Tài liệu Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của aminoreductone với các chủng listeria monocytogenes phân lập từ thực phẩm

Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì được thể hiện trong Luận văn này bao gồm nội dung nghiên cứu, kết quả nghiên cứu, số liệu thực hiện đều trung thực, được thực hiện bởi chính bản thân tôi, và chưa từng được công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đó. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Hà Nội, ngày 22 tháng 9 năm 2016 Trương Thu Hằng Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 1 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Vũ Thu Trang, giảng viên Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm người đã tận tình hướng dẫn, góp ý động viên em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Tiến Thành và Ths Lê Thị Lan Chi đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để em có thể thực hiện tốt quá trình làm việc tại Trung Tâm Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học trong thời gian qua. Ngoài ra em cũng vô cùng biết ơn Ban lãnh đạo trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này. Em cũng xin đồng cảm ơn các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và Công Nghệ Thực phẩm – Đại Học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện cho em được tốt nghiệp. Những lời cảm ơn sau cùng em xin dành cho bố mẹ, gia đình và bạn bè đã hết lòng quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 22 tháng 9 năm 2016 Trương Thu Hằng Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 2 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................1 LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................2 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................6 DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................7 DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................................9 ĐẶT VẤN ĐỀ...........................................................................................................10 CHƯƠNG I: TỔNG QU AN ....................................................................................12 1. Tổng quan về phản ứng Maillard.......................................................................13 1.1 Lịch sử nghiên cứu về phản ứng Maillard....................................................13 1.1.1 Các giai đoạn phản ứng Maillard ...........................................................14 1.1.2 Các sản phẩm chủ yếu của phản ứng Maillard và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm ...............................................................................................18 1.2 Aminoreductone ...........................................................................................19 1.2.1 Sự hình thành Aminoreductone .............................................................19 1.2.2 Ứng dụng sự tạo thành Aminoreductone để kiểm soát quá trình gia nhiệt. ................................................................................................................22 1.2.3. Các đặc tính của Aminoreductone. .......................................................24 Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 3 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ 1.2.4 Các nghiên cứu về các đặc tính của sản phẩm của phản ứng Maillard và hoạt tính kháng vi sinh vật của sản phẩm phản ứng Maillard. .......................25 1.3 Listeria monocytogenes ................................................................................28 1.3.1 Đặc điểm....................................................................................................28 1.3.2. Phân loại ...................................................................................................29 1.3.3. Lịch sử ......................................................................................................29 