Tài liệu Nghiên cứu khả năng phân hủy hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học phân lập tại một số địa điểm ô nhiễm dầu ở việt nam

  • Số trang: 142 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 530 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC GVIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM ViÖn c«ng nghÖ sinh häc CUNG THỊ NGỌC MAI CUNG thÞ ngäc MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY NGHIÊN KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HỢP CHẤTCỨU VÒNG THƠM CỦA CÁC CHỦNG HỢP CHẤT VÒNG THƠM CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌC VI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌC PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ô NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM Ô NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ néi - 2017 HÀ NỘI - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CUNG THỊ NGỌC MAI NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦYHỢP CHẤT VÕNG THƠM CỦA CÁC CHỦNGVI SINH VẬT TẠO MÀNG SINH HỌCPHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂMÔ NHIỄM DẦU Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh Viện Nghiên cứu hệ gen 2. TS. Lê Thị Nhi Công Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2017 Lời cảm ơn Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngoc Minh, Phó Viện trưởng Viện nghiên cứu hệ gen và TS. Lê Thị Nhi Công, Trưởng phòng CNSH môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm qúy báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS. Masaaki Morikawa, Khoa Khoa học trái đất, Đại học Hokkaido Nhật Bản đã tạo điều kiện cho nhóm nghiên cứu sử dụng các trang thiết bị phân tích tại Khoa. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện trong suốt những năm qua. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, phụ trách đào tạo Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi hoàn thành những thủ tục cần thiết trong suốt quá trình nghiên cứu sinh và bảo vệ luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia và Ban chủ nhiệm Chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước “Nghiên cứu phát triển và ứng dụng Công nghệ Sinh học” đã cấp kinh phí cho 2 đề tài mã số 106.03-2011.53 và KC.04.21/11-15 cho nhóm nghiên cứu. Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các đơn vị: phòng Thí nghiệm trọng điểm gen- Viện Công nghệ sinh học; phòng Vi sinh vật học- Học viện Quân y 103; phòng Thí nghiệm siêu cấu trúc- Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương; phòng Sinh thái vi sinh vật- Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học; phòng Hóa học phân tích- Viện Hóa học đã phối hợp thực hiện một số kết quả phân tích trong luận án. Trong thời gian qua, tôi đã nhận được sự hỗ trợ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học nơi tôi đang công tác, cùng với sự giúp đỡ nhiệt tình cũng như những đóng góp quý báu của các chị, em đồng nghiệp, nhân dịp này tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thân trong gia đình, những người bạn thân thiết đã luôn bên cạnh động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nghiên cứu sinh Cung Thị Ngọc Mai i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Cung Thị Ngọc Mai ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 1.1. Đặc điểm, nguồn gốc phát sinh của phenol và PAH ............................ 1.1.1. Đặc điểm và nguồn gốc phát sinh của phenol .................................. 1.1.2. Đặc điểm và nguồn gốc phát sinh của PAH .................................... 1.2. Tính độc và ảnh hƣởng của phenol, PAH tới môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và động vật ............................................................................ 1.2.1. Tính độc và ảnh hưởng của phenol tới môi trường, sức khỏe con người và động vật ..................................................................................... 1.2.2. Tính độc và ảnh hưởng của phenol tới môi trường, sức khỏe con người và động vật ..................................................................................... 1.3. Phân hủy phenol và PAH bởi vi sinh vật ............................................... 1.3.1. Phân hủy phenol bởi vi sinh vật hiếu khí ....................................... 1.3.2. Phân hủy PAH bởi vi sinh vật hiếu khí .......................................... 1.4. Các công nghệ xử lý ................................................................................. 1.4.1. Công nghệ sử dụng bùn hoạt tính ................................................... 1.4.2. Công nghệ sử dụng màng lọc ......................................................... 1.5. Màng sinh học (Biofilm) .......................................................................... 