ vàng .............................................. 22 1.3.3.2 Vi sinh vật và sự tạo thành curcumin trong cây nghệ ..................................... 23 1.4 Bước phát triển trong công nghệ nghiên cứu khu hệ VSV vùng rễ .................... 24 1.4.1 Một số phương pháp nghiên cứu khu hệ VSV đất........................................... 24 1.4.2 Metagenomics trong nghiên cứu khu hệ VSV vùng rễ .................................... 25 i CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 27 2.1 Nguyên vật liệu ......................................................................................................... 27 2.1.1 Giống nghệ ......................................................................................................... 27 2.1.1.1 Đặc điểm sinh học........................................................................................... 27 2.1.1.2 Mùa vụ và chế độ chăm sóc ............................................................................ 27 2.1.2 2.2 Hóa chất, trình tự mồi, môi trường và bộ chủng VSV..................................... 27 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 30 2.2.1 Thu mẫu và xác định các chỉ số lý hóa của mẫu đất ....................................... 30 2.2.1.1 Thu mẫu .......................................................................................................... 30 2.2.1.2 Xác định các chỉ số lý hóa của đất .................................................................. 30  Thành phần cơ giới ............................................................................................. 30  pH ....................................................................................................................... 30  Hàm lượng N tổng số ......................................................................................... 30  Hàm lượng P tổng số .......................................................................................... 30  Hàm lượng K tổng số ......................................................................................... 30  Hàm lượng N dễ tiêu .......................................................................................... 31  Hàm lượng P dễ tiêu ........................................................................................... 31  Hàm lượng K dễ tiêu .......................................................................................... 31 2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng phân bón N đến năng suất nghệ ..... 31 2.2.2.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng phân bón N đến năng suất 32 2.2.2.3 Xác định các chỉ tiêu nghiên cứu .................................................................... 33  Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng: ...................................................... 33  Xác định hệ số khối lượng khô/khối lượng tươi (%).......................................... 33  Xác định hàm lượng các chất curcuminoid ........................................................ 33 2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng phân bón N đến đa dạng khu hệ VSVVR cây nghệ .............................................................................................................. 35 2.2.3.1 Tách DNA tổng số từ các mẫu đất vùng rễ cây nghệ ..................................... 35 2.2.3.2 Giải trình tự metagenome amplicons .............................................................. 35 2.2.3.3 Phân tích tin sinh học ...................................................................................... 36  Tiền xử lý............................................................................................................ 36  Xác định vị trí phân loại ..................................................................................... 37  Phân tích đa dạng và hiển thị hóa ....................................................................... 37 2.2.4 Phân lập vi khuẩn PGPR và xác định hoạt tính kích thích sinh trưởng ........ 40 2.2.4.1 Phân lập vi khuẩn vùng rễ có khả năng hòa tan phosphate vô cơ .................. 40 ii 2.2.4.2 Xác định khả năng sinh IAA và kháng nấm gây bệnh ở thực vật................... 40 2.2.4.3 Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của các PGPR ......................................... 41 2.2.4.4 Xác định tên phân loại dựa trên trình tự đoạn gene 16S rDNA ...................... 41 2.2.5 Phân lập nấm AM và nghiên cứu đặc tính sinh học ....................................... 42 2.2.5.1 Phân lập bào tử nấm AM từ mẫu đất vùng rễ nghệ ........................................ 42 2.2.5.2 Khảo sát đa dạng nấm AM in situ dựa trên trình tự vùng gen 18S rRNA ...... 42 2.2.5.3 Xác định tên phân loại nấm AM bằng kỹ thuật Nested PCR.......................... 43 2.2.5.4 Xác định đặc điểm hình thái của bào tử nấm AM .......................................... 