1.3.4. Nguồn lây nhiễm ......................................................................................29 1.3.5 Ảnh hưởng tới người và thực phẩm ..........................................................30 1.3.6 Quy định kiểm soát L. monocytogenes......................................................30 CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................33 2.1 Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................33 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................33 a. Aminoreductone (AR) .................................................................................33 b. Listeria monocytogenes ..............................................................................33 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................35 2.1.3. Thiết bị sử dụng ........................................................................................35 2.1.4 Dụng cụ và hóa chất ..................................................................................36 Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 4 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ 2.2 Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................37 2.2.1.Phương pháp tách chiết Aminoreductone .................................................37 2.2.2.Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch ....................................................40 2.2.3. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của Aminoreductone với vi khuẩn. .............................................................................................................42 2.2.4. Xác định khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone bằng phương pháp killing assay. .......................................................................................................45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................48 3.1 Khảo sát khả năng ức chế L.monocytogenes của Aminoreductone (AR) .......48 3.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Aminoreductone (AR) đối với L.monocytogenes....................................................................................................52 3.3 Khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone (AR) đối với L.monocytogenes ...54 3.4. So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với L.monocytogenes trong môi trường nuôi cấy và môi trường thực phẩm ............................................................56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................66 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................67 Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 5 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT  AR: Aminoreductone.  Ak: Amikacin.  CFU: Colony-forming unit. ( Đơn vị khuẩn lạc ).  K2HPO4: Kali hydrophosphate.  KH2PO4: Kali dihydrophosphate.  MHB: Mueller-Hinton.  MIC : Minimum Inhibitory Concentration ( Nồng độ ức chế tối thiểu ).  MBC: Minimum Bactericidal. Concentration ( Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu)  XTT : (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrezolium-5carboxanilide). Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 6 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ DANH MỤC CÁC BẢNG STT 1 Bảng Bảng 2.1 Tên Bảng Trang Danh sách 30 chủng L.monocytogenes nghiên 33 cứu được phân lập từ các sản phẩm thực phẩm 2 Bảng 2.2 Một số thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 35 3 Bảng 3.1 Kích thước đường kính kháng khuẩn của 48 Aminoreductone đối với các chủng L.monocytogenes 4 Bảng 3.2 So sánh đường kính kháng khuẩn của 50 Aminoreductone và một số kháng sinh đối với các chủng L.monocytogenes 5 Bảng 3.3 Nồng độc ức chế tối thiểu của Aminoreductone 52 đối với các chủng L.monocytogenes 6 Bảng 3.4 Khả năng diệt