1.5.1. Khái niệm về biofilm ..................................................................... 1.5.2. Vi sinh vật tạo biofilm ................................................................... 1.5.3. Sự hình thành biofilm .................................................................... 1.5.4. Thành phần, cấu trúc của biofilm .................................................. 1.5.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển biofilm ............................................................................................ 1.5.6. Ứng dụng của biofilm trong phân hủy sinh học ............................ Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................... 2.1.2. Hóa chất, môi trường nuôi cấy ....................................................... 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................... 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 2.2.1. Nhóm phương pháp vi sinh vật ...................................................... 2.2.2. Nhóm phương pháp sinh học phân tử ............................................ 2.2.3. Nhóm phương pháp phân tích hóa học........................................... 2.2.4. Xử lý thống kê ................................................................................ Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................... 3.1. Làm giàu và phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng iii Trang 1 3 3 3 4 6 6 7 8 9 12 16 17 18 21 21 21 23 24 26 28 31 31 31 32 33 34 35 43 47 47 48 các hydrocarbon vòng thơm ................................................................. 3.2. Khả năng tạo biofilm và sử dụng hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ........................................................... 3.2.1. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật ............................ 3.2.2. Khả năng sử dụng hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật 3.3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và phân loại, định têna các chủng vi sinh vật chọn lọc ...................................................................... 3.3.1. Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật ................................. 3.3.2. Phân loại và định tên các chủng vi sinh vật .................................. 3.4. Kiểm tra tính đối kháng và đánh giá độ an toàn của các chủng vi sinh vật sàng lọc ...................................................................................... 3.4.1. Kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi sinh vật ....................... 3.4.2. Đánh giá độ an toàn của các chủng vi sinh vật .............................. 3.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện môi trƣờng đến sự hình thành biofilm của các chủng vi sinh vật tuyển chọn .................. 3.5.1. Ảnh hưởng của pH ......................................................................... 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................. 3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl............................................... 3.5.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon ........................................................ 3.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen ...................................................... 3.6. Khả năng phân hủy một số hydrocarbon vòng thơm của từng chủng vi sinh vật lựa chọn ..................................................................... 3.6.1. Khả năng phân hủy hydrocarbon vòng thơm của vi sinh vật ......... 3.6.2. Khả năng chuyển hóa iso-pentylbenzene do biofilm của chủng Candida viswanathii TH1 tạo thành .............................................. 3.7. Khả năng phân hủy hợp chất vòng thơm trong nƣớc nhiễm dầu của biofilm do các chủng vi sinh vật tạo thành ........................................... 3.7.1. Khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm có trong nước nhiễm dầu ...................................................................................... 3.7.2. Mật độ tế bào, cấu trúc biofilm và cấu trúc quần thể vi khuẩn trước và sau xử lý .......................................................................... Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ............................................................... 4.1. Phân lập, phân loại các chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm và sử dụng các hợp chất vòng thơm từ các mẫu nhiễm dầu .............. 