BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN HẢI VÂN
NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH VÀ CƠ CHẾ KHÁNG KHUẨN CỦA
TINH DẦU MÀNG TANG (LITSEA CUBEBA) ĐỐI VỚI
VI KHUẨN GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG
NUÔI TRỒNG THUỶ SẢN
Ngành: Công nghệ Thực phẩm
Mã số: 9540101
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Hà Nội - 2018
1
Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Chu Kỳ Sơn
TS. Samira Sarter
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Vào hồi …….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ………
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội
2. Thư viện Quốc gia Việt Nam
2
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Khai thác và nuôi trồng thuỷ sản là một trong những ngành phát triển
nhanh và là nguồn cung cấp protein quan trọng cho con người. Việt Nam
đứng trong top 5 trong các nước nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới. Tuy nhiên,
sự bùng phát của như Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus đã
gây nên những tổn hại to lớn về mặt kinh tế. Kháng sinh thường được sử
dụng trong thủy sản với mục đích ngăn ngừa nhiễm trùng do vi khuẩn. Tuy
nhiên, việc lạm dụng và sử dụng không đúng cách thuốc kháng sinh là một
trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự phát triển của vi khuẩn kháng
thuốc kháng sinh. Thêm vào đó, các gen kháng kháng sinh còn thể lây truyền
ngang giữa vi sinh vật – động vật – con người (Witte, 2000).
Ngày càng có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng các hợp chất
kháng sinh tự nhiên ví dụ như các sản phẩm từ thực vật. Tinh dầu (TD) là
sản phẩm trao đổi chất bậc hai của các loài thực vât, có thể chiết xuất được
từ nhiều bộ phận khác nhau của thực vật, ví dụ như hoa (nhài, oải hương…),
lá (màng tang, húng quế…), thân (quế…), quả (màng tang, hồi…).
TD chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt hoạt tính kháng
khuẩn. Khả năng kháng khuẩn của TD phụ thuộc vào thành phần hoá học có
mặt trong TD và vi sinh vật. Cơ chế kháng khuẩn của TD được chứng minh
qua các nghiên cứu. Tính chất kỵ nước của TD giúp cho chúng dễ dàng xâm
nhập vào tế bào thông qua sự tương tác của TD với màng tế bào. TD có thể
gây ra một số tác động như: làm hư hại thành tế bào và tế bào chất, đông tụ
tế bào chất, rối loạn chức năng của các protein màng tế bào, tăng tính thấm
màng tế bào dẫn đến tổn thất các chất nội bào, làm giảm lực proton, giảm
hàm lượng ADN, giảm hàm lượng ATP trong tế bào thông qua việc giảm
quá trình tổng hợp ATP và làm giảm điện thế màng tế bào do tăng tính thấm
màng tế bào (Li, 2016; Zengin, 2014; Cui, 2015; Li, 2014).
Nhiều nghiên cứu chỉ ra tiềm năng ứng dụng của TD hoặc chất chiết từ
thực vật trong thuỷ sản. Trên thực tế, các hợp chất thiên nhiên có tác dụng
làm tăng các chỉ tiêu tăng trưởng, chỉ tiêu miễn dịch cũng như khả năng
phòng chống các tác nhân gây bệnh cho động vật thuỷ sản. Việt Nam có tiềm
năng khai thác nguồn TD lớn, các nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của
TD tại Việt Nam đang được ngày càng quan tâm. Tuy nhiên, số lượng nghiên
cứu về cơ chế kháng khuẩn cũng ứng dụng các chất chiết thực vật trong thuỷ
sản vẫn còn hạn chế.
Vì những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu hoạt tính và cơ chế
kháng khuẩn của tinh dầu màng tang (Litsea cubeba) đối với vi khuẩn gây
bệnh và khả năng ứng dụng trong nuôi trồng thuỷ sản” cho luận án tiến
sỹ.
1
2. Mục tiêu nghiên cứu
• Sàng lọc các TD để chọn được một TD có hoạt tính kháng khuẩn tốt
ở Việt Nam đối với vi khuẩn gây bệnh thực phẩm và thủy sản.
• Chứng minh được cơ chế kháng khuẩn của TD đối với vi khuẩn.
• Ứng dụng được các kết quả nghiên cứu trong thuỷ sản.
3. Nội dung nghiên cứu
ND 1: Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của một số loại TD từ Việt Nam
đối với chủng vi khuẩn kiểm định và vi sinh vật phân lập từ thủy sản như
Escherichia coli, Aeromonas spp., Vibrio spp., …
ND 2: Nghiên cứu sự đa dạng về thành phần hóa học và khả năng kháng
khuẩn của một TD (chọn lọc từ Nội dung 1) tại Việt Nam.
ND 3: Nghiên cứu cơ chế kháng khuẩn của TD bao gồm đánh giá sự toàn
vẹn màng tế bào, kiểm tra tính thấm màng tế bào, tỉ lệ vi khuẩn sống chết,
hình thái và kích thước vi khuẩn, tổn thương ADN.
ND 4: Ứng dụng vào thủy sản trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus
vannamei) và cá chép (Cyprinus carpio) tại Việt Nam.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
4.1. Ý nghĩa khoa học
- Đã chứng minh được hoạt tính kháng khuẩn của 9 loại TD ở Việt Nam đối
với các vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong thực phẩm và thủy sản.
- Đã chỉ ra thành phần hóa học và hoạt tính của 25 TD lá màng tang Litsea
cubeba tại Việt Nam đối với một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp.
- Đã chứng minh được cơ chế kháng khuẩn của 2 TD lá màng tang L. cubeba
chứa thành phần hóa học chính khác nhau (1,8-cineole và linalool) đối với
E. coli.
4.2. Giá trị thực tiễn
- Việc áp dụng thành công các kết quả nghiên cứu ở quy mô phòng thí
nghiệm trên 2 đối tượng tôm thẻ chân trắng và cá chép trong phòng và trị
bệnh sẽ giúp giảm thiểu tình trạng lạm dụng kháng sinh trong thủy sản.
- Việc thay thế kháng sinh bằng các sản phẩm có nguồn gốc thực vật giúp
giảm thiểu tình trạng kháng kháng sinh ở động vật đang ngày càng tăng cao
ở Việt Nam và trên thế giới, đồng thời khắc phục các hậu quả kinh tế do đề
kháng kháng sinh.