khuẩn của Aminoreductone đối 54 với các 8 chủng L.monocytogenes 7 Bảng 3.5 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với 56 chủng M10XC2.1 ở môi trường MHB và môi trường sữa. 8 Bảng 3.6 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với 57 chủng M10.2 ở môi trường MHB và môi trường sữa. 9 Bảng 3.7 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với 57 chủng MXC2.2 ở môi trường MHB và môi trường sữa. 10 Bảng 3.8 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với 58 chủng M50CP1.1 ở môi trường MHB và môi Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 7 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ trường sữa. 11 Bảng 3.9 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với 58 chủng M50CP3.1 ở môi trường MHB và môi trường sữa. 12 Bảng 3.10 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với 59 chủng M50XCP1.2 ở môi trường MHB và môi trường sữa. 13 Bảng 3.11 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với 59 chủng M4TH2 ở môi trường MHB và môi trường sữa. 14 Bảng 3.12 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR đối với 60 chủng M63.1 ở môi trường MHB và môi trường sữa. 15 Bảng 3.13 So sánh khả năng diệt khuẩn của AR với 8 60 chủng thử nghiệm trong môi trường MHB và môi trường sữa Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 8 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ DANH MỤC CÁC HÌNH STT Hình Tên Hình Trang 1 1.1 Phản ứng ngưng tụ đường với acid amin 13 2 1.2 Phản ứng chuyển vị Amadori tạo ra 1-amin-1-dezoxy-2- 13 xetoza 3 1.3 Phản ứng tạo thành furfurol và ozon 14 4 14 Phản ứng tạo thành reduction có 6 cacbon 15 5 1.5 Phản ứng phân hủy các hợp chất amin 16 6 1.6 Các sản phẩm của phản ứng Maillard 17 7 1.7 Quá trình hình thành Aminoreductone theo 18 Pischetsrieder, 1994 8 1.8 Quá trình hình thành Aminoreductone theo Shimamura, 19 2000 9 1.9 Sơ đồ phản ứng của Lactose và hợp chất có chứa nhóm 20 amin 10 1.10 Sơ đồ phản ứng XTT 22 11 1.11 Hình ảnh minh họa Listeria monocytogenes 26 12 2.1 Sơ đồ chuẩn bị dung dịch đệm phosphat 1,28M (pH 36 7.0). 13 2.2 Sơ đồ chuẩn bị dung dịch phản ứng 37 14 2.3 Mối tương quan giữa Aminoreductone và XTT. 38 15 2.4 Sơ đồ phương pháp XTT. 38 16 2.5 Sơ đồ tách chiết Aminoreductone. 38 17 2.6 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. 40 18 2.7 Các bước chuẩn bị môi trường chứa Aminoreductone. 41 Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 9 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP 19 2.8 Luận Văn Thạc Sĩ Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của 42 Aminoreductone với vi khuẩn 20 2.9 Hình ảnh minh họa kết quả xác định nồng độ ức chế tối 43 thiểu của Aminoreductone với vi khuẩn 21 2.10 Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của 45 Aminoreductone với L. monocytogenes ĐẶT VẤN ĐỀ Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 10 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Phản ứng Maillard là phản ứng hóa học xảy ra giữa acid amin và đường khử, có ảnh hưởng mạnh mẽ tới chất lượng sản phẩm. Nó tác động tới giá trị dinh dưỡng cũng như giá trị cảm quan của thực phẩm bởi vì phản ứng này là một trong những nguyên nhân chủ yếu làm thay đổi màu sắc, cấu trúc trong quá trình gia nhiệt, cũng đồng thời tạo ra các mùi hương đặc trưng như trong quá trình rang café, nướng bánh…….cùng lúc đó còn tạo một số sản phẩm không mong muốn. Ngoài ra hiện nay trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu xác nhận về việc hình thành các hợp chất có lợi khi xảy ra phản ứng Maillard như: hợp chất chống ung thư [26], hợp chất chống oxi hóa [28], hợp chất kháng khuẩn [29], khả năng chống cao huyết áp…[25] trong đó có những báo cáo về Aminoreductone tác dụng tương tự. Aminoreductone (AR) là một trong những sản phẩm của phản ứng Maillard, được hình thành sau một thời gian gia nhiệt ngắn, nên AR là chỉ số rất quan trọng để xác định mức độ phản ứng