4.2. Các điều kiện ảnh hƣởng tới khả năng tạo biofilm của các chủng visinh vật.................................................................................................. 4.3. Hiệu quả xử lý các hợp chất vòng thơm có trong nƣớc nhiễm dầu do biofilm đa chủng tạo thành............................................................... KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ iv 48 54 54 56 58 58 60 63 64 64 65 65 67 68 69 70 72 72 73 78 78 83 88 88 92 96 99 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............................................................................................... TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ................................................ 101 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 107 PHẦN PHỤ LỤC............................................................................................. 1 Phụ lục 1: Khả năng tạo biofilm của các chủng vi sinh vật .............................. 1 Phụ lục 2: Phân loại vi sinh vật bằng kít chuẩn sinh hóa .................................. 2 Phụ lục 3: Khả năng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trên các nguồn hydrocarbon khác nhau .................................................................... 5 Phụ lục 4: Kết quả phân tích GCMS do biofilm đa chủng tạo thành ................ 7 v BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Biofilm C cs DGGE DNA DO EPS h HKTS ITS LD50 MPA N NM PAH PCR SEM RNA rRNA USEPA VK VSV Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Màng sinh học Carbon Denaturinggradient gel electrophoresis Dioxyribonucleic acid Diesel oil Extracellular polymeric substances Hour Cộng sự Điện di gel với dải nồng độ biến tính Dầu diesel Mạng lưới các chất ngoại bào Giờ Hiếu khí tổng số Internal transcribed spacer Vùng đệm chuyển tiếp phía trong Lethal Dose 50 Liều lượng chất độc gây chết cho một nửa (50%) động vật thí nghiệm Meat peptone agar Cao thịt peptone thạch Nitrogen Nấm men Polycyclic aromatic Hydrocarbon thơm đa vòng hydrocarbon Polymerase Chain Phản ứng chuỗi trùng hợp Reaction Scanning Electron Kính hiển vi điện tử quét Microscope Ribonucleic acid RNA ribosome United States Cơ quan Bảo vệ môi trường Hoa Kỳ Environmental Protection Agency Vi khuẩn Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Bảng 1.2. Bảng 2.1. Bảng 2.2. Bảng 2.3. Bảng 2.4. Bảng 2.5. Bảng 2.6. Bảng 2.7. Bảng 2.8. Bảng 2.9. Bảng 3.1. Bảng 3.2. Bảng 3.3. Bảng 3.4. Bảng 3.5. Bảng 3.6. Bảng 3.7. Bảng 3.8. Bảng 3.9. Bảng 3.10. Bảng 3.11. Bảng 3.12. Bảng 3.13. Bảng 3.14. Tính chất vật lý của một số loại PAH ............................................................... 5 Danh mục các gen tham gia .............................................................................. 13 Các địa điểm ô nhiễm dầu và đặc điểm mẫu thu thập ...................................... 31 Thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 33 Các thiết bị được sử dụng trong luận án ........................................................... 34 Các điều kiện môi trường được khảo sát .......................................................... 40 Các cặp mồi sử dụng trong kỹ thuật PCR ........................................................ 44 Thành phần phản ứng PCR .............................................................................. 44 Các cặp mồi sử dụng trong kỹ thuật PCR-DGGE ............................................ 45 Thành phần và chu trình của phản ứng PCR .................................................... 45 Các nồng độ biến tính gốc và nồng độ biến tính sử dụng ................................ 46 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu có trong nước thải lấy tại kho xăng dầu Đỗ Xá, Hà Nội ........................................................................... 48 Số lượng VSV dị dưỡng và VSV sử dụng hydrocarbon vòng thơm .................................................................................................................. 50 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được ............................ 51 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng nấm men phân lập được ........................... 53 Khả năng sử dụng các hợp chất hydrocarbon thơm của các chủng vi khuẩn .................................................................................................. 56 Khả năng sử dụng các hợp chất hydrocarbon thơm của các chủng nấm men ................................................................................................. 57 Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn ...................................................... 58 Đặcđiểm sinh học của các chủng nấm men ...................................................... 59 Tên khoa học, độ tương đồng và mã số trên NCBI của các chủng VK .......................................................................................................... 