Tài liệu Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan hài giáp paphiopedilum malipoense bằng phương pháp in vitro

.. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRỊNH THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP (Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRỊNH THỊ TUYẾT NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN NHANH LAN HÀI GIÁP ( Paphiopedilum malipoens) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Duy THÁI NGUYÊN - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Văn Duy. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả luận văn Trịnh Thị Tuyết ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Duy và ThS. Nguyễn Thị Tình, Khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chi ̣ kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật , Khoa CNSH - CNTP, Trường đại học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa ho ̣c - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Khoa ho ̣c Sự số ng và các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chi ̣kỹ thuâ ̣t viên phòng thí nghiệm Khoa Khoa ho ̣c sự số ng. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này. Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể làm tốt hơn. Tác giả luận văn Trịnh Thị Tuyết iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC ............................................................................................................ iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ...................................................................... v DANH MỤC BẢNG ............................................................................................ vi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................ vii MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ...................................................... 3 4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................... 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn .................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4 1.1. Tổng quan về phân loại và đặc điểm của lan Hài và lan Hài Giáp ............ 4 1.1.1. Đặc điểm thực vật học của lan Hài (Paphiopedilum) ......................... 4 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của lan Hài Giáp .......................................... 11 1.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào .............................................................. 15 1.2.1. Các vấn đề thường gặp trong nhân giống in vitro............................. 15 1.2.2. Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô ........................... 16 1.2.3. Quy trình nhân giống in vitro ............................................................ 18 1.2.4. Ứng dụng của nuôi cấy mô trong nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp ................................................................................................ 20 1.3. Tình hình nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Hài trên thế giới và trong nước . 21 1.3.1. Trên thế giới ...................................................................................... 21 1.3.2. Trong nước ........................................................................................ 24 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 26 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ............................................................. 