- Các kết quả đề tài có thể sử dụng làm tài liệu tham khảo cho giảng dạy,
nghiên cứu khoa học và ứng dụng trong thực tế sản xuất, đồng thời mở ra
nhiều các hướng nghiên cứu mới trong tương lai.
5. Những điểm mới của luận án
- Kết quả của nghiên cứu này là một trong những kết quả đầu tiên đóng góp
2
vào cơ sở dữ liệu về thành phần hoá học và khả năng kháng khuẩn của cây
màng tang tại Việt Nam.
- Là công trình đầu tiên (ở Việt Nam) nghiên cứu về cơ chế kháng khuẩn của
TD lá màng tang L. cubeba đối với vi khuẩn Escherichia coli.
- Là công trình đầu tiên đánh giá hiệu quả bước đầu của bột lá màng tang L.
cubeba trên cá chép và TD quả màng tang L. cubeba trên tôm thẻ chân trắng.
6. Bố cục của luận án
Luận án được trình bày trong 134 trang: mở đầu (3 trang), tổng quan tài
liệu (36 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (16 trang), kết quả và
thảo luận (59 trang, 12 bảng, 21 hình), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh
mục các công trình đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (21 trang với
5 tài liệu tiếng Việt và 199 tài liệu tiếng Anh).
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 Tinh dầu-sản phầm nguồn gốc thực vật thay thế kháng sinh bao gồm
05 tiểu mục. 1.1.1 Định nghĩa và hoạt tính sinh học của TD 1.1.2 Thành phần
hóa học của TD: bao gồm các nhóm terpene, phenylpropanoid, và một số ít
thành phần hoá học chứa nitơ và lưu huỳnh. 1.1.3 Khả năng kháng khuẩn của
TD: giới thiệu chung về khả năng kháng khuẩn của TD và đối tượng chính
của nghiên cứu TD màng tang L. cubeba 1.1.4. Tăng cường hoạt tính kháng
khuẩn của TD khi sử dụng kết hợp với chất kháng khuẩn khác. 1.1.5. Cơ chế
kháng khuẩn của TD: giới thiệu về các cơ chế chính của TD được nghiên cứu
cho đến nay.
1.2. Thuỷ sản Việt Nam bao gồm 04 tiểu mục 1.2.1 Tổng quan về tình hình
thuỷ sản tại Việt Nam 1.2.2 Các động vật thuỷ sản: giới thiệu cá chép C.
carpio và tôm thẻ chân trắng L. vannamei 1.2.3 Vi khuẩn gây bệnh thuỷ sản:
giới thiệu A. hydrophila và V. parahaemolyticus 1.2.4 Sử dụng kháng sinh
trong thuỷ sản: tình hình sử dụng kháng sinh trong thuỷ sản và hậu quả của
việc lạm dụng kháng sinh trong thuỷ sản. Chính vì vậy, cần tìm nguồn kháng
khuẩn mới để thay thế việc sử dụng kháng sinh.
1.3. Tiềm năng của việc sử dụng chất chiết thực vật trong thuỷ sản bao
gồm 03 tiểu mục 1.3.1 Chất chiết thực vật đóng vai trò tác nhân tăng trưởng
1.3.2 Chất chiết thực vật đóng vai trò tăng cường hệ miễn dịch 1.3.3 Chất
chiết thực vật đóng vai trò chất kháng khuẩn.
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
- Tinh dầu
+ 09 TD thương mại bao gồm hương nhu (Ocimum gratissimum), tràm lá dài
(Meulaleuca leucadendron), quế (Cinnamomum loureiri), sẻn hôi
(Zanthoxylum rhetsa), thanh hao hoa vàng (Artemisia annua), quả màng tang
3
(Litsea cubeba), húng quế (Ocimum basilicum), dầu giun (Chenepodium
ambrosioides) và bạc hà Á (Mentha arvensis) - được mua từ công ty
AROMA ASIA có nguồn gốc từ các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam.
+ Lá cây màng tang L. cubeba tươi được thu tại 7 tỉnh phía Bắc Việt Nam,
mẫu được gửi đến định danh và lưu tại Bảo tàng Thực vật học – Học viện
Nông nghiệp Việt Nam (VNUA). 25 TD lá màng tang L. cubeba được tách
chiết bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn theo hơi nước.
- Kháng sinh: khoanh giấy kháng sinh amikacin 30 g/đĩa (AK30) và
cefoxitin 30 g/đĩa (FOX30) (Lifochem), kháng sinh dạng bột
oxytetracycline (OTC) và nalidixic axit (Sigma Aldrich).
- Vi khuẩn:
+ 10 chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm 5 vi khuẩn Gram (-): Salmonella
enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC 14028, E. coli ATCC
25922, A. hydrophila ATCC 35654, Vibrio furnissii ATTC 35016, V.
parahaemolyticus ATCC 17802 và 5 vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtilis
ATCC 11774, Listeria innocua ATCC 33090, Staphylococcus aureus ATCC
25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 13061.
Nghiên cứu đồng thời sử dụng các chủng vi sinh vật phân lập từ thủy sản lấy
từ một vài nguồn sau:
+ Edwarsiella tarda AR436, Streptococcus garvieae AR759 do Phòng thí
nghiệm thú ý quốc gia, Montpellier, Pháp cung cấp.
+ V. parahaemolyticus ND201 và V. parahaemolyticus TB81 cảm nhiễm tôm
thẻ chân trắng do Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương – Hà Nội cung cấp.
+ Vi khuẩn cảm nhiễm cá chép A. hydrophila do Phòng thí nghiệm Bệnh học
(Khoa Thuỷ sản – Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh) cung cấp.
- Tôm thẻ chân trắng (Littopenaeus vannamei) khỏe mạnh, khối lượng trung
bình 5,0 g được mua từ Phòng thí nghiệm tư nhân Tiến sĩ Bùi Quang Tề.
- Cá chép (Cyprinus carpio) giống khoẻ mạnh, khối lượng trung bình 30,0 g,
được mua từ trại cá giống Viện Thuỷ sản I.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết và tính hiệu suất thu hồi TD màng tang L. cubeba
25 mẫu lá cây màng tang L. cubeba được tách chiết bằng phương pháp chưng
cất lôi cuốn theo hơi nước (Randrianarivelo, 2009). Hiệu suất thu hồi TD
được tính theo công thức Y = V/Bm, trong đó V: thể tích TD tách chiết được
(mL), Bm: khối lượng lá tươi ban đầu (g) (Costa, 2014).