43 2.2.6 Nghiên cứu tạo và thử nghiệm chế phẩm vi sinh vật vùng rễ cho cây nghệ .. 44 2.2.6.1 Tạo chế phẩm VSV vùng rễ cho cây nghệ...................................................... 44  Xác định khả năng gây độc của chủng VSV ...................................................... 44  Nhân nuôi nấm AM ............................................................................................ 44  Nhân sinh khối, tạo hỗn hợp vi khuẩn ................................................................ 45  Thu hồi bào tử, tạo hỗn hợp bào tử nấm rễ......................................................... 45  Phối trộn, tạo chế phẩm ...................................................................................... 45 2.2.6.2 Thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm VSV vùng rễ cho cây nghệ ................... 45  Bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 45  Xác định các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất .................................................. 46  Xác định khả năng tập nhiễm của các chủng VSV trong chế phẩm ................... 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................... 47 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ bón phân đạm hóa học đến năng suất cây nghệ 47 3.1.1 Xác định chất lượng nghệ giống thích hợp ...................................................... 47 3.1.2 Điều kiện thổ nhưỡng khu vực thí nghiệm ...................................................... 49 3.1.2.1 Đặc điểm khí hậu ............................................................................................ 49 3.1.2.2 Khảo sát các chỉ số môi trường của đất trồng nghệ ........................................ 50 3.1.3 Xác định năng suất nghệ theo chế độ bón phân N .......................................... 51 3.1.4 Xác định năng suất curcumin theo chế độ bón phân N .................................. 51 3.2 Khảo sát một số nhóm vi sinh vật hữu hiệu trong vùng rễ cây nghệ .................. 54 3.2.1 Khảo sát vi khuẩn rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) trong vùng rễ cây nghệ 54 3.2.1.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn PGPR ......................................................... 54 3.2.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân loại học của các chủng vi khuẩn lựa chọn 57 3.2.2 Khảo sát nấm AM trong vùng rễ cây nghệ ....................................................... 62 iii 3.2.2.1 Phân lập và khảo sát số lượng bào tử nấm AM từ mẫu đất vùng rễ cây nghệ 62 3.2.2.2 Đặc điểm hình thái và phân loại học của một số chủng nấm AM trong đất vùng rễ cây nghệ ............................................................................................................ 65 3.3 Nghiên cứu tác động của chế độ bón phân N đến đa dạng khu hệ vi sinh vật vùng rễ nghệ ........................................................................................................................ 68 3.3.1 Kết quả tách DNA tổng số từ các mẫu đất nghệ .............................................. 69 3.3.2 Kết quả giải trình tự metagenome amplicons ................................................... 69 3.3.3 Đánh giá đa dạng khu hệ vi khuẩn đất vùng rễ cây nghệ liên quan đến chế độ bón phân N ....................................................................................................................... 71 3.3.3.1 Phân tích các chỉ số đa dạng của khu hệ vi khuẩn vùng rễ cây nghệ ............. 71 3.3.3.2 Thành phần phân loài của các quần xã vi khuẩn vùng rễ cây nghệ ................ 74 3.3.4 Đánh giá đa dạng khu hệ nấm đất vùng rễ cây nghệ liên quan đến chế độ bón phân N 77 3.3.4.1 Phân tích các chỉ số đa dạng của khu hệ nấm vùng rễ .................................... 77 3.3.4.2 Thành phần phân loài của các quần xã nấm vùng rễ cây nghệ ....................... 80 3.3.5 Luận giải về tác động của chế độ bón phân N đến đa dạng khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ............................................................................................................... 82 3.3.5.1 Chế độ bón phân N có tác động tới khu hệ VSVVR cây nghệ hay không? ... 82 3.3.5.2 Cơ chế tác động của lượng phân bón N tới khu hệ VSVVR .......................... 83 3.3.6 Khác biệt trong thành phần một số nhóm vi sinh vật hữu hiệu trong vùng rễ cây nghệ ............................................................................................................................ 84 3.3.6.1 Vi khuẩn thuộc họ Bacilliaceae ...................................................................... 84 3.3.6.2 Nấm thuộc ngành Glomeromycota ................................................................. 85 3.4 Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học làm tăng năng suất của cây nghệ 87 3.4.1 Thử nghiệm tính an toàn của chủng VSV ....................................................... 