26 2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 27 2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 27 iv 2.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu................................................................ 28 2.4.1. Hóa chất............................................................................................. 28 2.4.2. Thiết bị .............................................................................................. 28 2.4.3. Dụng cụ ............................................................................................. 28 2.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 29 2.5.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường và điều kiện nuôi cấy ................ 29 2.5.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro .......................................................... 30 2.5.3. Phương pháp xử lí số liệu ................................................................. 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 33 3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1 % đến quả lan Hài Giáp ................................................................. 33 3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt lan Hài Giáp............................................................................................... 35 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng và hợp chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ...................................... 36 3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi lan hài Hài Giáp........................................................................................... 36 3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ..................................................................... 39 3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ............................................................ 42 3.4. Kết quả nghiên cứu tạo cây in vitro hoàn chỉnh ...................................... 45 3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của lan Hài Giáp ...................................................................................................... 45 3.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính tới khả năng ra rễ .............................................................................................. 48 3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Hài Giáp.......................................................................... 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 54 PHỤ LỤC ................................................................................................................ v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADN: Deoxyribonucleic acid B5: Gamborg cs, 1976 BA : 6 - benzyl amino purine CT : Công thức CS : Cộng sự ĐC : Đối chứng KC: Knudson C MS : Murashighe và Skoog, 1962 NAA : Naphthalene acetic acid PCR: Polymerase Chain Reaction RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA THT : Than hoạt tính SH: Schenk and Hildebrandt, 1972 VW : Vacin and Went WPM : Woody Plant Medium – Lioyd và Mc Cown, 1980 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các nhóm lan Hài Viê ̣t Nam theo thứ ha ̣ng bảo tồ n của Tổ chức Bảo tồ n Thiên nhiên Quố c tế (IUCN). ......................................................................... 9 Bảng 2.1: Hóa chất nghiên cứu ........................................................................... 28 Bảng 2.2: Thiết bị nghiên cứu ............................................................................. 