2.2.2. Phân tích thành phần hóa học của TD
Thành phần hoá học của 09 TD thương mại và 25 TD lá màng tang L. cubeba
tách chiết được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS).
4
2.2.3. Phương pháp khoanh giấy khuếch tán dùng để xác định đường kính
vòng kháng khuẩn của TD đối với vi sinh vật (Wilkinson, 2003).
2.2.4. Phương pháp pha loãng liên tục dùng để xác định giá trị nồng độ ức
chế tối thiểu MIC và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (Celiktas, 2007).
Sàng lọc và tuyển chọn 01 TD có hoạt tính kháng khuẩn tốt dựa trên đường
kính vòng kháng khuẩn và giá trị MIC, MBC của TD đối với vi sinh vật gây
bệnh thường gặp trong thực phẩm và thủy sản. Do có khả năng kháng khuẩn
tốt, tiềm năng khai thác cũng như chưa được nghiên cứu nhiều tại Việt Nam,
cây màng tang L. cubeba được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo.
2.2.5. Tương tác kháng khuẩn của TD quả màng tang L. cubeba với các
chất kháng khuẩn khác (TD hoặc kháng sinh) được xác định bằng phương
pháp bàn cờ, tính toán giá trị nồng độ ức chế riêng phần (FIC). Tác dụng
tương tác bao gồm hiệp đồng (FIC≤0,5), cộng hợp (0,54) (Gutierrez, 2009).
TD lá màng tang BV27 (90% linalool) và LC19 (50% 1,8-cineole) được sử
dụng để nghiên cứu cơ chế kháng khuẩn đối với E. coli, bao gồm:
2.2.6. Ảnh hưởng của TD lá màng tang L. cubeba LC19 và BV27 đến sự
sống sót của E. coli theo thời gian (Li, 2014), 2.2.7. sự nguyên vẹn màng
tế bào và tính thấm màng tế bào (Visvalingam, 2012) bằng cách sử dụng kit
nhuộm huỳnh quang Live/Dead Baclight và kit nhuộm màng tế bào FM 464, 2.2.8. kích thước tế bào, 2.2.9. ADN của E. coli bằng kit nhuộm huỳnh
quang DAPI (Cui, 2015). Hình ảnh thu được trên kính hiển vi huỳnh quang
được phân tích bằng phần mềm Image J.
2.2.10. Độc tính của vi khuẩn gây bệnh thủy sản được xác định dựa trên giá
trị nồng độ gây chết 50% (LD50).
2.2.11. Ảnh hưởng của TD quả màng tang L. cubeba và kháng sinh
oxytetracycline đến tôm thẻ chân trắng
Tôm thẻ chân trắng khoẻ mạnh được nuôi thích nghi ở điều kiện phòng
thí nghiệm trong 1 tháng, sau đó cho cảm nhiễm chủ động với V.
parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tuỵ cấp. Khi tôm có dấu hiệu bệnh
(sau 2 ngày), nhúng tôm trong các mẫu thí nghiệm bao gồm: TD màng tang
1,67 mg/mL (MIC), kháng sinh oxytetracycline 16.7 g/mL (MIC) và hỗn
hợp TD/kháng sinh (FIC). Đánh giá tỉ lệ sống sót của tôm và hàm lượng vi
sinh vật (Vibrio) trong nước, tôm sống, tôm chết vào ngày cuối của quá trình
thí nghiệm. Mẫu kiểm chứng âm (không cảm nhiễm, không xử lý chất kháng
khuẩn) và mẫu kiểm chứng dương (cảm nhiễm, không xử lý chất kháng
khuẩn) được tiến hành đồng thời ở cùng điều kiện. Mỗi thí nghiệm được lặp
lại 3 lần với thể tích 4 L/bể, mỗi bể chứa 20 con tôm.
2.2.12. Ảnh hưởng của bột lá cây màng tang L. cubeba đến cá chép
5
Chuẩn bị bột lá cây: : Lá cây màng tang L. cubeba sau khi thu hái tại tỉnh
Phú Thọ, tách cành, rửa sạch, sấy ở 50oC, sau đó nghiền nhỏ để thu dạng bột.
Chuẩn bị thức ăn: Bột lá màng tang được bổ sung vào thức ăn thương mại
của cá chép với tỉ lệ 0, 2,4 và 8% (w/w), ép đùn, cắt thành dạng viên nhỏ và
bảo quản ở 4oC đến khi sử dụng.
Thí nghiệm cho ăn: Cá chép C. carpio được cho ăn thức ăn bổ sung và
không bổ sung bột lá cây màng tang trong thời gian 21 ngày, mỗi ngày cho
ăn 2 lượt (8h và 18h) với tổng lượng thức ăn cho ăn là 3% khối lượng cá.
Mỗi nghiệm thức thức ăn được lặp 3 lần. Khối lượng và huyết tương của cá
chép trước (T0) và sau khi cho ăn (T21) được ghi lại để xác định chỉ tiêu tăng
trưởng và miễn dịch.
Chỉ tiêu tăng trưởng: các chỉ tiêu tăng trưởng được tính như sau
Tăng khối lượng: WG = Wt-Wo
Hệ số chuyển đổi thức ăn: FCR = tổng trọng lượng thức ăn/WG
Tốc độ tăng trưởng đặc trưng: SGR = 100 x (LnWt-LnWo)/t
Trong đó, Wt khối lượng kết thúc của cá chép, Wo là khối lượng ban đầu của
cá chép, t là số ngày thí nghiệm (21 ngày).
Chỉ tiêu miễn dịch: Huyết tương của cá chép được thu vào ngày T0 và T21
để xác định các chỉ tiêu miễn dịch bao gồm: lysozyme (Lazard, 1999); diệt
khuẩn (Leano, 2003); hoạt động bổ thể ACH 50 (Caruso, 2005).
Cảm nhiễm: Sau 21 ngày ăn thức ăn bổ sung bột lá cây màng tang L. cubeba,
cá chép được cảm nhiễm bằng A. hydrophila gây bệnh và theo dõi tỉ lệ sống.
Tỉ lệ sống tương đối (Relative Percent of Survival-RPS):
RPS = [1 – (% cá chết ở nghiệm thức sử dụng thuốc/% cá chết ở nghiệm thức
đối chứng dương)] x 100.