Maillard cũng như mức độ xử lý nhiệt trong sản xuất thực phẩm. AR được tách chiết dựa trên phương pháp của Shimamura [38]. Hợp chất cũng được biết đến có hoạt tính chống oxi hóa [40], khả năng bảo vệ riboflavin dưới tác dụng của ánh sáng [46]. Ngoài ra còn có những nghiên cứu cơ bản chứng minh khả năng chống lại một số chủng vi khuẩn gây bệnh tồn tại trong thực phẩm như : Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis [44]. Qua các báo cáo như trên có thể thấy được hiệu quả kháng khuẩn của AR từ đây có thể thử thêm hoạt tính trên các chủng gây bệnh khác để làm rõ hơn khả năng diệt khuẩn của AR. Listeria monocytogenes là một vi khuẩn gây bệnh, Gram +, tồn tại nhiều trong thực phẩm, là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh Listeriosis (một bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn Listeria monocytogenes). [4] Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 11 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Dựa trên kết quả nghiên cứu từ trước được công bố về sản phẩm của phản ứng Maillard gây ức chế gen gây độc đối với Listeria monocytogenes nhưng cũng không rõ ràng là hợp chất nào [20] và tới hiện nay vẫn chưa thấy có báo cáo liên quan tới khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh Listeria monocytogenes của AR. Với mong muốn tìm hiểu sâu sắc hơn nữa tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của Aminoreductone với các chủng Listeria monocytogenes phân lập từ thực phẩm.”. Trong phạm vi đề tài này, tôi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của AR trên chủng vi khuẩn gây bệnh : Listeria monocytogenes được phân lập từ các sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp xác định vòng kháng khuẩn, xác định nồng độ ức chế tối thiểu, và khả năng diệt khuẩn với nội dung nghiên cứu sau : 1. Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Listeria monocytogenes của AR 2. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của AR với vi khuẩn Listeria monocytogenes 3. Xác định khả năng diệt Listeria monocytogenes của AR đối với vi khuẩn Listeria monocytogenes 4. So sánh khả năng diệt Listeria monocytogenes của AR trong môi trường nuôi cấy và môi trường thực phẩm CHƯƠNG 1: TỔNG QU AN Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 12 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ 1. Tổng quan về phản ứng Maillard 1.1 Lịch sử nghiên cứu về phản ứng Maillard Phản ứng Maillard xảy ra giữa acid amin và đường khử ( ví dụ như glucose, fructose, lactose), đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong kỹ thuật sản xuất thực phẩm. Phản ứng Maillard ảnh hưởng tới giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan của sản phẩm, chủ yếu làm thay đổi màu sắc, cấu trúc trong quá trình gia nhiệt, đồng thời tạo ra các mùi hương đặc trưng, ngài ra còn tạo ra một số sản phẩm phụ không mong muốn. Vì vậy tùy thuộc vào yêu cầu tính chất, cảm quan của từng sản phẩm mà người ta tăng cường hoặc kìm hãm các yếu tố liên quan để kiểm soát quá trình xảy ra phản ứng [1]. Phản ứng Maillard được đặt tên theo nhà hóa học người Pháp Louis Camille Maillard (1878 – 1936), người đầu tiên phát hiện ra phản ứng. Năm 1912 trong lúc Maillard đang cố gắng tìm cách tổng hợp protein sinh học trong ống nghiệm, thời điểm hợp chất hình thành mùi và màu sắc đã khiến ông liên tưởng tới các phản ứng hóa học xảy ra trong thực phẩm. Cũng cùng năm đó, ông công bố những dữ liệu ban đầu liên quan tới thành phần hóa học đồng thời dự đoán về khả năng ứng dụng của hợp chất trong nhiều lĩnh vực như khoa học, sinh học thậm chí liên quan tới bệnh lý của con người. Luận điểm này đã bị bác bỏ bởi cộng đồng nghiên cứu khoa học cho tới tận năm 1941, cuối cùng vào năm 1948 phản ứng Maillard được thừa nhận chắc chắn là nguyên nhân tạo màu nâu và làm giảm giá trị dinh dưỡng trong sữa bột [17].Sau đó rất nhiều bài báo cáo đã đề cập tới những phản ứng phức tạp xảy ra và bằng nhiều phương thức khác nhau để đánh giá sự ảnh hưởng từ các thông số ( pH, nhiệt độ, thời gian, đường phản ứng, nồng độ các chất, hoạt độ nước…) cùng với sự thay đổi chất lượng thực phẩm, dinh dưỡng, tổn thất Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 13 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ acid amin cần thiết, sự trao đổi chất trong sản phẩm phản ứng, tác dụng sinh lý khi ăn các sản phẩm của phản ứng Maillard [28]. 