28 Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% đến quả lan Hài Giáp ...................................................................... 33 Bảng 3.2: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt.................................................................................................................. 35 Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh lan Hài Giáp .............................................................................................................. 37 Bảng 3.4: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ............................................................................. 40 Bảng 3.5: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp .................................................................... 43 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của NAA tới sự ra rễ ....................................................... 46 Bảng 3.7: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA kết hợp với than hoạt tính ảnh hưởng tới khả năng ra rễ ..................................................................................... 48 Bảng 3.8: Sự phát triển của lan Hài Giáp trên một số giá thể ngoài môi trường tự nhiên (sau 8 tuần) ................................................................................................ 51 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình thái lan Hài Giáp ........................................................................ 13 Hình 2.1: Cây và quả lan Hài Giáp ..................................................................... 27 Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm ................................................................................. 29 Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt sau 12 tuần ..... 36 Hình 3.2: Ảnh hưởng của BA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp ....... 39 Hình 3.3: Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA tới khả năng nhân nhanh chồi lan Hài Giáp .............................................................................................................. 42 Hình 3.4: Ảnh hưởng dịch chiết của quả chuối xanh tới khả năng nhân nhanh của lan Hài Giáp......................................................................................................... 44 Hình 3.5: Ảnh hưởng của NAA tới khả năng ra rễ của lan Hài Giáp ................. 47 Hình 3.6: Ảnh hưởng của NAA kết hợp với THT tới khả năng ra rễ của lan Hài Giáp..... 50 Hình 3.7: Ảnh hưởng của giá thể tới khả năng sinh trưởng và phát triển của lan Hài Giáp ............................................................................................................. 52 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hoa lan được con người biết đến rất sớm từ 2.800 năm TCN, nó được coi một trong những đỉnh cao tiến hóa của các loài hoa. Hiện nay trên thế giới với 800 chi và 25.000 – 30.000 loài. Họ Lan (Orchidaceae) chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc (Asteraceae) trong ngành thực vật hạt kín [20]. Vì vậy hình thái, cấu tạo cũng như hệ thống phân loại của họ này rất đa đa dạng và phức tạp. Việt Nam là quốc gia được đánh giá có sự đa dạng sinh học phong phú, phong lan Việt Nam đa dạng về số loài, màu sắc và chủng loại với trên 140 loại phong lan chia ra thành 1000 giống nguyên thủy. Chúng thường phân bố ở các vùng rừng núi Cao Bằng, Sa Pa, Lào Cai, Huế, Hải Vân, Quy Nhơn, Kontum, Pleiku, Ban Mê Thuật, Phan Rang, Đà Lạt, Di Linh, v.v...