87 3.4.2 Tạo chế phẩm sinh học từ các chủng VSVVR hữu hiệu ................................. 89 3.4.3 Thử nghiệm tác động của chế phẩm VSV ........................................................ 90 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 93 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ................................... 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................... 96 iv LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. TS. Lê Mai Hương và TS. Trần Thị Như Hằng. Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Hoàng Kim Chi v LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Học viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với sự kính trọng, lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS. TS. Lê Mai Hương và TS. Trần Thị Như Hằng là những người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Viện Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS. Eiko Kuramae, TS. Trần Hồ Quang, TS. Phạm Hoàng Nam, TS. Hồ Bích Hải, TS. Tjalf de Boer, và GS. Bram Brouwer cho sự giúp đỡ trong quá trình tôi thực hiện luận án này. Tôi xin cảm ơn các đề tài nghiên cứu mã số ĐTĐLCN.14/14 của Bộ Khoa học và Công nghệ, đề tài VAST 0205/17-18 của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ, và đề tài “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phân hủy phốt pho hữu cơ (OP) góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tăng năng suất cây trồng” của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã tài trợ cho các nghiên cứu trong luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè gần xa đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt luận án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, những người đã không ngại khó khăn và vất vả, luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Hoàng Kim Chi vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Diễn giải Abundance-based coverage estimator (Chỉ số ước đoán dựa ACE trên sự đa dạng) AM Arbuscular mycorhiza ((Nấm) rễ cộng sinh) AMF Arbuscular mycorhizal fungi (Nấm rễ cộng sinh) AOB BDMC ammonia-oxidizing bacteria (vi khuẩn oxy hóa ammonia) bis-demethoxy-curcumin C Carbon (các bon) c class (đơn vị phân loại: lớp) CoA cs. Coenzyme A Cộng sự Cur CUS DGGE Curcumin curcuminoid synthase (enzyme) DMC Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di gel biến tính gradient) demethoxy-curcumin DSE FISH Dark Septate Endophytes (VSV nội sinh có vách ngăn tối màu) Fluorescent insitu hybridization (Lai huỳnh quang tại chỗ) FYM GC% H HSD IAA K k LTR Farmyard Manure (Phân chuồng) guanine-cytosine content (thành phần GC, %) Hydrogen (Hydro) Honest Significant Difference (Khác biệt có ý nghĩa thật) Indole-3-acetic acid Potassium (Kali) kingdom (đơn vị phân loại: giới) long terminal region (vùng đuôi dài trong phiên mã), N NF NGS Nitrogen (nitơ) Nitrogen-fixer (Vi khuẩn cố định đạm) Next-generation sequencing (Giải trình tự thế hệ mới) NF-κB O OTU P p PAL nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells Oxygen (Oxy) Operational taxonomic unit (Đơn vị phân loại) Phosphorus (phốt pho) phylum (đơn vị phân loại: ngành) phenylalanine ammonia-lyase (enzyme) PCA Principal Component Analysis (Phân tích thành phần chính) vii PCoA Principal Coordinate Analysis (Phân tích tọa độ chính) PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PGPR Plant growth-promoting rhizobacteria (Vi khuẩn rễ kích thích sinh trưởng) PKS PSB PSF P and K solubilizers (VSV hòa tan lân và kali) Phosphate solublizing bacteria (vi khuẩn hòa tan phosphate) Phosphate solublizing fungi (nấm hòa tan phosphate) Pvc Phosphate vô cơ RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (Phản ứng sao chép chuỗi polymerase ngược) TMĐ (S)TT Tĩnh mạch đuôi (Số) thứ tự VSV Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) Vi sinh vật VSVVR Vi sinh vật vùng rễ XPM Xoang phúc mạc T-RFLP viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Các thành phần cơ bản trong củ nghệ vàng C. longa [31]. .......................... 10 Bảng 2. 1. Trình tự một số đoạn mồi sử dụng. .............................................................. 29 Bảng 3. 1. Một số đặc điểm sinh trưởng và khối lượng củ nghệ theo thời gian. ..........48 Bảng 3. 2. Kết quả phân tích các chỉ số môi trường của mẫu đất trồng nghệ tại vùng chuyên canh. .................................................................................................50 Bảng 3. 3. Năng suất củ nghệ tươi sau thu hoạch và hệ số khối lượng khô/tươi của củ nghệ tại mỗi chế độ canh tác ........................................................................51 Bảng 3. 4. Hàm lượng các chất curcuminoid trong nguyên liệu mẫu khô (%) và trong nguyên liệu mẫu tươi (%). ...........................................................................52 Bảng 3. 