2.2.14. Phương pháp xử lý thống kê
Kiểm định ANOVA, kiểm định Kolmogorof-Smirnov và Levene, sự
khác nhau có nghĩa được xác định bằng Holm-Sidak hoặc Fisher LSD ở mức
ý nghĩa 5% được sử dụng để so sánh MIC, MBC, chiều dài vi khuẩn, phần
trăm vi khuẩn sống chết, vi khuẩn hư hại màng tế bào, hư hại DNA. Kiểm
định chi-square được sử dụng để so sánh tỉ lệ chết của cá, và kiểm định
Kaplan-Meier được sử dụng để xây dựng đồ thị sống sót.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sàng lọc để chọn lựa 01 tinh dầu cho các nghiên cứu tiếp theo
Kết quả thành phần hóa học, đường kính vòng kháng khuẩn và giá trị
MIC của 09 loại TD thương mại Việt Nam đối với 10 chủng vi sinh vật kiểm
định (Bảng 3.1, Bảng 3.2, Bảng 3.3) cho thấy tất cả các loại TD đều có khả
năng kháng khuẩn. Tác dụng kháng khuẩn của TD phụ thuộc vào thành phần
6
hoá học của các hợp chất có mặt trong TD (Bảng 3.1). Có thể sắp xếp khả
năng kháng khuẩn của 9 TD theo thứ tự tăng dần như sau: thanh hao hoa
vàng A. annua < húng quế O. basilicum < sẻn hôi Z. rhesta < bạc hà Á M.
arvensis < tràm lá dài M. leucadendron < hương nhu O. gratissimum < quả
màng tang L. cubeba < dầu giun C. ambrosioides < quế C. cassia.
Tại Việt Nam, cây màng tang có tiềm năng khai thác lớn, thường mọc
hoang ở các tỉnh miền núi, các vùng đất mới khai hoang, ven rừng. Bên cạnh
đó, số lượng nghiên cứu ở Việt Nam cũng như quốc tế vẫn chưa nhiều, chủ
yếu tập trung vào TD quả màng tang. Chính vì vậy, nghiên cứu lựa chọn cây
màng tang, đặc biệt tập trung vào lá cây màng tang cho những nghiên cứu
tiếp theo, bao gồm: nghiên cứu sự đa dạng về thành phần hoá học và khả
năng kháng khuẩn của TD lá màng tang tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam,
nghiên cứu cơ chế kháng khuẩn của TD lá màng tang đối với E. coli, ứng
dụng cây màng tang trong thuỷ sản.
Bảng 3.1: Thành phần hoá học chính của 9 tinh dầu sử dụng trong nghiên cứu
Thành phần chính
E-β-ocimene
eugenol
β-caryophyllen
-muurolene
1,8-cineole
o-cymene
terpinolene
α-terpineol
trans-cinnamaldehyde
α-phellandrene
α terpinene
limonene
1,8-cineole
camphor
β-caryophylene
-muurolene
limonene
carveol
citral
estragole
p-cymene
α-terpinolen
ascaridol
menthone
menthol
Tinh dầu
Hương nhu Ocimum gratissimum
Tràm lá dài Melaleuca leucadendron
Quế Cinnamomum cassia
Sẻn hôi Zanthoxylum rhetsa
Thanh hao hoa vàng Artemisia annua
Quả màng tang Litsea cubeba
Húng quế Ocimum basilicum
Dầu giun Chenopodium ambrosioides
Bạc hà Á Mentha arvensis
%
15,24
48,50
6,47
10,33
34,50
7,79
8,33
8,01
87,69
28,13
21,31
20,32
16,96
26,80
8,61
10,41
17,13
31,13
39,25
90,71
17,47
57,34
22,05
17,68
69,95
3.2. Sự đa dạng về thành phần hóa học và khả năng kháng khuẩn của
tinh dầu màng tang L. cubeba
Do hoạt tính sinh học của cây thực vật hụ thuộc rất vào thành phần hoá
học có mặt trong đó, chính vì vậy, việc xác định sự đa dạng về thành phần
7
hoá học cũng như xác định sựđổẩn rất qi hoạt tính kháng khuẩn uan trphụ
thuộc vào thành phần hoá học đó rất quan trọng trước khi ứng dụng.
3.2.1. Tác dụng tương tác của TD quả màng tang L. cubeba đối với các
chất kháng khuẩn khác đối với vi sinh vật gây bệnh
Khi kết hợp 2 chất kháng khuẩn với nhau có thể xảy ra 4 tương tác: hiệp
đồng, cộng hợp, không khác biệt và đối kháng. Tác dụng hiệp đồng và cộng
hợp có tác dụng làm giảm nồng độ chất kháng khuẩn khi sử dụng kết hợp so
sánh với khi sử dụng riêng rẽ mà vẫn đạt cùng hiệu quả kháng khuẩn. TD
quả màng tang L. cubeba khi sử dụng kết hợp với TD quế C. cassia và dầu
giun C. ambrosioides có tác dụng hiệp đồng, tuy nhiên khi kết hợp với TD
tràm lá dài M. leucadendron có tác dụng không khác biệt so với khi sử dụng
riêng rẽ đối với V. parahaemolyticus và E. coli (Bảng 3.4).
Bảng 3.4: Giá trị FIC và tác dụng tương tác của TD quả màng tang L. cubeba và
tinh dầu khác (quế, dầu giun, tràm lá dài) đối với vi sinh vật
Chủng vi sinh vật
V. parahaemolyticus
ATCC 17802
E. coli ATCC 25922
Chất kháng
khuẩn
L. cubeba
C. cassia
L. cubeba
C. ambrosioides
L. cubeba
M. leucadendron
L. cubeba
C. cassia
L. cubeba
C. ambrosioides
L. cubeba
M. leucadendron
MIC (mg/mL)
Một
Kết
mình
hợp
5,53
0,69
2,21
0,55
5,53
0,69
12,34
1,54
5,53
5,53
11,28
2,82
5,53
0,69
5,54
0,69
5,53
0,69
6,17
0,77
5,53
2,77
11,28
11,28
FIC
0,13
0,25
0,13
0,13
1,00
0,25
0,13
0,13
0,13
0,13
0,50
1,00
Tổng
FIC
Tương
tác
0,38
Hiệp
đồng
0,25
Hiệp
đồng
1,25
0,25
0,25
1,50
Không
khác biệt
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Không
khác biệt
Khi tiến hành kiểm tra MIC của L. cubeba và oxytetracycline, nalidixic
axit với các chủng vi sinh vật kiểm định và phân lập từ thuỷ sản, xu hướng
trái ngược nhau được tìm thấy ở 2 chất kháng khuẩn. Trong khi cần nồng độ
lớn hơn để kháng các vi sinh vật phân lập đối với trường hợp của kháng sinh,
ngược lại, cần một lượng nhỏ hơn TD để ức chế sự phát triển của vi sinh vật
phân lập so sánh với các chủng kiểm định. Đa số tương tác hiệp đồng được
tìm thấy khi kết hợp TD và kháng sinh. Tương tác cộng hợp và không khác
biệt khi kháng lại Vibrio 2S4 và Vibrio 2N38 (Bảng 3.5).