[13]. Trong số các loài lan của Việt Nam có rất nhiều cây quý hiếm điển hình là giống Lan Hài (Paphiopedilum) gồm hơn 66 loài phân bố từ Ấn Độ, New Ghine và vùng Đông Nam Á, người Pháp gọi loài thuộc giống này là Hài Vệ Nữ Sabot de Venus và người Anh dùng với ý nghĩa tương tự Lady's slippers [1]. Hiện nay Việt Nam đã tìm thấy 22 loài thuộc chi Paphiopedilum trong đó có 8 loài đặc hữu có giá trị chỉ xuất hiện tại Việt Nam như lan Hài Đỏ, lan Hài Vàng, lan Hài Tía, lan Hài Trắng, lan Hài Vân, lan Hài Vân Duyên, lan Hài Đốm, lan Hài Lông hay lan Hài Râu,…[1]. Lan Hài Giáp là loài lan chỉ xuất hiện ở một số tỉnh miền núi phía bắc như Bắc Kạn, Hà Giang, Hòa Bình, Lạng Sơn, Sơn La,…Loài này chỉ sinh sống tại các khu rừng nguyên sinh rậm, thường xanh cây lá rộng hỗn giao và cây lá kim trên núi đá vôi kết tinh bị bào mòn mạnh ở độ cao từ 600 đến 1200m [16]. Đây là một loài lan Hài đặc biệt có hoa đẹp tao nhã với lá đài và cánh hoa xanh lá cây, môi xám, xanh nhạt và nhị lép trắng với chóp màu nâu tía, hoa có mùi thơm táo nhẹ. Chúng có lá rộng kẻ ô chữ nhật hoặc đốm khảm xanh lá cây tươi hoặc xanh thẫm, đốm tím tía ở mặt dưới và cụm hoa thường dài mang một hoa to đơn 2 độc [1]. Chính vẻ đẹp tao nhã, có giá trị thẩm mỹ cao nên rất được thế giới ưa chuộng dẫn đến tình trạng thu thập và xuất khẩu lan Hài Giáp ồ ạt không kiểm soát được, khiến các cá thể càng khan hiếm trong tự nhiên. Đồng thời với tình trạng môi trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài Giáp càng biến mất nhanh chóng. Trước tình hình đó lan Hài Giáp đã được xếp vào nhóm nguy cấp (EN) trong Sách đỏ Việt Nam và nhóm IA (các loài bị nghiêm cấm khai thác và sử dụng vì mục địch thương mại) trong nghị định 32 năm 2006 của Chính Phủ [16]. Đặc thù riêng của lan Hài Giáp là cây sinh trưởng chậm, tỷ lệ nảy mầm của hạt trong tự nhiên thấp [20] vì vậy việc nghiên cứu nhân giống lan Hài rất được chú trọng nhằm mục đích thương mại và bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm. Trước đây các nhà nghiên cứu đã tiến hành nhân giống các loài lan Hài bằng nhiều phương pháp khác nhau như gieo hạt, tách mầm nhưng những phương pháp này vẫn còn nhiều nhược điểm như chất lượng cây thấp, không đồng đều và số lượng cây ít [6]. Để khắc phục được điều này, phương pháp nhân giống in vitro đã ra đời nhằm khắc phục những hạn chế trên. Phương pháp này cho số lượng cây lớn, chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh, đây là điều mà phương pháp truyền thống không thực hiện được. Hiện nay nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro đang phát triển mạnh mẽ có thể tạo ra số lượng cây con lớn, sạch bệnh, ổn định về mặt di truyền trong một thời gian ngắn và đáp ứng được giá cả phải chăng của thị trường được coi là một giải pháp lý tưởng để bảo tồn loài lan Hài khỏi nguy cơ bị tuyệt chủng [6]. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu khả năng nhân nhanh lan Hài Giáp (Paphiopedilum malipoense) bằng phương pháp in vitro” 2. Mục đích nghiên cứu - Xác định được ảnh hưởng của môi trường và chất kích thích sinh trưởng tới quá trình nhân giống in vitro lan Hài Giáp. 3 - Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây từ trong ống nghiệm ra môi trường tự nhiên. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu khử trùng quả lan Hài Giáp tạo mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm. 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường tới khả năng nảy mầm của hạt lan Hài Giáp. 