5. Năng suất curcumin của các chế độ canh tác nghệ. .....................................52 Bảng 3. 6. Khả năng hòa tan phosphate, phát triển trên môi trường không chứa đạm và sinh tổng hợp IAA của các chủng vi khuẩn. ................................................55 Bảng 3. 7. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm bệnh thực vật của các chủng vi khuẩn dựa trên đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm). ................................................56 Bảng 3. 8. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hiển vi của các chủng vi khuẩn lựa chọn. ......................................................................................................................58 Bảng 3. 9. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lựa chọn. ....................59 Bảng 3. 10. Kết quả tìm kiếm các đoạn trình tự tương đồng trên ngân hàng gene với đoạn 16S rDNA của các chủng vi khuẩn lựa chọn. .....................................60 Bảng 3. 11. Số lượng loài nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ cây nghệ dựa trên trình tự đoạn gene SSU 18S rRNA. ......................................................................64 Bảng 3. 12. Đặc điểm hình thái của các nhóm nấm AM phân lập được tử các mẫu đất vùng rễ cây nghệ. .........................................................................................65 Bảng 3. 13. Kết quả tìm kiếm các đoạn trình tự tương đồng trên ngân hàng gene với đoạn 18S rDNA của các chủng nấm AM lựa chọn. .....................................66 Bảng 3. 14. Nồng độ và hàm lượng của các mẫu DNA tổng số xác định bằng máy đo Nanodrop và Qubit. ......................................................................................70 Bảng 3. 15. Kết quả giải trình tự metagenome amplicons 16S và ITS của các mẫu DNA tổng số từ vùng rễ nghệ. .....................................................................70 Bảng 3. 16. Kết quả phân tích phân loại học dữ liệu giải trình tự metagenome 16S và các chỉ số đa dạng. .......................................................................................72 ix Bảng 3. 17. Kết quả phân tích phân loại học dữ liệu giải trình tự metagenome ITS và các chỉ số đa dạng. .......................................................................................78 Bảng 3. 18. Kết quả thử nghiệm độ an toàn của chủng vi khuẩn PGP-V21. ................88 Bảng 3. 19. Kết quả xác định các chỉ số ảnh hưởng của chế phẩm sinh học trên cây nghệ thử nghiệm. .......................................................................................... 90 Bảng 3. 20. Hiệu quả tập nhiễm của các bào tử AMF trong chế phẩm trên cây nghệ thử nghiệm. .........................................................................................................90 x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1. 1. Sự tham gia của các vi sinh vật trong chuyển hóa P giữa dạng cố định trong đất và dạng dễ hấp thu cho thực vật (dựa trên tài liệu của Richardson & Simpson [31]). ................................................................................................ 8 Hình 1. 2. (A) Cấu trúc hóa học của các chất curcuminoid: curcumin (Cur), DMC và BDMC; các thành phần tinh dầu nghệ: ar-turmerone (ar), α-turmerone và βturmerone (α/β). (B) Sắc ký đồ HPLC của các curcuminoids tổng (I), curcumin (II), DMC (III) và BDMC (III) [46]. ...........................................11 Hình 1. 3. Vùng rễ trong tương quan giữa đất và rễ thực vật (Dựa theo tài liệu của Reinhold-Hurek & cs. [72]) .........................................................................17 Hình 1. 4. Tác động của các chất tiết từ rễ thực vật đối với hoạt động của khu hệ VSVVR ở mức độ loài và mức độ quần xã (Dựa theo tài liệu của Huang & cs. [82]) ......................................................................................................................18 Hình 1. 5. Cấu trúc hóa học của Coenzyme A (CoA). Cấu trúc và thành phần của CoA bao gồm các cơ chất: pantothenate, pantetheine và nhóm adenosine phosphate......................................................................................................23 Hình 1. 6. Phương pháp metagenomics trong nghiên cứu khu hệ VSV đất vùng rễ (dựa theo tài liệu của Jansson & Hofmockel [129]).............................................26 Hình 2. 1. Bố trí thí nghiệm trồng nghệ theo RCBD.....................................................32 Hình 2. 2. Quy trình tách chiết và phân tích hàm lượng curcuminoid trong mẫu nghệ. ......................................................................................................................34 Hình 2. 3. Sơ đồ các bước giải trình tự thế hệ mới metagenome amplicons. ...............35 Hình 2. 4. Quy trình phân tích đa dạng khu hệ VSV sử dụng công cụ Qiime2 [119]. .36 Hình 3. 