8
Bảng 3.2: Kích thước vòng kháng khuẩn (mm) của 9 loại tinh dầu đối với 10 vi sinh vật kiểm định
Gram (-)
S. Typhimurium
E. coli
A. hydrophila
V. parahaemolyticus
V. alginolyticus
Gram (+)
B. subtilis
B. cereus
L. innocua
E. faecalis
S. aureus
O. g
M. l
C. c
Z. r
A. a
L. c
O. b
C. a
M. a
AK30
FOX30
15,3±1,2
18,0±0,0
25,3±1,5
25,7±1,2
25,3±2,1
13,0±1,0
15,3±4,5
31,0±1,0
21,3±2,3
17,3±2,1
28,7±0,6
30,0±5,3
37,7±2,5
54,7±4,2
39,7±3,5
R
12,7±1,5
19,3±2,3
23,3±3,1
10,7±3,1
10,3±1,2
12,0±0,0
16,0±2,6
11,3±0,6
R
9,0±1,0
19,0±1,0
29,7±0,6
37,0±2,6
32,0±2,0
R
11,0±1,0
14,3±0,6
9,7±0,6
14,7±2,3
14,7±0,6
24,7±5,5
43,3±1,2
29,3±1,2
28,7±1,5
10,7±0,6
14,7±3,5
25,0±1,0
21,7±0,6
29,3±1,2
23,0±0,0
22,0±0,0
27,7±0,6
22,7±2,1
19,7±1,5
24,0±1,0
25,3±2,5
17,0±0,0
23,7±1,5
19,0±0,0
22,0±2,0
20,0±1,0
20,3±0,6
12,7±0,6
23,3±2,1
18,0±3,6
21,7±1,5
17,3±3,1
14,0±1,0
21,3±3,1
33,7±0,6
55,3±2,3
57,3±3,1
28,0±0,0
41,0±4,6
16,0±4,4
15,3±1,2
11,3±0,6
11,3±2,1
16,7±4,6
12,0±1,0
16,7±0,6
16,3±0,6
10,3±2,1
8,0±1,0
50,3±1,2
90,0±0,0
40,3±2,5
28,7±1,2
44,3±3,2
32,0±9,8
15,0±1,0
13,3±1,2
9,3±1,2
14,7±3,5
20,7±5,0
17,0±1,0
11,7±1,5
12,7±1,5
25,7±2,1
23,3±5,7
24,0±1,0
12,3±1,5
22,0±5,3
25,7±2,5
32,0±0,0
29,3±1,2
24,0±1,0
10,3±1,2
26,0±0,0
33,3±2,1
18,0±1,0
16,0±1,0
R
31,7±1,5
Chú thích:
O. g: hương nhu Ocimum gratissimum, M. l: tràm lá dài Melaleuca leucadendron, C. c: quế Cinnamomum cassia, Z. r: sẻn hôi Zanthoxylum rhetsa, A. a: thanh
hao hoa vàng Artemisia annua, L. c: quả màng tang Litsea cubeba, O.b: húng quế Ocimum basilicum, C. a: dầu giun Chenopodium ambrosioides, M.a: bạc hà
Á Mentha arvensis
Đường kính vòng kháng khuẩn < 6 mm coi như không có khả năng kháng khuẩn. R (Resistance): không có tác dụng kháng khuẩn
Giá trị đường kính vòng kháng khuẩn là giá trị trung bình (mm) ±SD của 3 lần lặp. Đường kính đo được bao gồm cả đường kính của đĩa giấy (6 mm).
AK30: Amikacin 30 g, FOX30: Cefoxcitin 30 g được sử dụng làm kiểm chứng dương
9
Bảng 3.3: Giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC, mg/mL) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC, mg/mL), tỉ lệ MBC/MIC của
9 loại tinh dầu đối với một số vi khuẩn kiểm định
Tinh dầu
Ocimum
grastissimum
Melaleuca
leucadendron
Cinnamomum
cassia
Zanthoxylum
rhetsa
Artemisia
annua
Litsea cubeba
Ocimum
basilicum
Chenepodium
ambrosioides
Mentha
arvensis
MIC
MBC
MBC/MIC
MIC
MBC
MBC/MIC
MIC
MBC
MBC/MIC
MIC
MBC
MBC/MIC
MIC
MBC
MBC/MIC
MIC
MBC
MBC/MIC
MIC
MBC
MBC/MIC
MIC
MBC
MBC/MIC
MIC
MBC
MBC/MIC
S. Typhimurium
5,3±1,8
10,5±3,7
2,00
11,3±0
45,1±0
4,00
0,4±0
3,3±0
8,03
34,9±12,1
> 41,9±0
1,20
23,4±0
> 46,8±0
2,00
5,5±0
11,1±0
2,00
24,1±0
> 48,2±0
2,00
3,1±0
10,3±3,6
3,33
18,8±6,5
45,1±0
2,40
E. coli
5,3±1,8
10,5±3,7
2,00
11,3±0
> 45,1±0
4,00
1,1±0,5
5,5±1,9
5,01
21,0±0
> 41,9±0
2,00
23,4±0
> 46,8±0
2,00
5,5±0
11,05±0
2,00
20,0±7,0
> 48,2±0
2,40
6,2±0
12,3±0
2,00
5,6±0
15,0±6,5
2,67
A. hydrophila
8,4±3,7
25,3±0
3,00
11,3±0
> 45,1±0
4,00
0,7±0,2
2,8±1,0
4,01
21,±0
> 41,9±0
2,00
23,4±0
> 46,8±0
2,00
9,2±3,2
22,1±0
2,40
24,1±0
> 48,2±0
2,00
8,2±3,6
49,4±0
6,00
22,6±0
45,1±0
2,00
10
V. parahemolyticus
6,3±0
25,3±0
4,00
11,3±0
45,1±0
4,00
0,8±0
2,2±1,0
2,67
10,5±0
41,9±0
4,00
23,4±0
> 46,8±0
2,00
5,5±0
18,4±6,4
3,33
24,1±0
> 48,2±0
2,00
12,3±0
24,7±0
2,00
5,6±0
11,3±0
2,00
B. cereus
6,3±0
21,1±7,3
3,33
7,5±3,3
22,6±0
3,00
0,8±0
22,2±7,7
26,7
14,0±6,1
41,9±0
3,00
39,0±13,5
> 46,8±0
1,20
3,7±1,6
> 44,2±0