61 Tên khoa học, độ tương đồng và mã số trên NCBI của các chủng NM ......................................................................................................... 63 Kết quả xác định LD50 của các chủng vi sinh vật ............................................ 65 Hiệu suât phân hủy hydrocarbon thơm của vi sinh vật .................................... 72 Thời gian lưu và phổ hấp thụ UV/vis các sản phẩm do biofilm chủng C. viswanathii TH1 chuyển hóa iso-pentylbenzene .............................. 74 Mức độ tương đồng về trình tự đoạn gen 16S rRNA của các băng được cắt với các chủng vi khuẩn trên NCBI ........................................... 86 DANH MỤC HÌNH ẢNH Trang Cấu trúc hóa học của một số loại PAH ............................................................. 4 Mở vòng ở vị trí ortho- và ở vị trí meta- của catechol ..................................... 10 Phân hủy sinh học hiếu khí phenol theo con đường mở vòng vị trí meta- và ortho- bởi loài Pseudomonas sp. CF600 ................................... 11 Hình 1.4. Các vùng trao đổi chất trong phân hủy PAH .................................................... 12 Hình 1.5. Các con đường phân hủy PAH ......................................................................... 14 Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống xử lý bằng phương pháp bùn hoạt tính .................................... 18 Hình 1.7. Sơ đồ hệ thống xử lý bằng phương pháp MBR ................................................ 19 Hình 1.8. Sơ đồ hệ thống xử lý sử dụng biofilm ............................................................. 20 Hình 1.9. Chu trình hình thành biofilm ............................................................................ 24 Hình 1.10. Cấu trúc mô phỏng của 1 biofilm và cấu trúc hiển vi của biofilm do chủng Bacillus subtilis tạo thành dưới kính hiển vi điện tử quét ....................................................................................................... 25 Hình 2.1. Sơ đồ các bước thí nghiệm thực hiện trong luận án ......................................... 35 Hình 2.2. Sơ đồ các bước thử nghiệm khả năng phân hủy các hydrocarbon thơm trong nước nhiễm dầu của biofilm do các chủng vi sinh vật lựa chọn tạo thành ở quy mô 5 lít ........................................ 41 Hình 2.3. Các mô hình xử lý ............................................................................................ 42 Hình 3.1. Mẫu làm giàu vi sinh vật lần 3 trên các nguồn cơ chất tại các vị trí thu thập mẫu khác nhau ........................................................................... 51 Hình 3.2. Khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn phân lập ................................... 55 Hình 3.3. Khả năng tạo biofilm của các chủng nấm men phân lập .................................. 56 Hình 3.4. Mức độ sinh trưởng của chủng VTPG5 trên các nguồn cơ chất ...................... 57 Hình 3.5. Mức độ sinh trưởng của chủng nấm men trên các nguồn cơ chất .................................................................................................................... 57 Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn ............................................ 61 Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn ............................................ 62 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng vi sinh vật .............................. 64 Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH tới khả năng hình thành biofilm của các chủng vi khuẩn .................................................................................................. 66 Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH tới khả năng hình thành biofilm của các chủng nấm men ................................................................................................. 66 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng hình thành biofilmcủa Hình 1.1. Hình 1.2. Hình 1.3. Hình 3.12. Hình 3.13. Hình 3.14. Hình 3.15. Hình 3.16. Hình 3.17. Hình 3.18. Hình 3.19. Hình 3.20. Hình 3.21. Hình 3.22. Hình 3.23. Hình 3.24. Hình 3.25. Hình 3.26. Hình 3.27. các chủng vi khuẩn ........................................................................................... 67 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng hình thành biofilm của các chủng nấm men .......................................................................................... 67 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng hình thành biofilm của các chủng vi khuẩn ..................................................................................... 68 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng hình thành biofilm của các chủng nấm men .................................................................................... 