1. Biểu đồ liên hệ giữa khối lượng củ nghệ giống và năng suất củ nghệ tươi sau thu hoạch. .....................................................................................................48 Hình 3. 2. Năng suất và hàm lượng curcuminoid tổng trong củ nghệ của các chế độ canh tác nghệ. .......................................................................................................53 Hình 3.3. Cây phân loại của các chủng PGP-V5, PGP-V20, PGP-V21 và một số chủng vi sinh vật đã biết dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA đã công bố (Phương pháp maximum likelihood, 1000 bootstrap replicates). ............................... 61 Hình 3. 4. Số lượng bào tử nấm AM trong các mẫu đất vùng rễ cây nghệ ở các thời điểm theo dõi. ........................................................................................................63 xi Hình 3. 5. Cây phân loại của các chủng AM-N1, AM-N2 và AM-N3 và một số chủng vi sinh vật đã biết dựa trên trình tự đoạn gene 18S rRNA đã công bố (Phương pháp maximum likelihood, 1000 bootstrap replicates). ............................... 67 Hình 3. 6. Rarefaction của các OTU vi khuẩn quan sát được thuộc nhóm H và L. ......73 Hình 3. 7. Phân tích tọa độ chính (PCoA) cho các quần xã vi khuẩn thuộc nhóm H (N150, N350) (màu đỏ) và nhóm L (N0, N500) (màu xanh). .....................73 Hình 3. 8. Thành phần phân loại ở mức độ ngành của khu hệ vi khuẩn vùng rễ cây nghệ tại các chế độ bón phân N khác nhau. .......................................................... 75 Hình 3. 9. Thành phần phân loại ở mức độ lớp của khu hệ vi khuẩn vùng rễ cây nghệ tại các chế độ bón phân N khác nhau. ............................................................... 76 Hình 3. 10. Phân tích thành phần chính (PCA) cho các khu hệ vi nấm thuộc nhóm H (N150, N350) và nhóm L (N0, N500). ........................................................78 Hình 3. 11. Đường cong rarefaction của nhóm H và nhóm L dựa trên độ sâu trình tự (sequencing depth) của các OTU quan sát được..........................................79 Hình 3. 12. Thành phần phân loại trung bình ở mức độ ngành (phylum) của khu hệ nấm vùng rễ cây nghệ tại các chế độ bón phân N khác nhau (N0, N150, N350, N500)............................................................................................................80 Hình 3. 13. Thành phần phân loại trung bình ở mức độ lớp (class) thuộc ngành Ascomycota (hình trái) và Basidiomycota (hình phải) của nấm vùng rễ cây nghệ tại các chế độ bón phân N khác nhau (N0, N150, N350, N500). ........80 Hình 3. 14. Phân bố trung bình các OTU thuộc họ vi khuẩn Bacilliaceae trong mẫu đất vùng rễ cây nghệ thuộc các chế độ bón phân N0, N150, N350 và N500. ...84 Hình 3. 15. Phân bố trung bình các OTU của nấm thuộc ngành Glomeromycota trong mẫu đất vùng rễ cây nghệ thuộc các chế độ bón phân N0, N150, N350 và N500. ............................................................................................................86 Hình 3. 16. Sự tập nhiễm của bào tử AM trong rễ cây nghệ tại lô CP dưới dạng vesicle (hình trái) và arbuscule (hình phải). ............................................................. 91 xii 1 MỞ ĐẦU Curcumin là một hoạt chất có giá trị trong củ của cây nghệ vàng Curcuma longa L., một loài thực vật phân bố chủ yếu ở các nước thuộc khu vực Nam Á và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Curcurmin và các chất curcuminoids có hoạt tính sinh dược học phong phú, bao gồm hoạt tính diệt tế bào ung thư, kháng sinh, chống oxi hóa, chống đông máu, kháng virus, v.v.. Trong những năm vừa qua, trước nhu cầu lớn về curcumin để phục vụ công nghiệp dược nhằm tạo ra các loại thuốc điều trị bệnh hiệu quả, lượng nghệ trên thế giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng đang đứng trước thực trạng không đáp ứng đủ nguyên liệu cho sản xuất. Vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách cải tiến kỹ thuật canh tác và bảo quản sau thu hoạch cây nghệ, kết hợp sử dụng công nghệ sinh học để làm tăng phẩm chất và hàm lượng chất chính của đối tượng nghiên cứu. Trong bối cảnh cần phát triển nền nông nghiệp bền vững và duy trì cân bằng sinh thái thì việc canh tác sử dụng quá nhiều phân bón hóa học cần phải hạn chế, đồng thời cần chú trọng hơn đến chế phẩm sinh học có thành phần chính là các vi sinh vật hữu hiệu. Trong đó, giải pháp cần được cân nhắc là cải tiến năng suất mùa vụ và tăng hàm lượng curcumin trong củ nghệ bằng con đường công nghệ sinh học. Ngày nay, qua nhiều nghiên cứu đã và đang thực hiện, vai trò của các vi sinh vật vùng rễ trong việc thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp trong thực vật đã được xác định và chứng minh. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài luận án “Nghiên cứu khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng Curcuma longa L. nhằm định hướng tăng năng suất và chất lượng củ nghệ” với định hướng khai thác nguồn vi sinh vật này nhằm nâng cao hàm lượng hoạt chất có giá trị từ cây trồng một cách hiệu quả. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của đề tài luận án nhằm nghiên cứu và khai thác nguồn vi sinh vật vùng rễ, đặc biệt là các nhóm vi khuẩn và nấm vùng rễ hữu hiệu của cây nghệ vàng C. longa, để tạo cơ sở xây dựng hệ thống quản lý dinh dưỡng tổng hợp thích hợp cho cây nghệ trồng tại Việt Nam, giúp nâng cao năng suất và hàm lượng hoạt chất curcuminoid trong củ nghệ một cách an toàn và bền vững. 2 Nội dung nghiên cứu Để thực hiện được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính của luận án bao gồm: (i) Nghiên cứu mối liên hệ giữa chế độ bón phân đạm hóa học và năng suất của cây nghệ; (ii) Phân lập và nghiên cứu hoạt tính một số nhóm vi sinh vật vùng rễ cây nghệ vàng; (iii) Nghiên cứu đa dạng khu hệ vi sinh vật vùng rễ và mối liên hệ với chế độ bón phân đạm hóa học cho năng suất cao; và (iii) Nghiên cứu tạo chế phẩm và hiệu quả tập nhiễm một số vi sinh vật trong chế phẩm vào rễ cây nghệ vàng. Những đóng góp mới của luận án Luận án đã đóng góp một số điểm mới như sau:  Dữ liệu đầu tiên về ảnh hưởng của các chế độ bón phân đạm hóa học đến năng suất cây nghệ vàng tại Việt Nam.  Dữ liệu đầu tiên về tác động của các chế độ bón phân đạm hóa học đến khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây nghệ tại Việt Nam bằng phương pháp metagenome. Đây cũng là một trong những nghiên cứu đầu tiên ở quy mô khu hệ vi sinh vật vùng rễ cây thuốc.  Dữ liệu đầu tiên về vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng (PGPR) và nấm rễ nội sinh (AM) từ vùng rễ cây nghệ tại Việt Nam, và một số chủng vi sinh vật bản địa hữu hiệu có tiềm năng ứng dụng tạo chế phẩm sinh học cho cây nghệ.  Thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học đầu tiên cho cây nghệ tại Việt Nam, qua đó khẳng định tiềm năng ứng dụng các vi sinh vật vùng rễ này trong tạo chế phẩm hiệu quả và an toàn, không chỉ cho cây nghệ mà còn cho nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế khác. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1 Một số vấn đề liên quan đến phân bón và năng suất cây trồng Để chuyên canh cây trồng cần phải đảm bảo cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng vào đất, bao gồm các yếu tố dinh dưỡng đa lượng và vi lượng. Trong đó, đạm (ni-tơ, N), lân (phốt-pho, P) và ka-li (K) là các nguyên tố đa lượng quan trọng nhất ảnh hưởng đến sinh trưởng, năng suất và chất lượng của cây trồng: N ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tạo diệp lục cũng như tác động đến hiệu suất tổng hợp hữu cơ của cây trồng [1], P là thành phần không thể thay thế trong cấu tạo vật chất di truyền và gián tiếp giúp tăng cường hấp thụ các dinh dưỡng khác cho cây trồng, K đóng vai trò là chất điều hòa tính thấm của thành tế bào thực vật và trung hòa các axit hữu cơ liên quan đến hoạt động sinh lý của cây trồng [2]. Chính vì vậy, các nguồn N, P và K nói chung được coi là yếu tố quan trọng bậc nhất trong canh tác nông nghiệp hiện đại. Tuy nhiên, việc lạm dụng quá nhiều phân bón lại có tác dụng xấu đến môi trường và sức khỏe con người và đang trở thành một vấn nạn toàn cầu. Có thể nói, việc sử dụng phân bón hóa học trong nông nghiệp hiện đại đang đặt ra một bài toán lớn cho các nhà khoa học và các nhà hoạch định chính sách. Bài toán đó có thể tóm lại trong hai câu hỏi lớn, đó là: (A) Có nên tiếp tục sử dụng phân bón hay không? và (B) Làm thế nào để sử dụng hợp lý phân bón hóa học nhằm giảm thiểu tác động tới môi trường? Sau đây là một số luận cứ để chúng ta đi tìm câu trả lời cho những câu hỏi lớn đó. 1.1.1 Phân bón hóa học, phân bón hữu cơ hay phân bón sinh học? Trong đất tự nhiên luôn có sẵn một lượng nhất định các chất dinh dưỡng cần thiết cho thực vật phát triển, nhưng phần lớn ở dạng không có sẵn cho cây và chỉ một phần nhỏ được giải phóng mỗi năm thông qua hoạt động sinh học hoặc các quá trình hóa học. Sự chuyển hóa dinh dưỡng tự nhiên này quá chậm để bù đắp cho phần dinh dưỡng mất đi do sản xuất nông nghiệp, do đó, phân bón được tạo ra để bổ sung các chất dinh dưỡng cho đất trồng. Dựa trên quy trình sản xuất, phân bón có thể được phân loại thành ba nhóm: Phân bón hóa học; Phân bón hữu cơ và Phân bón sinh học. Việc sử dụng phân bón hóa học, phân bón hữu cơ hoặc phân bón sinh học có những ưu điểm và nhược điểm trong cung cấp dinh dưỡng, tăng trưởng cây trồng và bối cảnh chất lượng môi trường. Những ưu và nhược điểm này cần được cân nhắc để đạt được hiệu suất tối ưu theo từng loại phân bón và thực hiện quản lý dinh dưỡng cân bằng cho sự phát triển của cây trồng. 