11,99
32,1±13,9
> 48,2±0
1,50
5,1±1,8
10,3±3,6
2,00
18,8±6,5
37,6±13,0
2,00
S. aureus
10,5±3,7
33,7±14,6
3,20
15,0±6,5
45,1±0
3,00
6,6±0
13,3±0
2,00
10,5±0
41,9±0
4,00
23,4±0
> 46,8±0
2,00
5,5±0
7,4±3,2
1,33
20,1±7,0
> 48,2±0
2,40
6,2±0
49,4±0
6,00
11,3±0
> 45,1±0
4,00
Bảng 3.5: Giá trị FIC và tác dụng tương tác của TD quả màng tang L. cubeba và
kháng sinh (oxytetracycline, nalidixic axit) đối với một vài vi sinh vật gây bệnh
Chủng vi sinh vật
V. parahaemolyticus
ATCC 17802
Vibrio 2S4
Vibrio 2N38
V. parahaemolyticus
ND201
V. parahaemolyticus
TB81
E. coli ATCC 25922
E. coli 9C48
E. coli 11C123
Chất kháng
khuẩn
L. cubeba
Nalidixic axit
L. cubeba
Oxytetracycline
L. cubeba
Nalidixic axit
L. cubeba
Oxytetracycline
L. cubeba
Nalidixic axit
L. cubeba
Oxytetracycline
L. cubeba
Nalidixic axit
L. cubeba
Oxytetracycline
L. cubeba
Nalidixic axit
L. cubeba
Oxytetracycline
L. cubeba
Nalidixic axit
L. cubeba
Oxytetracycline
L. cubeba
Nalidixic axit
L. cubeba
Oxytetracycline
L. cubeba
Nalidixic axit
L. cubeba
Oxytetracycline
MIC (mg/mL)
Một mình
Kết hợp
5,53
0,69
2,67. 10-3
0,27. 10-3
5,53
0,61
2,67. 10-3
0,45. 10-3
1,15
0,77
64,0. 10-3
32,0. 10-3
1,15
0,96
16,0. 10-3
8,0. 10-3
2,30
0,97
53,3. 10-3
26,7. 10-3
2,30
0,76
8,0. 10-3
4,0. 10-3
1,67
0,22
8,0. 10-3
1,4. 10-3
1,67
0,32
16,7. 10-3
4,2. 10-3
1,75
0,37
9,3. 10-3
1,6. 10-3
1,75
0,19
16,0. 10-3
3,4. 10-3
5,53
0,44
4,0. 10-3
1,0. 10-3
5,53
1,38
1,67. 10-3
0,25. 10-3
1,38
0,08
16,0. 10-3
1,3. 10-3
1,38
0,08
32,0. 10-3
2,6. 10-3
2,30
0,58
21,3. 10-3
5,3. 10-3
2,30
0,97
21,3. 10-3
10,7. 10-3
FIC
0,13
0,10
0,11
0,17
0,67
0,50
0,83
0,50
0,42
0,50
0,33
0,50
0,13
0,17
0,19
0,25
0,21
0,17
0,11
0,21
0,08
0,25
0,25
0,15
0,06
0,08
0,06
0,08
0,25
0,25
0,42
0,50
Tổng
FIC
0,23
0,28
1,17
1,33
0,92
0,83
0,30
0,44
0,38
0,32
0,33
0,40
0,14
0,14
0,50
0,92
Tương
tác
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Không
khác biệt
Không
khác biệt
Cộng
hợp
Cộng
hợp
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Hiệp
đồng
Cộng
hợp
Khi đánh giá hiệu quả tương tác khi kết hợp 2 chất kháng khuẩn, đa số tương
tác hiệp đồng được tìm thấy trong nghiên cứu của chúng tôi. Trong khi các kháng
sinh kiểm nghiệm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein
(oxytetracycline) hoặc ADN (nalidixic axit), thì TD quả màng tang L. cubeba
ảnh hưởng đến màng tế bào vi khuẩn, vì vậy tương tác hiệp đồng có thể do tác
động đa mục tiêu của các chất kháng khuẩn đến tế bào. TD quả màng tang L.
cubeba làm hư hại màng tế bào, làm cho kháng sinh dễ dàng xâm nhập vào bên
trong tế bào và ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein và ADN của E.
coli (Li, 2014; Chopra, 2001; Deitz, 1996). Kết quả nghiên cứu chứng minh tiềm
năng ứng dụng của TD quả màng tang L. cubeba trong việc giảm thiểu và thay
thế kháng sinh trong thủy sản.
11
3.2.2. Sự đa dạng về thành phần hóa học của tinh dầu lá màng tang L.
cubeba
Thành phần hoá học ảnh hưởng rất lớn đến khả năng kháng khuẩn cũng như
cơ chế kháng khuẩn của TD. Thành phần hoá học của TD phụ thuộc vào nhiều
yếu tố như: thời điểm thu hái, thời gian thu hái, địa điểm thu hái, tuổi của cây,
độ chín của mẫu. Chúng tôi đã thu nhận 25 mẫu lá cây màng tang tại 7 tỉnh phía
Bắc Việt Nam bao gồm: Hà Giang, Yên Bái, Tam Đảo, Thái Nguyên, Phú Thọ,
Lào Cai, Ba Vì (Bảng 3.6). 1,8-cineole và linalool là hai nhóm thành phần chính
được tìm thấy trong 25 TD lá màng tang (Bảng 3.7).