68 Ảnh hưởng của nguồn C tới khả năng hình thành biofilmcủa các chủng vi khuẩn ........................................................................................... 69 Ảnh hưởng của nguồn C tới khả năng hình thành biofilmcủa các chủng nấm men .......................................................................................... 70 Ảnh hưởng của nguồn N tới khả năng hình thành biofilmcủa các chủng vi khuẩn ........................................................................................... 71 Ảnh hưởng của nguồn N tới khả năng hình thành biofilmcủa các chủng nấm men .......................................................................................... 71 Quang phổ khối lượng các sản phẩm trao đổi chất V, VI và VII được phát hiện bằng phân tích GCMS tại các thời gian lưu 9,1; 20,1 và 20,8 phút sau khi so sánh các chất chuẩn ..................................... 76 Con đường chuyển hóa iso-pentylbenzene do biofilm chủng C. viswanathii TH1 ........................................................................................... 77 Kết quả phân tích khả năng phân hủy phenol sau 7 ngày nuôi tĩnh của biofilm đa chủng vi khuẩn bằng phương pháp HPLC ........................ 79 Hiệu suất phân hủy các thành phần hydrocarbon thơm sau 14 ngàynuỗi tĩnh của biofilm đa chủng vi khuẩn .................................................. 80 Kết quả phân tích khả năng phân hủy phenol sau 7 ngày nuôi tĩnh của biofilm đa chủng nấm men bằng phương pháp HPLC ....................... 81 Hiệu suất phân hủy các thành phần hydrocarbon thơm sau 14 ngàynuỗi tĩnh của biofilm đa chủng nấm men ................................................. 82 Cấu trúc biofilm đa chủng vi khuẩn tại thời điểm 0 ngày và 14 ngày................................................................................................................... 83 Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA của mẫu nước ....................... 84 Điện di biến tính với dải nồng độ 30% - 60% ................................................. 85 1 MỞ ĐẦU Các hợp chất hữu cơ vòng thơm như:naphthalene, anthracene,pyrene hay còn gọi là các hydrocarbon thơm đa vòng (PAHs - polycyclic aromatic hydrocarbons) và phenol là các hợp chất hữu cơ bền vững, khó phân hủy trong tự nhiên. Chúng là những hợp chất hữu cơ có nhiều trong công nghiệp sản xuất nhựa tổng hợp, các loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, công nghiệp dệt nhuộm, công nghiệp sản xuất thuốc nổ, chất tẩy rửa, trong công nghiệp chế biến cà phê, chúng cũng là phụ gia của nhiều ngành công nghiệp khác và đặc biệt chúng có nhiều trong dầu mỏ. Khi con người, động vật tiếp xúc với những hợp chất hữu cơ này qua các con đường như ăn, uống, tiếp xúc qua da có thể gây ra các bệnh như suy hô hấp, rối loạn thần kinh thậm chí có thể gây tử vong.Do vậy, việc loại bỏ các thành phần hữu cơ trên có trong dầu mỏ tại các khu vực ô nhiễm là một việc làm cần thiết hiện nay. Để xử lý các hợp chất này, các phương pháp vật lý, hóa lý đã được sử dụng và cho kết quả khả quan. Các phương pháp này có ưu điểm là xử lý nhanh, tuy nhiên quá trình xử lý không được triệt để và thường tạo ra các sản phẩm phụ thứ cấp ảnh hưởng tới môi trường xung quanh. Phương pháp phân hủy sinh học sử dụng các tác nhân sinh học như vi sinh vật và các chất có hoạt tính sinh học do vi sinh vật sản sinh ra đã được sử dụng ngày càng rộng rãi do hiệu quả, rẻ, thân thiện với môi trường. Đặc biệt khi vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm sinh trưởng trong cấu trúc màng sinh học (biofilm) thì hiệu quả xử lý các hợp chất này trong nước bị ô nhiễm dầu cao hơn khi ở dạng tế bào tự do. Biofilm là một tập hợp các vi sinh vật bám trên một bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ bề mặt đó.Khu hệ vi sinh vật trong biofilm có khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường (sự thay đổi về pH, nhiệt độ, sự thẩm thấu hay sự mất nước của tế bào, v.v…) tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác từ đó làm tăng hiệu suất phân hủy các hợp chất ô nhiễm khi xử lý ngoài hiện trường. 2 Ở Việt Nam cho đến nay chưa có nhiều nghiên cứu về ứng dụng các vi sinh vật tạo biofilmtrong xử lý các hợp chất hydrocarbon thơm trong nước ô nhiễm.Để giải quyết những vấn đề thực tiễn nêu trên, luận án: “Nghiên cứu khả năng phân hủy hợp chất vòng thơm của các chủng vi sinh vật tạo màng sinh học phân lập tại một số địa điểm ô nhiễm dầu ở Việt Nam” đã được thực hiện với mục tiêu và nội dung như sau: Mục tiêu: Tìm kiếm các chủng vi sinh vật vừa có khả năng tạo biofilm, vừa có khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm nhằm ứng dụng trong xử lý môi trường ô nhiễm những hợp chất này. Nội dung nghiên cứu: 1. Làm giàu và phân lập vi sinh vật có khả năng sử dụng các hydrocarbon thơmnhư nguồn carbon và năng lượng duy nhất. 2. Sàng lọc các chủng vi sinh vật sử dụng các hydrocarbon thơm có khả năng tạo biofilm. 3. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại, định tên các chủng đại diện. 4. Kiểm tra tính đối kháng và đánh giá độ an toàn của các chủng vi sinh vật chọn lọc. 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện tới khả năng tạo biofilm. 6. Đánh giá khả năng phân hủy một số hydrocarbon thơm của các chủng lựa chọn. 7. Đánh giá hiệu suất phân hủycác hydrocarbon thơm trong nước nhiễm dầu dobiofilm đa chủng vi khuẩn và biofilm đa chủng nấm men tạo thành. Những đóng góp mới của luận án: (1) Đây là công trình nghiên cứu có hệ thống về phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn, nấm men vừa có khả năng tạo biofilm tốt vừa có khả năngphân hủy tốt các hợp chất hữu cơ vòng thơm phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Việt Nam. (2) Lần đầu tiên ở Việt Nam đã thiết lập được con đườngchuyển hóaisopentylbenzene bởi chủng nấm men Candida viswanathii TH1. 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẶC ĐIỂM, NGUỒN GỐC PHÁT SINH CỦA PHENOL VÀ PAH 1.1.1. Đặc điểmvà nguồn gốc phát sinh của phenol Phenol là một đơn vị cấu trúc vòng thơm đơn giản nhất, mùi hăng và có vị rất đặc trưng mùi khói. Phenol ít tan trong nước ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên trên 68oC, nó tan hoàn toàn vào nước. Phenol ít bay hơi ở nhiệt độ phòng (tốc độ bay hơi chậm hơn nước) và dễ bị bốc cháy (Gami et al., 2014). Hiện nay, phenol được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất nhựa phenolic, caprolactan và bisphenol A, thuốc tẩy uế, thuốc diệt côn trùng và các sản phẩm dược phẩm. Phenol và các dẫn xuất của nó tồn tại chủ yếu ở trong nguồn nước thải của nhiều ngành công nghiệp và trong không khí bị ô nhiễm thông qua các hoạt động sinh hoạt thường ngày của con người: chế biến thức ăn, hút thuốc lá v.v… (Al-Khalid et al., 2012). Bên cạnh đó, phenol còn được phát sinh từ các quá trình sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ như: 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) hay 4-chloro-2-methylphenolxyacetic acid (MCPA) và pentachlorophenol (PCP), dinoseb (một loại thuốc diệt cỏ cũng được dùng như: thuốc diệt nấm và côn trùng bị EPA cấm sử dụng vào năm 1986 vì gây ra nguy cơ dị tật trong sinh sản và vô sinh hoặc thuốc diệt cỏ)(Gami et al., 2014; Rozánki, 1998). Phenol còn được phát sinh trong các phản ứng giữa chlorobenzene và sodium hydrocide, quá trình oxi hóa toluene và tổng hợp từ benzene và propylene.Ngoài ra, phenol cũng được hình thành bởi các phản ứng hóa học xảy ra trong khí quyển trong quá trình nước bay hơi hình thành mây và trong quá trình sinh tổng hợp bởi thực vật hay các phản ứng phân hủy các chất hữu cơ (US EPA, 1980). Ngoài các nguồn phát sinh trên thì1 nguồn phát sinh phenol đáng phải kể đến đó là tại các bể thu gom nước thải của các kho bể và các cửa hàng xăng dầu do hiện 4 tượng rò rỉ, rơi rớt xăng dầu trong quá trình xúc rửa các bể chứa dầu, vận chuyển xăng dầu từ kho tới các cây xăng dầu để tiêu thụ (Yu et al., 2013). 1.1.2. Đặc điểm và nguồn gốc phát sinh của PAH PAH (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) được sử dụng để chỉ một số các chất hữu cơ gồm hai hay nhiều vòng hydrocarbon thơm liên kết với nhau. Có hơn 100 loại PAH khác nhau trong đó có 16 loại PAH được nghiên cứu tỉ mỉ do chúng nguy hại hơn so với các loại PAH khác và được xác định là có nồng độ cao nhất tại các vị trí nguy hiểm trong Danh sách các quốc gia được ưu tiên (NPL - National Priorities List) của cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ (Hình 1.1). Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của một số loại PAH (Nguồn: Pelero, 2010) Trong tự nhiên, PAHthường tồn tại ở dạng hỗn hợp, ít thấy ở dạng đơn lẻ. Tại nhiệt độ thường (từ 15-35oC), PAH tinh khiết tồn tại ở thể rắn, không màu hoặc có màu trắng hay màu vàng chanh và có mùi hăng nhẹ. Tùy thuộc vào khối lượng 5 phân tử mà các PAH có những tính chất vật lý, hoá học khác nhau. Nhìn chung chúng có nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ sôi cao, áp suất bay hơi thấp và rất ít tan trong nước nhưng tan tốt trong chất béo. Một số đặc tính cơ bản của PAH được mô tả trong Bảng 1.1. Bảng 1.1. Tính chất vật lý của một số loại PAH Tên loại PAH Nhiệt độ Số nóng chảy vòng (oC) Nhiệt độsôi (oC) Độ tan trong nƣớc (mg/l) LogKpd Áp suất hơi ở 20oC (torr) Phenanthrene 3 101 340 1,29 4,45 6,8x10-4 Anthracene 3 216 340 0,07 4,46 2,0x10-4 Fluoranthene 4 111 250 0,26 5,33 6,0x10-6 Benzo[a]anthracene 4 158 400 0,24 5,61 5,0x10-9 Pyrene 4 149 360 0,14 5,32 6,8x10-7 Schyrene 4 255 488 0,02 5,61 6,3x10-7 Benzo[a]pyrene (BaP) 5 179 496 0,0038 6,04 5,0x10-7 Dibenzo[a] anthracene 5 262 524 0,0005 5,97 1,0x10-10 Benzo[g,h,i]perylen e 6 222 -- 0,0003 7,23 1,0x10-10 * Kpd= [octanol]/[nước] (Nguồn: Cerniglia, 1992) Hệ số Kpd cao, các PAH có xu hướng tăng khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn, tương ứng với khả năng hòa tan của nó trong nước của nó cũng giảm. Độ hòa tan trong nước của PAH tỷ lệ nghịch với chỉ số Kp. PAH là những chất kỵ nước. Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước. Số lượng vòng benzene trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả năng hòa tan của các PAH trong nước. PAH giảm khả năng hòa tan trong nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzene tăng (Cerniglia,1992). Một vài PAH được sử dụng trong dược phẩm và được làm thuốc nhuộm, nhựa và thuốc trừ côn trùng. Chúng cũng được tìm thấy trong các nguồn cơ chất 6 như: dầu thô, than đá, nhựa đường, dầu hỏa hay từ các hoạt động phun trào núi lửa. Chúng cũng được tìm thấy ở mọi nơi trong môi trường trong không khí, nước và đất trong sinh hoạt hàng ngày của con người: việc hút thuốc, đun nấu bằng củi và dầu hỏa, đốt nóng các loại dầu khác nhau và nướng thịt. Đặc biệt, PAH xuất hiện nhiều trong quá trình cracking bẻ gãy các liên kết mạch dài của các chất hữu cơ có trong dầu mỏ, các công đoạn đúc sắt thép và sản xuất nhôm, than chì (US Department of health and human services, 1995).Cũng như phenol, nước thải nhiễm dầu tại các bể thu gom nước thải của các kho xăng dầu cũng là 1 nguồn phát sinh PAH lớn(Yu et al., 2013). 1.2. TÍNH ĐỘC VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA PHENOL, PAH TỚI MÔI TRƯỜNG, SỨC KHỎE CON NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT 1.2.1. Tính độc và ảnh hƣởng của phenol tới môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và động vật Phenol là một trong những hợp chất vòng thơm đầu tiên được đưa ra trong danh sách các chất ô nhiễm được chú trọng của USEPA. Đã có nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về tính độc cũng như ảnh hưởng của phenol lên sức khỏe con người và môi trường. Liều gây độc cho người khi uống phải là từ 200 mg đến 300 mg và liều gây chết là 3 g đến 30 g (Todoroviê, 2003). Phenol sau khi thấm vào tế bào, trải qua quá trình chuyển hóa chủ yếu với sự tham gia của các oxidase trong hệ thống Cytochrome P450. Quá trình chuyển hóa làm tăng độc tính do sự trao đổi điện tích dẫn tới việc chúng có thể liên kết và phá hủy các phân tử DNA hoặc các enzyme khác của cơ thể làm thay đổi cấu trúc của mô, gây đột biến và ung thư (Michałowicz and Duda, 2007). Ngoài ra, phenol còn là một chất gây kích ứng mắt, màng nhầy và da, gây co giật, suy gan, thận và một số cơ quan khác (Wasi et al., 2013). Khi động vật hít lâu hơi phenol ở nồng độ trong khoảng 30 đến 60 ppm có thể gây tổn thương phổi, giảm cân và tê liệt. Tiếp xúc cấp tính với phenol có thể gây suy tim, suy thận. Phenol gây cháy da, làm trắng và ăn mòn da.Bệnh tăng nhãn áp đã được thử nghiệm trên thỏ bằng cách tiêm 5% phenol cho thấy khi mắt thỏ tiếp 7 xúc với phenol dạng tinh thể hoặc dung dịch sẽ gây trắng giác mạc, sau 8 giờ giác mạc bị tê liệt. Những con chuột khi uống phải nước pha 2.500 ppm phenol trong 103 tuần sẽ có hiện tượng gia tăng bệnh bạch cầu và các u lympho, mặc dù vậy cho đến nay, phenol không được coi là chất gây ung thư. Bên cạnh đó, khi tiếp xúc với phenol trong thời gian dài có thể dẫn đến chán ăn, da phát ban, câm điếc, rối loạn tiêu hóa, nôn mửa, giảm cân, đau cơ, đau gan và rối loạn thần kinh. Phenol và dẫn xuất của nó rất độc hại và được phân loại là vật liệu nguy hiểm (Gami et al., 2014; Kumari et al., 2013). 1.2.2. Tính độc và ảnh hƣởng của PAH tới môi trƣờng, sức khỏe con ngƣời và động vật Hầu hết các loại thực vật đều rất nhạy cảm với PAH ở những mức độ khác nhau. Trong quá trình trao đổi chất, thực vật có thể hấp thụ và hấp phụ PAH từ môi trường đất, nước và không khí vào cơ thể qua thân, rễ, lá của chúng. Khi được hấp thụ vào những tế bào thực vật, PAH làm giảm khả năng sinh trưởng, sinh sản và phát triển của các loài thực vật cũng như kìm hãm một số quá trình sinh học trong hệ sinh thái. PAH được tích tụ trong hệ thực vật sẽ từ đó đi vào chuỗi thức ăn của động vật và gây ra những tác hại lâu dài và nghiêm trọng hơn. Từ hệ thực vật, PAH được hấp thụ vào cơ thể của một số loài động thực vật thông qua các chuỗi thức ăn. Do độ hoà tan trong nước của các PAH phân tử lượng nhỏ cao hơn của các PAH phân tử lượng lớn, chúng có khả năng gây độc trực tiếp đối với các cơ thể động vật cao hơn là các PAH khối lượng phân tử lớn. Tuy nhiên, các PAH phân tử lượng lớn lại khó phân huỷ sinh học hơn, chúng thường bị