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng và chất hữu cơ đến khả năng nhân nhanh và sự sinh trưởng của chồi lan Hài Giáp trong ống nghiệm. 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến khả năng tạo rễ chồi lan Hài Giáp trong ống nghiệm. 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro ngoài vườn ươm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân giống lan Hài Giáp bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường nuôi cấy và thời gian khử trùng mẫu cấy, bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây lan khác. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu sẽ cố gắng cung cấp được số lượng cây giống có chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất. 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về phân loại và đặc điểm của lan Hài và lan Hài Giáp 1.1.1. Đặc điểm thực vật học của lan Hài (Paphiopedilum) 1.1.1.1. Phân loại Về mặt thực vật ho ̣c, các loài lan Hài thuộc vào 5 chi là: - Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường đươ ̣c go ̣i là Hài Vê ̣ Nữ phân bố ở các vùng ôn đới. - Chi Mexipedium, chi Phragmipedium và chi Selenipedium gồm khoảng 25 loài phân bố ở vùng nhiệt đới Châu Mi.̃ - Chi Paphiopedilum có khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiê ̣t đới châu Á từ Nam Ấn Độ và Đông Hymalaya đế n Philippine, New Guinea và Quầ n đảo Solomon. Ở Viê ̣t Nam các loài lan Hài đề u thuô ̣c giới Thực vâ ̣t (Plantae), ngành Ha ̣t kiń (Angiospermatophyta), lớp Một lá mầ m (Monocotyledoneae), phân lớp Hành (Liliidae), bô ̣ Lan (Orchidales), ho ̣ Lan (Orchidaceae), họ phu ̣ Epidendroideae, tông Cypripedioideae, chi Paphiopedilum [1]. 1.1.1.2. Nguồ n gố c Chi Paphiopedilum có nguồ n gố c từ vùng lu ̣c điạ Đông Nam Á trong đó có Viê ̣t Nam. Các loài nguyên thuỷ nhấ t của chi này đươ ̣c tìm thấ y chủ yế u ở Trung Quốc và miền Bắc Việt Nam, mỗ i loa ̣i trong chi này đề u có khu phân bố rấ t ha ̣n chế [1]. Hầ u như tấ t cả các loài lan đề u bắ t nguồ n từ các tổ tiên kiể u hypoxis có sáu mảnh bao hoa (ba mảnh bao vòng ngoài go ̣i là ba lá đài và ba mảnh bao vòng trong go ̣i là ba cánh hoa) và sáu nhi đư ̣ c̣ (ba nhi ̣đư ̣c ở vòng ngoài và ba nhi đư ̣ c̣ ở vòng trong). Xu hướng tiế n hoá của ho ̣ Lan là giảm số lươ ̣ng nhi ̣ đư ̣c và sự dính liề n giữa nhi đư ̣ ̣c hữu thu ̣ với nhi ca ̣ ́ i là sự biế n đổ i hoa cơ bản nhấ t dẫn đế n sư ̣ tiế n hoá của ho ̣ Lan. Sư ̣ giảm liên tu ̣c số lươ ̣ng nhi đư ̣ c̣ dẫn đế n sư ̣ hình thành 5 các nhóm lan có ba, hai hay mô ̣t nhi ̣đư ̣c tồ n ta ̣i trong hoa. Trong ho ̣ chi lan Hài (thuô ̣c tông Cypripedioideae) là dòng tiế n hoá có hai nhi ̣ đưc̣ còn tồ n ta ̣i trong hoa [1]; [20]. 1.1.1.3. Đă ̣c điểm hin ̀ h thái Theo Nguyễn Thiện Tịnh (2001), các loài lan Hài (Paphiopedilum) ở Việt Nam có hình dạng bên ngoài rấ t đa da ̣ng, chúng mang những đă ̣c điể m hình thái chung như sau [20]: - Da ̣ng cây: là các loài thân cỏ có kích thước trung bình với thân mang nhiề u lá mo ̣c thành hai hàng xế p thành hiǹ h qua ̣t, đôi khi có da ̣ng thân bò. Tấ t cả các loài đề u có thân rễ nhưng đa số rấ t ngắ n. - Lá: thường có hình trứng ngươ ̣c hay bầ u dục thuôn và mở rộng. Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới đó là bẹ lá hình chữ V xếp lợp xít lên nhau trên thân. Độ dài của lá có thể từ 3-50 cm. Mặt trên của lá có thể có màu xanh lá cây hoă ̣c khảm bởi các mảng đâ ̣m nha ̣t không đề u với các gân màu xanh lá nổ i rõ. Mă ̣t dưới lá có các đố m tím dày đă ̣c hoă ̣c vết tím xỉn chỉ thấ y rõ ở gầ n gố c lá. Lá của các loài điể n hình cho điều kiê ̣n số ng khô đề u dày, mo ̣ng nước và cứng. - Cu ̣m hoa: thường thẳ ng đứng hay cong, mô ̣t số loài có cuố ng hoa nằ m ngang, mô ̣t số loài lại có cuố ng hoa chúc xuố ng, nhưng hầ u hết các loài đề u có cuố ng hoa dựng đứng. Phầ n lớn các loài chỉ có mô ̣t hoa riêng lẻ, tuy nhiên cũng có loài có cụm hoa mang hai hoa, song rấ t hiế m. Tru ̣c cu ̣m hoa có lông tơ dầ y và ngắn hay có lông nhung hoă ̣c nhẵn. Lá hoa của cụm hoa gấp đôi và có hình dạng rất khác nhau tùy từng loài, từ hình múi giáo hay hình trứng và có chóp nhọn đến hình bầu dục tròn. Lá hoa thường có ít lông tơ hơn các phần khác của cụm hoa nhưng nói chung thường có lông ở mép và lông cứng gần giữa ở mặt ngoài lá, ở mô ̣t số loài có lá hoa nhẵn. - Hoa: gồ m hai lá đài ở vòng ngoài, mô ̣t lá đài lưng, mô ̣t lá đài hơ ̣p và ba cánh hoa ở vòng trong. Lá đài lưng thường lớn, hướng thẳ ng lên trên và thường 6 nổ i bâ ̣t với các va ̣ch hay chấ m ở mă ̣t trong. Lá đài lưng nằ m đố i diêṇ với lá đài hơ ̣p ở vi tri ̣ ́ thấ p hơn và hướng xuố ng phía dưới. Lá đài hơ ̣p nằ m phía sau của môi thường có mô ̣t màu tố i xỉn và kém nổ i bâ ̣t hơn so với lá đài lưng. Cả hai lá đề u thường có lông tơ dày ở mă ̣t ngoài. Hai cánh hoa bên đều dễ dàng nhận thấy ở hai bên lá đài và thường hơi xoè xuống dưới theo chiều ngang. Chúng có thể có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp, xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh hoa giữa thứ ba biế n da ̣ng rõ rê ̣t thành mô ̣t môi giố ng như cái bao hoă ̣c hình chiế c hài. Môi dạng túi sâu và phồ ng lên, hình giầ y, có lông ở mă ̣t trong và nhẵn ở mă ̣t ngoài. Nhi ̣ bấ t thụ của vòng ngoài và nhụy cái hơ ̣p thành cô ̣t nhi ̣– nhụy. Hai nhị đưc̣ hữu thu ̣ của vòng trong có chỉ nhi ̣ ngắ n dính liề n ở phía sau núm nhụy và hai bên cuốn cô ̣t. Bầu dưới, mô ̣t ô, đỉnh noañ bên là điể m đă ̣c trưng của chi này. Hầ u hết các loài lan Hài bầ u có lông tơ, hình tru ̣, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn. - Quả: da ̣ng quả nang, khô, dài, có mô ̣t ô với ba van rô ̣ng và ba van hep. ̣ Quả mở ở gầ n đỉnh bằ ng 6 rañ h nứt. Quả thường chín trong điề u kiên tự nhiên sau khi thu ̣ phấ n từ sáu đế n mười tháng. - Ha ̣t: có hin ̀ h bầu dục, hiǹ h con suố t chỉ ngắn,da ̣ng thuôn dài hay he ̣p và thường có chiề u dài từ 0,4 – 1,1 mm, phôi nhỏ dài từ 0,3 – 0,4 mm. Ha ̣t không có nô ̣i nhũ do đó rất khó nảy mầm trong điề u kiêṇ tự nhiên. - Rễ: rễ chùm, có một lớp mô xố p bo ̣c xung quanh các rễ thâ ̣t, lớp màng xố p này có vai trò trong viêc̣ giữ nước và ngăn chă ̣n ánh sáng gay gắ t. Sau khi rễ trưởng thành thì có da ̣ng sơ ̣i mảnh với hê ̣ floem phát triể n ma ̣nh và không có các búi nấ m xung quanh rễ. 1.1.1.4. Sinh thái Các loài lan Hài ở Viê ̣t Nam có thể chia thành hai nhóm riêng. Mô ̣t nhóm phân bố ở vùng núi đá vôi phiá Bắ c Viêṭ Nam từ đô ̣ cao mă ̣t nước biể n lên đế n 7 1600m, nhóm còn la ̣i phân bố ở khu vực có đá me ̣ silicat, đá phiế n và cát kế t ở đô ̣ cao từ 700m – 2200m. Ngoài ra có mô ̣t vài cá thể trong nhóm này còn mo ̣c bám ở các khe nứt hay rìa của các vách núi dựng đứng đá granit [16]. Lan Hài của Viêṭ Nam có thể số ng trên đấ t, bám đá và phu ̣ sinh mùn. Các loài sống trên đấ t thường mo ̣c ở nơi có ít ánh sáng của tán cây rừng, ở nơi sườn núi dố c, các nề n đất có nhiề u lá rơi bi ̣phân huỷ ma ̣nh và giàu chấ t mùn. Các loài lan Hài mo ̣c trên đá thường mo ̣c dưới bóng cây của kiể u rừng ít khép tán, chủ yếu là các mỏm đá và ngay bên dưới các đường đỉnh. Các loài phu ̣ sinh mù n chủ yế u số ng bá m trên vỏ cây gỗ trong các vùng rừng mây mù ẩm đô ̣ cao 1200m – 1500m [16]. Ta ̣i Viê ̣t Nam lan Hài thường phân bố ở vùng có lươ ̣ng mưa lớn, ẩm đô ̣ cao. Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiê ̣t đới gió mùa nên chúng thường phải trải qua mô ̣t giai đoa ̣n khô ha ̣n. Sự xuấ t hiê ̣n lá dày, dai và mo ̣ng nước là hướng thích nghi tốt để cây có thể sống sót đươ ̣c qua đơ ̣t khô ha ̣n đinh ̣ kỳ và chúng sẽ nhanh chóng phu ̣c hồ i khi mùa mưa trở la ̣i. Đô ̣ ẩ m xung quanh rễ, kiể u đất, đô ̣ pH, sự có mặt của các nấ m rễ, tác nhân thu ̣ phấ n và cường đô ̣ ánh sáng là các nhân tố quan tro ̣ng trong sự hiǹ h thành và phát triể n của quầ n thể lan Hài. Trong rừng nguyên sinh lan Hài phân bố đề u nhau ở các hướng của sườn núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuố ng cấ p, lan Hài có khuynh hướng phát triể n ở các sườn núi phía Bắ c, Đông Bắ c và Tây Bắ c. Ngày nay thường chỉ tìm thấ y lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Các nơi số ng tự nhiên bi pha ̣ ́ huỷ bởi con người, sự thay đổ i các điều kiêṇ môi trường và viê ̣c thu hái lan để bán là những nguyên nhân chính gây ra sự tuyê ̣t chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắ p các vùng của Viê ̣t Nam [5]; [16]. 1.1.1.5. Hiê ̣n tra ̣ng cây lan Hài Viê ̣t Nam Lan Hài là chủng ho ̣ lan có giá tri ̣ thương ma ̣i cao, được sưu tầm và tìm kiếm rất nhiều. Với sư ̣ hiê ̣n hữu của hơn 20 loài thuô ̣c chi Paphiopedilum, Viêṭ Nam là mô ̣t trong các quố c gia có nguồ n lan Hài tư ̣ nhiên phong phú. Không 8 những phong phú về chủng loa ̣i, Viê ̣t Nam còn có nhiề u loài lan đă ̣c hữu có giá tri thẩ ̣ m mĩ cao đươ ̣c thế giới ưa chuô ̣ng [15]. Vì vậy tình tra ̣ng thu thâ ̣p và xuấ t khẩ u lan Hài mô ̣t cách ồ a ̣t, không kiể m soát dẫn đế n viê ̣c lan Hài ngày càng hiế m trong tự nhiên đồ ng thời với tình tra ̣ng môi trường tư ̣ nhiên bi ̣ khai thác ca ̣n kiê ̣t như hiê ̣n nay lan Hài càng biế n mấ t nhanh chóng. Dựa trên những nghiên cứu thực điạ gầ n đây, tình tra ̣ng bảo tồ n các loài lan Hài trong tự nhiên theo tiêu chuẩn các thứ ha ̣ng về mức đô ̣ đe doa ̣ tuyê ̣t chủng của tổ chức bảo tồ n thiên nhiên Quốc tế (IUCN) đươ ̣c tổ ng kết ở bảng 1.1. 9 Bảng 1.1: Các nhóm lan Hài Viêṭ Nam theo thứ ha ̣ng bảo tồ n của Tổ chức Bảo tồ n Thiên nhiên Quố c tế (IUCN). Tên loài (tiế ngviêṭ ) Tin ̀ h trạng Tên loài (tiế ng Latinh) Đã bi tuyê ṭ chủng ̣ ngoài thiên nhiên P. vietnamense Hài Bóng Đang bị tuyêṭ chủng trầ m trọng P. delenatii Hài Đỏ P.  aspersum P.barbigerum var. lokianum P. callosum P. dianthum P. emersonii P. gratrixianum P. hangiannum P. helenae P. henryanum P.  herrmannii P. malipoense var. jackii P. malipoense P. micranthum P. purpuratum P. tralienianum P. appletonianum P. concolor P. hirsutissimum var. chiwuawnum P. hirsutissimum var. esquirolai P. villosun var. annamense P.  affine P.  datalanse P. villosum var. boxalli Chưa rõ tên go ̣i Hài Lô ̣c Hài Vân Hài Xoắn Hài Hương Lan Hài Đuôi công Hài Hằng Hài Hê Len Hài Henry Hài Herman Hài Jack Hài Giáp Hài Mố c Hồng Hài Tía Hài Trần Liên Hài Cánh Sen Hài Gia Đinh ̣ Hài Tiên biế n di ̣ Hài Tiên Hài Lông Đang bi tuyê ṭ chủng ̣ Sắ p bi tuyê ṭ chủng ̣ Thiế u dẫn liệu Hài Hoà Chưa rõ tên go ̣i Chưa rõ tên go ̣i (Nguồn: Averyanov và cs 2004 ) 10 Trên thực tế mức đô ̣ đe doa ̣tuyê ̣t chủng đố i với tất cả các loài lan Hài Viê ̣t Nam được chỉ ra ở bảng trên đây đã bi ̣thay đổ i nhiề u trong thời gian gầ n đây do sự suy giảm nhanh