Bảng 3.6: Danh sách mẫu lá cây màng tang L. cubeba
Nơi thu
mẫu
Hà Giang
Yên Bái
Tam Đảo
Thái
Nguyên
Phú Thọ
Lào Cai
Ba Vì
Mã số
HG 01
HG 11
YB 03
YB 04
YB 05
YB 07
YB 09
YB 10
YB 12
YB 16
TD 18
TD 21
TD 26
TN 08
PT 13
PT 15
PT 20
PT 22
PT 23
LC 17
LC 19
LC 24
BV 06
BV 25
BV 27
Thời
gian thu
mẫu
GPS
02/2015
22°48
N105°1' E
11/2014
21°43'
N104°54' E
08/2014
08/2014
10/2014
21°25' N
105°34' E
02/2015
21°41' N
105°30' E
01/2015
21°24' N
105°4' E
10/2014
22°18' N
104°10' E
11/2014
21°5' N
105°23' E
Hàm lượng
TD % (v/w)
0,500
0,600
0,100
0,010
0,013
0,013
0,200
0,300
0,300
0,300
0,700
0,300
0,050
0,008
0,250
0,100
0,150
0,200
0,150
0,800
1,500
0,040
0,025
0,700
0,700
Độ cao so với
mực nước biển
(m)
1064
274
914
140
28
1140
336
TD lá màng tang thu tại Tam Đảo, Ba Vì, Phú Thọ có thành phần hoá học
chính là linalool (>90%), trong khi đó TD thu tại Hà Giang, Yên Bái, Lào Cai
có thành phần hoá học chính là 1,8-cineole (khoảng 50%), sabinene (15%) và
-terpineol (9-14%). TD lá màng tang thu tại Thái Nguyên chứa chủ yếu linalool
(50%) và 1,8-cineole (14%) (Bảng 3.7).
12
Bảng 3.7: Thành phần hoá học của tinh dầu lá màng tang L. cubeba
Nhóm/hợp chất
RI
(Exp)
Monoterpene hydrocarbons
α-pinene
1022
camphene
1067
β-pinene
1112
sabinene
1118
3-carene
1158
myrcene
1184
α-terpinene
1186
D-limonene
1199
β-phellandrene
1207
cis-β-ocimene
1231
γ-terpinene
1237
trans-β-ocimene
1244
m-cymene
1257
α-terpinolen
1269
Oxy monoterpenes
1,8-cineole
1215
cis-sabinene hydrate 1470
linalool
1557
terpinen-4-ol
1601
β-cyclocitral
1607
β-terpineol
1638
terpenes unknown
1681
neral
1683
α-terpineol
1708
geranial
1736
citronellol
1780
isogeraniol
1810
RI
(Lit)
Hà Giang
(%, n=2)
Yên Bái
(%, n=8)
Lào Cai
(%, n=3)
1027
1075
1113
1123
1148
1176
1178
1201
1209
1234
1238
1242
1267
1275
5,38±0,19
0,14±0,00
4,45±0,07
15,38±0,08
5,60±0,04
0,14±0,02
4,54±0,06
15,13±0,38
0,68
0,08
0,76
2,34
0,09±0,01
0,16±0,00
4,81±0,73
0,12±0,05
4,02±0,40
14,29±0,97
0,04±0,11
1,55±0,18
0,45±0,19
1,85±0,51
0,89±0,44
0,22±0,19
0,79±0,33
0,10±0,06
0,59±0,96
0,26±0,13
1,72±0,04
0,71±0,12
1,57±0,34
0,44±0,76
0,06±0,10
1,18±0,16
0,05±0,09
0,15±0,02
0,31±0,04
0,34
0,18
1,41
0,25
0,48
0,43
0,17
0,18
0,15
1213
1465
1551
1593
1598
1646
48,09±1,61
0,39±0,09
2,02±1,52
1,48±0,00
48,00±4,96
0,27±0,13
2,10±2,40
2,28±0,29
49,58±2,38
0,21±0,10
0,30±0,04
2,50±0,23
13,69
1,11±0,03
0,05±0,05
0,84±0,37
0,11±0,01
1,09±0,02
9,65±4,12
0,03±0,05
13,71±0,47
1690
1711
1744
1786
1812
1,50±0,02
0,37±0,01
3,70±0,03
1,16±0,01
0,70±0,03
13,35±0,40
0,05±0,08
13
Thái Nguyên
(%, n=1)
50,08
1,50
0,13
Phú Thọ
(%, n=5)
Ba Vì
(%, n=3)
Tam Đảo
(%, n= 3)