4 Ưu điểm của việc sử dụng phân bón hóa học gồm có: (i) Dinh dưỡng có thể hòa tan nhanh và sẵn sàng đáp ứng cho cây trồng, do đó hiệu quả thường trực tiếp và nhanh chóng; (ii) Giá thành của phân bón hóa học luôn thấp hơn hơn so với phân bón hữu cơ, do đó phổ biến hơn và dễ dàng hơn cho người sử dụng; (ii) Phân bón hóa học có hàm lượng dinh dưỡng cao nhất, với chỉ một lượng nhỏ là đủ cho tăng trưởng cây trồng. Tuy nhiên, nhược điểm của việc sử dụng phân bón hóa học không hề nhỏ. Một là, việc sử dụng quá mức có thể dẫn đến các tác động tiêu cực như rửa trôi, ô nhiễm tài nguyên nước, phá hủy vi sinh vật (VSV) và côn trùng có lợi, dễ bị sinh vật gây bệnh tấn công, gây axit hóa hoặc kiềm hóa đất và giảm độ phì nhiêu của đất, do đó gây ra thiệt hại không thể khắc phục cho toàn bộ hệ sinh thái [3]. Hai là, lượng phân bón N hóa học dư thừa có thể làm mềm mô thực vật, dẫn đến cây nhạy cảm hơn với bệnh tật và sâu bệnh. Ngoài ra, phân bón hóa học còn làm tăng cường sự phân hủy chất hữu cơ trong đất, dẫn đến suy thoái cấu trúc đất. Bên cạnh đó, khi phân bón bị rửa trôi và xâm nhập vào các tầng nước mặt và nước ngầm sẽ gây ra ô nhiễm, mất cân bằng sinh thái, phát thải khí gây hiệu ứng nhà kính như N2O hay NO, hay gây bệnh thiếu máu ở người [3, 4]. Phân hữu cơ là những loại phân bón chứa các chất dinh dưỡng dưới dạng những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ các sinh vật, được sử dụng cải tạo đất và bổ sung chất dinh dưỡng cho cây trồng. Phân hữu cơ truyền thống bao gồm các loại phụ phẩm công nông nghiệp, hay các loại phân chuồng, phân xanh. Hiện nay phân hữu cơ được sản xuất công nghiệp với nhiều loại có nguồn gốc đa dạng, và phát triển theo hướng kết hợp với các chất khoáng hoặc vi sinh vật có lợi dưới dạng phân bón hữu cơ khoáng và hữu cơ vi sinh nhằm tăng cường hiệu quả chuyển hóa và hấp thu dinh dưỡng cho cây trồng. Mặc dù vậy, tốc độ giải phóng dinh dưỡng từ phân bón hữu cơ vào đất quá chậm và khó kiểm soát nên có thể ảnh hưởng đến sự phát triển của cây trồng, đặc biệt là những cây trồng ngắn ngày. Ngoài ra, việc áp dụng lâu dài hoặc quá nhiều phân bón hữu cơ cũng có thể dẫn đến tích tụ muối, dinh dưỡng hoặc kim loại nặng và có thể ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của thực vật, sinh vật đất, chất lượng nước và sức khỏe của con người và động vật [5]. Phân sinh học là loại phân bón có thành phần bao gồm các VSV sống ở dạng tế bào hoặc bào tử, có khả năng tập nhiễm vào hạt giống, bề mặt hoặc nội mô của thực vật, vùng rễ hoặc đất trồng, giúp thực vật dễ dàng hấp thu dinh dưỡng và tăng cường sinh trưởng. Các chủng VSV có hiệu quả cố định đạm, hòa tan phosphate hoặc giúp làm tăng 5 tốc quá trình chuyển hóa các chất dinh dưỡng cho thực vật đồng hóa [6]. Phân sinh học giúp thực vật phát triển tốt hơn và cho năng suất cao hơn. Phân sinh học khác với phân bón hóa học và hữu cơ ở chỗ, chúng không trực tiếp cung cấp bất kỳ chất dinh dưỡng nào cho cây trồng, mà chỉ đóng vai trò gián tiếp, bởi chúng là chất mang của một số VSV đặc biệt giúp tăng cường chuyển hóa dinh dưỡng trong đất và tăng hấp thu dinh dưỡng cho thực vật, từ đó làm tăng cường sức sống cho cây và năng suất mùa vụ. Tuy nhiên, phân bón sinh học đòi hỏi những đánh giá kỹ lưỡng liên quan đến điều kiện tác dụng cũng như mật độ và tính an toàn của các chủng VSV thành phần [7]. Đặc biệt, trước khi đưa một loại phân sinh học vào sử dụng, cần đánh giá kỹ những tác động về sinh thái học của chúng đối với khu hệ VSV trong đất để sử dụng một cách hợp lý và không tạo ra những nguy cơ tiềm ẩn trong môi trường. 1.1.2 Quản lý dinh dưỡng tổng hợp Sử dụng kết hợp phân bón hóa học và hữu cơ để sản xuất cây trồng bền vững đã được chứng minh là rất có lợi. Một số nhà nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả có lợi của việc sử dụng kết hợp phân bón hóa học và hữu cơ để giảm thiểu sự thiếu hụt nhiều chất dinh dưỡng thứ cấp và vi chất trong các lĩnh vực liên tục chỉ nhận được phân bón N, P và K trong vài năm, mà không cần bất kỳ loại phân bón vi lượng hoặc hữu cơ nào. Nghiên cứu năm 2005 trên cây húng (Ocimum basilicum L. cv. Vikas Sudha) cho thấy, năng suất và hàm lượng tinh dầu trong cây húng ở các lô bón phân hữu cơ kết hợp với phân hóa học cao hơn hẳn so với các lô chỉ bón một trong hai loại phân, ngoài ra việc bón kết hợp hai loại phân trên còn giúp làm cải thiện các chỉ số dinh dưỡng như hàm lượng C tổng số, N và P dễ tiêu trong đất [5]. Xét về hiệu suất sử dụng, phân bón hóa học và phân bón hữu cơ có hiệu quả sử dụng thấp, có nghĩa là chỉ một phần các chất dinh dưỡng từ các loại phân này được thực vật hấp thụ [8]. Ví dụ, phần lớn phân lân bị kết tủa sau khi bón vào đất, hay phân đạm trong đất có thể bị mất qua quá trình lọc nitrat, dẫn đến ô nhiễm nước ngầm [8, 9]. Phân bón sinh học giúp cải thiện hiệu quả chuyển hóa của phân bón hóa học. Chẳng hạn, một số vi khuẩn có tác dụng tích cực nhất định đối với sự hấp thu N từ đất [10, 11, 12], hay việc tập nhiễm nấm rễ nội cộng sinh giúp hòa tan P và tăng hấp thu dinh dưỡng của cây, cho năng suất cây trồng cao hơn [13, 14]. Như vậy, việc kết hợp giữa các loại phân bón hóa học và hữu cơ với phân sinh học sẽ là giải pháp cho tương lai, cho một nền nông nghiệp có hiệu quả cao và bền vững. 6 ‘Quản lý dinh dưỡng tổng hợp’ (Integrated Nutrient Management, INM) là hệ thống canh tác ra đời từ cuối thế kỷ 20, và chỉ được chú trọng phát triển từ đầu những năm 2000, nhằm hạn chế các tác dụng tiêu cực của phân bón hóa học [15]. INM giúp giảm thiểu lượng phân bón hóa học nhưng làm tăng hiệu suất sử dụng dinh dưỡng bằng các kết hợp giữa các loại phân bón nhân tạo (phân hóa học) và tự nhiên (phân hữu cơ, phân sinh học) cho thực vật nhằm làm tăng năng suất một cách hiệu quả, thân thiện môi trường và duy trì tính ổn định cao [15, 16]. Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy, khi áp dụng hệ thống INM thì năng suất thu hoạch sẽ tăng từ 8 đến 150% so với các cách thức canh tác truyền thống, mặt khác duy trì chất lượng và tính ổn định của đất trồng cho nhiều mùa vụ sau [17]. Những phân tích trên đây có thể coi là một số luận cứ chính cho câu hỏi (A) và (B) đã nêu. Một là, phân bón có vai trò không thể thay thế đối với cây trồng và với vấn đề an ninh lương thực toàn cầu cũng như nhu cầu khai thác hợp chất thiên nhiên phục vụ tiêu dùng xã hội. Hai là, các loại phân nói chung và phân bón hóa học nói riêng nếu được sử dụng với hàm lượng phù hợp và với cách thức thích hợp thì không chỉ giúp cây trồng phát triển tốt và đem lại năng suất cao hơn, mà còn có thể giúp cải tạo đất trồng và tránh tác động tiêu cực tới môi trường sinh thái. Chính vì vậy, để đạt được một hiệu suất nông nghiệp cao và bền vững, cần xây dựng và phát triển hệ thống INM một cách phù hợp với mỗi địa phương và mỗi loại cây trồng, trong đó cần đặc biệt ưu tiên hai hướng là: (i) Xác định chế độ bón phân hóa học hiệu quả theo hướng giảm thiểu, và (ii) tìm kiếm được những nhóm VSV hữu hiệu nhằm ứng dụng cho sản xuất phân sinh học. 1.1.3 Một số nhóm VSV hữu hiệu trong sản xuất phân sinh học Các VSV thường được sử dụng để tạo phân sinh học gồm các vi khuẩn cố định đạm (N-fixer, NF), các VSV hòa tan P và K (P and K solubilizers, PKS), và các VSV sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật. Hầu hết các VSV có trong thành phần của phân sinh học thường có mối quan hệ cộng sinh với rễ cây, chẳng hạn như Rhizobium tương tác cộng sinh với rễ cây họ Đậu (Fabaceae), và các vi khuẩn sống bám trên bề mặt rễ hoặc trong đất vùng rễ. Vi khuẩn cố định đạm (NF) Các NF có khả năng cố định nitơ tự do trong khí quyển và cộng sinh với thực vật theo hướng giúp đáp ứng nhu cầu đạm của cây chủ. Về mặt sinh học, các NF thường có chứa enzyme nitrogenase để xúc tác cho phản ứng cố định N từ khí quyển như sau: 7 Trước đây vi khuẩn NF được coi là đặc trưng cho sự cộng sinh với các cây họ Đậu, chẳng hạn như các NF thuộc những chi phổ biến như Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Allorhizobium và Sinorhizobium [18, 19], hoặc vi khuẩn NF thuộc chi Cyanobacteria cộng sinh với một số loài thủy sinh [20], tuy nhiên gần đây các nhà khoa học đã chứng minh NF còn tồn tại ở một số cây không thuộc họ Đậu như gạo, mía, lúa mì và ngô [21], như Rhizobium trifolii trong rễ cây lúa Ai Cập [22] hay vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và Bulkholderia sp. từ cây ngô [23]. Sau khi tập nhiễm vào cây chủ, các NF giúp làm tăng sức sống và năng suất của cây trồng [18], thể hiện cụ thể ở tổng năng suất N và các chỉ số thu hoạch của cây trồng [22], cũng như sức chống chịu với điều kiện khắc nghiệt [23]. Chính vì vậy, NF giúp đưa ra giải pháp thay thế hiệu quả cho việc sử dụng phân đạm hóa học quá mức và mất cân bằng sinh thái trong nhiều thập kỷ qua. VSV hòa tan P và K (PKS) Các PKS giúp tăng cường sự hấp thu khoáng chất của thực vật thông qua hòa tan P khó tan (Hình 1.1) và giải phóng K từ silicat trong đất [24]. Các VSV thuộc nhóm này bao gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm có khả năng tiết ra các axit hữu cơ làm giảm độ pH của đất và hòa tan K và P khó tan trong đất [25]. Một số vi khuẩn như Bacillus mucilaginous, B. subtilis, Pseudomonas striata, B. circulans và một số nấm như Aspergillus awamori, Penicillium sp. đã được chứng minh khả năng sinh axit hoặc enzyme phosphatase để hòa tan P hiệu quả [24, 26]. Trong đó, các vi khuẩn đã được chứng minh là hiệu quả hơn nấm trong hòa tan P vô cơ: Mức hòa tan P của vi khuẩn hòa tan phosphate (phosphate solubilizing bacteria, PSB) từ 1 đến 50%, trong khi nấm hòa tan phosphate (phosphate solubilizing fungi, PSF) chỉ tử 0,1 đến 0,5% [27]. Trong điều kiện sinh thái vùng rễ cây, một số vi khuẩn NF và PKS được xếp vào nhóm vi khuẩn rễ kích thích sinh trưởng (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR). Bên cạnh các tác dụng như NF và PKS, PGPR còn tạo các hormone kích thích sinh trưởng thực vật, kháng sinh và siderophore, và khả năng này đã được minh chứng trong nhiều nghiên cứu. Chẳng hạn, vi khuẩn Pseudomonas putida và P. fluorescens làm tăng sự kéo dài rễ và chồi ở cây cà chua và cây dầu mè [28, 29]. Ngoài ra, năng suất lúa mì