1.1.1 Các giai đoạn phản ứng Maillard Dựa vào mức độ màu sắc của các sản phẩm có thể chia thành 3 giai đoạn kế tiếp nhau như sau: - Giai đoạn đầu: sản phẩm không màu và không hấp thụ ánh sáng tia cực tím. - Giai đoạn trung gian: không màu hoặc có màu vàng, hấp thụ mạnh ánh sáng cực tím. - Giai đoạn cuối: màu đậm. a. Giai đoạn đầu - Phản ứng ngưng tụ cacbonylamin Giai đoạn đầu tiên của phản ứng Maillard là sự ngưng tụ đường với acid amin. Trong điều kiện nhiệt độ sinh lý thì tạo thành base Schiff (Hợp chất hữu cơ có nhóm - HC=N -) hoặc glucozit. Hình 1.1 Phản ứng ngưng tụ đường với acid amin - Phản ứng chuyển vị Amadori. Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 14 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Khi ở nhiệt độ cao phức đường amin bị đồng phân hóa hay còn gọi là chuyển vị nội phân Amadori. Kết quả là giữa nguyên tử thứ nhất và thứ 2 sinh ra nối kép tạo thành 1 – amin – 1 – dezoxy – 2 – xetoza. Hình 1.2 Phản ứng chuyển vị Amadori tạo ra 1-amin-1-dezoxy-2-xetoza Phẩm vật của sự chuyển vị Amadori là hợp chất có khả năng phản ứng và là chất khởi đầu để tạo thành polymer có màu sẫm gọi là melanoidin. b. Giai đoạn trung gian Giai đoạn này xảy ra sự khử nước của 1 – amin – 1 – dezoxy – 2 – xetoza. Tùy điều kiện môi trường và nhiệt độ mà tạo thành sản phẩm phân ly khác nhau. - Tạo thành furfurol và ozon. Hình 1.3 Phản ứng tạo thành furfurol và ozon - Tạo thành reductone có 6 cacbon. Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 15 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Các aminodezoxyxetoza được tạo thành khi chuyển vị Amadori có thể bị khử đi 2 phân tử H20 để tạo thành reductone có 6 cacbon. Reductone là những hợp chất hữu cơ có tính khử mạnh do có mặt nhóm endiol, thường nhóm này được liên kết với gốc aldehyde hoặc gốc acid. VD: Reductone đơn giản nhất là triozoreductone Hình 1.4 Phản ứng tạo thành reduction có 6 cacbon - Phân hủy các hợp chất amin Base Schiff được tạo thành bị phân ly thủy phân thành aldehyde và hợp chất amin, chất này cho các phẩm vật chứa nito và có màu nâu sau này: Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 16 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ Hình 1.5 Phản ứng phân hủy các hợp chất amin c. Giai đoạn cuối Giai đoạn cuối này bao gồm nhiều phản ứng phức tạp, có thể chia thành 2 kiểu phản ứng: - Phản ứng ngưng tụ alldol với sự tạo thành polymer màu nâu không chứa nito. - Phản ứng trùng hợp hóa aldehitamin với sự tạo thành các hợp chất nito dị vòng. Giai đoạn cuối cùng của phản ứng melanoidin sẽ tạo nên đầu tiên là các polymer không no hòa tan được trong nước, sau đến là các polymer không no và không hòa tan được trong nước, nhưng đều có màu đậm và có cùng tên gọi chung là melanoidin. Các melanoidin hấp thụ mạnh tia cực tím (λ<220nm) không khử được dung dịch Feling, nhưng khử được iot và 2,6 – diclophenolindophenol. Khả năng hòa tan của melanoidin phụ thuộc vào nhiệt độ mà phản ứng tiến hành. Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 17 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ 1.1.2 Các sản phẩm chủ yếu của phản ứng Maillard và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Hình 1.6 Các sản phẩm của phản ứng Maillard Như đã nêu ở trên phản ứng Maillard là phản ứng giữa acid amin và đường khử xảy ra trong điều kiện rất dễ dàng do đó phản ứng này rất phổ biến trong sản xuất và bảo quản các sản phẩm thực phẩm. Tùy thuộc và yêu cầu về tính chất cảm quan của từng sản phẩm mà người ta hoặc tạo điều kiện để tăng cường phản ứng đến tối đa hoặc kìm hãm phản ứng đến tối thiểu [1]. Do ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng sản phẩm, nghiên cứu về phản ứng Maillard là mối quan tâm của các nhà khoa học và nhà công nghệ trên thế giới, rất nhiều nghiên cứu với mong muốn làm sáng tỏ và khám phá các cơ chế hình thành phản ứng Maillard cũng như ứng dụng và khả năng tác động của nó đã được thực hiện, Aminoreductone là một trong số đó. Aminoreductone (AR) là một trong những sản phẩm của phản ứng Maillard, hình thành trong giai đoạn đầu của quá trình gia nhiệt, AR được sử dụng như một thông số quan trọng để phát hiện và kiểm Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 18 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ soát phản ứng Maillard trong thực phẩm, do đó đã có những nghiên cứu cơ bản liên quan tới được thực hiện. 1.2 Aminoreductone 1.2.1 Sự hình thành Aminoreductone AR được phát hiện lần đầu tiên bởi Monika Pischetsrieder [23] khi tác giả nghiên cứu về sự hình thành của AR từ maltose. Ba cấu trúc chung của AR thu được bắt nguồn từ hợp chất nguồn gốc Amadori maltose . 3-Hydroxy-5,6dihydropyridones cũng được hình thành trong phản ứng. Phản ứng của maltose với amin dẫn đến sự hình thành của một chuỗi mở C6-aminoreducton và 3-hydroxy5,6-dihydropyridone [22]. Hình 1.7 Quá trình hình thành Aminoreductone theo Pischetsrieder, 1994 Maltoza + NH2R' Ac HC N R' C OAc C O CH CH H2C OAc 2 a: R= H b: R= glucoza R H H2C NHR' C O HO CH R HC OR HC OH H2C OH glucoza 1 a,b HC NHR' C OH C O CH2 HO HC OH H2C OH 3 O OH N R' 4 R’ = e.g. propyl. butyl Hình 1.3: Quá trình hình thành Aminoreducton theo Pischetsrieder, 1994 Năm 1998, sự hình thành AR tiếp tục được khảo sát bởi Pischetsrieder [24], tác giả cho rằng AR được hình thành do phản ứng của Lactose với Naacetyllysinyllysine hoặc protein. Khi đun nóng lactoza với Nα acetyllysine trong một thời gian ngắn, tạo thành một sản phẩm hấp thụ tối đa tia cực tím ở bước sóng 319 nm. Được xác định là AR có cấu trúc là: 1 - [Nε-(Nα-acetyllysinyl)] -1,2-dehydro-4deoxy-3-hexulose. Cấu trúc của AR tương tự như cấu trúc của sản phẩm thu được từ phản ứng của butylamin và maltoza. Khi đun nóng lactoza với protein của sữa, Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 19 Đại Học Bách Khoa Hà Nội Trương Thu Hằng_CNTP Luận Văn Thạc Sĩ chẳng hạn như β-lactoglobulin, sản phẩm tạo thành là AR. Kể từ đó, AR được tạo thành sau khi gia nhiệt trong một thời gian ngắn, tác giả cho rằng AR là sản phẩm mới có thể có tầm quan trọng cho phản ứng Maillard trong quá trình chế biến sữa [18]. Năm 2000 Tomoko Shiramura và Hiroyuki Ukeda đã khảo sát phản ứng tạo AR giữa Lactose và Butylamin ở các dải nhiệt độ khác nhau, kết quả thu được phản ứng xảy ra ở 1000 C tạo được sản phẩm hấp thụ tia cực tím cực đại đặc trưng ở λ = 320nm [38]. Hình 1.8 Quá trình hình thành Aminoreductone theo Shimamura, 2000. H2C NHR HC O CO HC OH RNH 2 HO CH HO CH HC O gal HC O gal HC OH HC OH CH2OH CH2OH Lactoza Galactoza H2C NHR CO CO CH2 HC OH CH2OH 4 – deoxyosone Sản phẩm Amadori HC NHR C OH CO CH2 HC OH CH2OH 1-alkylamino-1,2 dehydro-4-deoxy-3hexuloza Cũng theo hướng nghiên cứu đó, năm 2011 nhóm nghiên cứu của giáo sư Shimamura đã tìm thấy sự tồn tại của AR khi xảy ra phản ứng Maillard trong sữa. Hiện nay, sự hình thành của AR đã được chứng minh trong một mô hình mẫu bao gồm một monosaccarit hay disaccarit và một hợp chất có chứa nhóm amino. Trong nghiên cứu này, sự kết hợp của dinitrophenylhydrazine 2,4 (DNP) và Cu 2+ đã được kiểm tra. Một cấu trúc được xác định qua quá trình phân tích quang phổ NMR cho thấy dẫn xuất DNP của AR bị ôxi hóa bởi Cu2 +. Điểm nổi bật là việc kết hợp giữa dinitrophenylhydrazine 2,4 và Cu2 + có hiệu quả giải phóng ra AR từ protein sữa [39]. Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm 20 Đại Học Bách Khoa Hà Nội