tích tụ rất lâu trong môi trường cũng như trong cơ thể động vật (US Department of health and human services, 1995). Khi PAH được phóng thích từ các khu vực phát sinh chúng sẽ thâm nhập vào trong các nguồn nước, đất và không khí ô nhiễm xâm nhập vào cơ thể người thông qua các con đường: hít thở, ăn, uống, hút thuốc hoặc tiếp xúc qua da khi con người tiếp xúc với chúng trong một khoảng thời gian nhất định. PAH thường tồn tại ở dạng hỗn hợp, ít thấy ở dạng đơn lẻ do vậy khi bị nhiễm PAH, con người sẽ bị 8 nhiễm hỗn hợp các PAH, chính điều này càng làm cho độc tính của chúng được tăng cường (US Department of health and human services, 1995). Do độ hoà tan trong nước thấp và độ hoà tan trong dầu cao nên khi xâm nhập vào cơ thể người qua những con đường khác nhau, PAH có xu hướng bị tích tụ nhiều hơn ở thận, gan và các mô mỡ của con người. Một lượng nhỏ PAH có thể bị tích tụ ở lá lách, tuyến thượng thận và buồng trứng.Khi bị tích tụ, chúng có thể kết hợp hay phản ứng với một số chất khác trong cơ thể để hình thành nhiều loại hợp chất khác nhau. Một số sản phẩm gây ra những tác hại nghiêm trọng hơn PAH và một số khác thì ít nghiêm trọng hơn đối với sức khoẻ của con người. Tuy nhiên, cũng theo những nghiên cứu này, một số loại PAH thông thường không tồn trữ lâu dài trong cơ thể con người. Thời gian lưu giữ của chúng trong cơ thể người chỉ khoảng vài ngày, sau đó là được thải ra ngoài qua phân và nước tiểu. Khi bị nhiễm các hợp chất PAH thì các yếu tố như: liều lượng, thời gian tiếp xúc, con đường bị nhiễm (ăn, uống, tiếp xúc qua da, v.v…), hay tuổi, giới tínhtình trạng sức khỏe được quan tâm. USEPA cũng đưa ra mức nồng độ an toàn của PAH trong quá trình tiếp xúc để không gây ảnh hưởng có hại cho sức khoẻ con người. Cụ thể: không nên tiếp xúc với một số chất PAH tại những nồng độ lớn hơn những mức sau: 0,3 mg anthracene/kg cơ thể người; 0,06 mg acenaphthene/kg cơ thể người, 0,04 mg fluoranthene/kg cơ thể người; 0,03 mg pyrene/kg cơ thể người v.v…(US Department of health and human services, 1995). Để phòng tránh sự xâm nhập của PAH, chúng ta cần hạn chế và kiểm soát sự phát sinh của những hợp chất này trong sản xuất và sinh hoạt. Ví dụ như giảm thiểu việc sử dụng những nguồn nguyên, nhiên liệu có thể sản sinh ra PAH trong giao thông và công nghiệp, kiểm soát nghiêm ngặt các quá trình đốt để tránh các quá trình cháy không hoàn toàn của một số lò đốt rác thải, hạn chế hút thuốc và ăn các sản phẩm nướng cháy. 1.3. PHÂN HỦY PHENOL VÀ PAH BỞI VI SINH VẬT Hiện nay, phân hủy sinh học là một trong các phương pháp làm sạch ô nhiễm dầu mỏ hiệu quả và an toàn cho môi trường nhất được sử dụng kế tiếp ngay sau các 9 biện pháp ứng cứu nhanh. Nguyên lý của phương pháp này là kích thích sự phát triển của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng phân hủy dầu hoặc các chất ô nhiễm có trong dầu bằng cách thay đổi các yếu tố môi trường như: độ thông khí, các chất dinh dưỡng như nitrogen, phosphore, vi lượng, các chất hoạt động bề mặt sinh học do chính các chủng vi sinh vật đó tạo thành, v.v. tức là tạo điều kiện tối ưu để vi sinh vật sử dụng dầu hoặc các hydrocarbon có trong dầu phát triển và hoạt động để tạo ra các sản phẩm là các acid hữu cơ, nước, CO2 và sinh khối vi sinh vật (Kensa, 2011). Bên cạnh đó, việc sử dụng chất hoạt hóa bề mặt sinh học (CHHBMSH)do các chủng vi sinh vật tạo ra để tăng cường quá trình phân hủy hydrocarbon có trong dầu mỏ (Bustamante et al, 2012). Chất hoạt động bề mặt có các ưu điểm như: độc tính thấp, phân hủy nhanh hơn, chịu pH, chịu mặn và có khả năng tổng hợp từ các nguyên liệu rẻ tiền. Tất cả CHHBMSH là hợp chất lưỡng cực, có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo). Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa 2 pha (có thể là chất lỏng-chất lỏng, chất lỏng-chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng và không khí) và giảm sức căng giữa 2 pha (chất lỏng-chất lỏng và chất lỏng-chất rắn) (Magdalena et al., 2011).Một ví dụ điển hình về vai trò của CHHBMSH do chủng vi khuẩn Pseudomonas pseudomalei H24 tạo ra giúp làm tăng cường khả năng phân hủy dầu DO của vi sinh vật từ mẫu cát biển có khả năng phân hủy 67% và 37% với nồng độ dầu ban đầu lên tới 39,2 g/l (Lại Thúy Hiền và cs, 2010). 1.3.1. Phân hủy phenol bởi vi sinh vật hiếu khí Trên thế giới đã có nhiều công bố về các nhóm vi sinh vậthiếu khí có khả năng sử dụng phenol như nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Chúng thuộc các chi: Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonasfluorescens, Bacilluscereus (Agarry và Solomon, 2013; Arifet al., 2012; Gami et al., 2014; Krastanov et al., 2013; Liu et al., 2016; Nwanyannwu và Abu, 2013; Safont et al., 2012; Taghreed và Muftah, 2012),
- Xem thêm -