các quầ n thể được biế t. Trong những năm gầ n đây, qua các đợt điề u tra thực địa đã phát hiê ̣n ra tốc đô ̣ phá huỷ ma ̣nh mẽ trên diê ̣n rô ̣ng của những khu rừng còn sót la ̣i của Viê ̣t Nam chủ yế u trên các đỉnh núi đá vôi [1]; [16]; [20]. Trước tiǹ h hình lan Hài ca ̣n kiê ̣t ngoài thiên nhiên, nhiề u chương trình quố c gia về bảo tồ n loài hoa quý này đã đươ ̣c triể n khai chủ yế u là thu thâ ̣p, phân loa ̣i, nghiên cứu về các loài lan Hài và bảo tồ n môi trường số ng tự nhiên của chúng. Một công trình hơ ̣p tác quố c tế về liñ h vực này là mô tả các giố ng lan Hài ở Viê ̣t Nam của nhóm tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lô ̣c và Nguyễn Tiế n Hiê ̣p năm 2004 [1]. Một mạng lưới rộng khắp các khu bảo tồn đã được thành lập ở Việt Nam. Đặc biệt hàng loạt các khu bảo tồn đã đang bảo tồn các loài lan Hài như: - Khu bảo tồn Ngọc Linh (Kon Tum), Chue Yang Sinh (Đắc Lắc), Núi Bà (Lâm Đồng) bảo tồn loài P. appletonianum. - Khu bảo tồn Mom Ray (Kon tum), Thung Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn loài P. callosum. - Vườn Quốc Gia Ba Bể, khu bảo tồn Cát Bà (Hải Phòng), Hữu Liên (Lạng Sơn), Pà Cò (Hòa Bình), khu bảo tồn Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng) đang bảo tồn P.dalatensis. - Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Sơn (Lào Cai), Phong Quang (Hà Giang),Pà Cò (Hòa Bình) đang bảo tồn loài P. dianthum, P.micranthum. - Khu bảo tồn Na Hang (Tuyên Quang) đang bảo tồn loài P.emersoii, P.hangianum, P. malipoense varijackii. - Vườn quốc gia Tam Đảo, Hoàng Liên Sơn đang bảo tồn loài P.gratrixianum. - Khu bảo tồn Trùng Khánh (Cao Bằng) đang bảo tồn loài P. helanae. 11 - Vườn quốc gia Ba Bể, khu bảo tồn Na Hang, Hữu Liên, Pà Cồ, Phong Nha đang bảo tồn loài P. malipoense. Bên cạnh đó, nhiều nhà khoa ho ̣c đã nghiên cứu và ứng du ̣ng phương pháp nuôi cấ y mô tế bào thực vâ ̣t in vitro nhằ m nhân nhanh số lươ ̣ng lớn lan Hài. Đầ u tiên phải kể đế n PGS. TS. Dương Tấ n Nhựt người đầ u tiên nuôi cấ y thành công lan Hài Hồ ng năm 2005. Sau đó đã có nhiề u nhà nghiên cứu khác đã nuôi cấ y in vitro thành công nhiều loài lan Hài khác như hài Hằ ng, hài Tam Đảo bằng các phương pháp nuôi cấy mô khác nhau. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của lan Hài Giáp 1.1.2.1. Nguồ n gố c và sự phân bố Năm 1954, hai nhà thực vật học Trung Quốc là Chen S. C. và Tsi Z. H. đã đưa ra bản mô tả về Hài Giáp (Paphipedilum malipoense) dựa trên tiêu bản thực vật do Feng K. M. thu thâ ̣p đươ ̣c năm 1947 ở gần Malipo, đông nam tỉnh Vân Nam sát biên giới Việt Nam. Tiêu bản gốc được lưu giữ tại phòng Tiêu bản thực vật thuộc Viện Thực vật Bắc Kinh. Tuy đươ ̣c mô tả năm 1954 nhưng chỉ được đưa vào trồ ng từ năm 1984, từ đó Hài Giáp đươ ̣c xuấ t đi khỏi Trung Quốc và đươ ̣c trồ ng phổ biế n từ năm 1984 . Mặc dù đã có một lượng lớn được xuất ra khỏi Trung Quốc nhưng trong một thời gian dài sự phân bố tự nhiên và nơi sống của chúng vẫn chưa được biết rõ ràng. Ban đầu nó được thu từ những ngọn núi gần thị trấn Malipo, bên cạnh địa điểm thu mẫu chuẩn này, quần thể tự nhiên của loài này cũng được quan sát thấy dọc theo ranh giới nam của cao nguyên đá vôi Quý Châu ở độ cao 800-1100 m, về phía tây của tỉnh Quảng Tây. Rất nhiề u quầ n thể của loài lan này đươ ̣c phát hiêṇ ở Bắc Viê ̣t Nam thông qua các đơ ̣t nghiên cứu thực điạ năm 1994 – 1997 [20]; [42]. Lan Hài Giáp phân bố ở phía Bắ c Viê ̣t Nam (Bắc Kạn, Hà Giang, Hòa Bình, Lạng Sơn, Sơn La, Thanh Hoá và Tuyên Quang) trong các khu rừng nguyên sinh