0,12±0,08
0,03±0,05
0,12±0,07
0,02±0,04
0,02±0,05
0,58±1,29
0,19±0,04
0,25±0,02
0,16±0,05
0,37±0,09
0,14±0,01
0,09±0,01
0,07±0,06
0,13±0,01
1,52±1,00
1,41±0,36
2,52±0,48
0,17±0,12
0,16±0,06
0,32±0,03
0,02±0,05
0,08±0,07
1,72±0,89
94,93±2,41
93,98±1,43
0,36±0,00
0,04±0,08
91,97±1,06
0,62±0,32
0,40±0,03
0,24±0,54
0,70
5,74
0,42
0,21
0,37
0,03±0,06
0,54±0,31
0,03±0,06
0,04±0,08
geraniol
Sesquiterpenes
β-elemen
isocaryophyllene
aromandendrene
α-caryophyllene
γ -selinene
γ-muurolene
β-selinene
germacrene D
α-gurjunene
Oxy sesquiterpenes
sesquiterpenes
inconnus
caryophyllene oxide
humulene oxide
nerolidol
juniper camphor
Các hợp chất khác
ethanol
6-methyl-5-heptene2-one
2-hexenal, (E)1-hexanol
3-hexen-1-ol
(E)-2-hexen-1-ol
terpenes unknown
terpinyl acetate
1859
1862
1569
1578
1593
1652
1661
1687
1694
1719
1745
1570
1570
1600
1663
1682
1681
1711
1722
1760
1950
1957
2008
2030
2198
0,01±0,04
0,10±0,02
0,42±0,09
0,17±0,04
1,30±1,62
0,47
0,14±0,02
0,68±0,11
0,04±0,13
0,06±0,11
0,04±0,12
0,42
10,37
0,17
1,05
0,60
0,33
0,41
0,17
1,05
1962
0,03±0,08
0,08
1962
2015
2054
2205
0,15±0,42
0,03±0,07
0,02±0,05
0,30±0,68
1,10
0,12
0,18
2,51
936
929
0,01±0,02
1328
1319
1220
1355
1382
1407
1644
1686
1209
1354
1386
1400
1700
0,09±0,23
0,06±0,18
0,03±0,05
0,07
0,09
0,41
0,09
0,07±0,08
0,07±0,07
0,28±0,52
4,09±7,57
14
0,08±0,18
1,27±0,94
0,10±0,09
0,85±0,34
2,46±0,09
0,04±0,08
0,17±0,02
0,03±0,06
0,32±0,16
0,06±0,10
0,08±0,11
0,05±0,09
0,29±0,07
0,04±0,05
0,14±0,12
0,03±0,05
0,06±0,10
0,15±0,26
0,02±0,04
0,08±0,07
0,07±0,12
0,05±0,07
0,16±0,19
0,05±0,09
3.2.3. Sự đa dạng về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá màng tang L.
cubeba
Dựa trên giá trị MIC và MBC, khả năng kháng khuẩn của TD nhóm
linalool tốt hơn so với TD nhóm 1,8-cineole (Bảng 3.8). Linalool
(monoterpene alcohol) được chứng minh có khả năng kháng khuẩn tốt hơn
1,8-cineole (monoterpene oxide). Thêm vào đó, TD có khả năng kháng
khuẩn tốt hơn so với hợp chất hoá học tương ứng của TD đó. Chứng minh
rằng có tương tác hiệp đồng giữa các thành phần hoá học khác có mặt trong
TD. Các TD đều có tác dụng diệt khuẩn (MBC/MIC <4) đối với các chủng
vi khuẩn kiểm nghiệm.
3.3. Cơ chế kháng khuẩn của TD lá màng tang L. cubeba đối với E. coli
Vi khuẩn E. coli được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu cơ chế kháng
khuẩn của TD lá màng tang L. cubeba do đây là vi khuẩn mô hình có đầy đủ
các dữ liệu về kích thước, hình thái, hệ gen …
3.3.1. Ảnh hưởng của TD lá màng tang L. cubeba (LC19 và BV27) đến sự
sống sót của E. coli
Ảnh hưởng của các nồng độ khác nhau của TD L. cubeba LC19 và BV27
đến sự sống sót của E. coli theo thời gian được giới thiệu trong Hình 3.1,
Hình 3.2. TD BV27 có tác dụng diệt khuẩn mạnh hơn so với LC19. Toàn bộ
E. coli bị tiêu diệt sau khi xử lý với TD BV27 và LC19 sau 1h và 4h xử lý ở
nồng độ 2 MIC, chứng minh khả năng kháng khuẩn mạnh của TD.
10
10
9
8
Bacterial concentration (Log10 CFU/mL)
Bacterial concentration (log10 CFU/mL)
9
Control
7
0.5 MIC
1 MIC
6
2 MIC
5
4
3
2
8
Control
7
0.5 MIC
6
1 MIC
5
2 MIC
4
3
2
1
1
0
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Time (hours)
16
18
20
22
0
24
Hình 3.1: Ảnh hưởng của TD lá màng
tang L. cubeba LC19 (nhóm 1,8-cineole)
đến khả năng sống sót của E. coli
2
4
6
8
10
12
14
Time (hours)
16
18
20
22
24
Hình 3.2: Ảnh hưởng của TD lá màng tang L.
cubeba BV27 (nhóm linalool) đến khả năng
sống sót của E. coli
15
Bảng 3.8: Khả năng kháng khuẩn của TD lá màng tang L. cubeba, 1,8-cineole và linalool đối với một số chủng vi sinh vật
A.
hydrophila
MIC MBC
1,8-cineole – type
HG01
3,1c
6,1c
YB12
6,2d
6,2c
LC17
3,0c
3,0b
LC19
2,9c
2,9b
Linalool – type
TD18
0,8ab
0,8a
ab
TD21
0,7
0,7a
PT13
0,7ab
0,7a
a
BV27
0,3
0,3a
1,8-cineole
2,9c
5,8c
Linalool
1,4b
1,4ab
Tinh dầu
B. subtilis
MIC
MBC
MIC
MBC
V.
parahaemolyticus
MIC
MBC
E. coli
MBC
MIC
S. Typhimurium
V. furnissii
E. tarda
S. garvieae
MIC
MBC
MIC
MBC
MIC
MBC
3,1abc
6,2e
6,1e
2,9ab
12,2b
12,3b
12,1b
11,4b
6,1d
3,1c
3,0c
2,8abc
6,1c
3,1b
3,0b
5,7c
3,1a
6,2b
6,1b
2,9a
24,4d
24,6d
12,1c
22,9d
6,1b
12,3c
12,1c
5,7ab
24,4c
24,6c
24,2c
45,7d
3,1c
6,2d
6,1d
2,9c
6,1b
12,3c
12,1c
11,4c
3,1c
3,1c
1,5b
5,7d
3,1c
3,1c
3,0c
5,7d
6,1b
6,2b
3,0a
5,7b
>48,8d
>49,3d
>48,5d
>45,7d
3,1abc
2,9ab
2,9ab
2,7a
23,0f
5,4d
6,1a
5,7a
5,8a
5,4a
46,1c
5,4a
1,5ab
2,9bc
0,7a
2,7abc
11,5e
5,4d
1,5a
2,9b
1,4a
2,7b
11,5d
5,4c
3,1a
5,8b
2,9a
5,4b
23,0c
5,4b
12,3c
11,5bc
5,8ab
5,4a
23,0d
5,4a
3,1ab
2,8ab
1,4a
2,7ab
46,1d
5,4ab
6,1a
5,7a
5,8a
21,8c
>46,1d
10,9b
0,8a
0,7a
0,7a
1,4b
11,5e
5,4d
3,1a
2,9a
2,9a
2,7a
11.5c
5,4ab
1,5b
0,7a
0,7a
0,7a
1,4b
1,4b
1,5b
0,7a
1,4b
0,7a
1,4b
1,4b
3,1a
5,7b
2,9a
2,7a
5,8b
2,7a
6,1c
5,7bc
5,8bc
5,4b
>46,1d
2,7a
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của TD lá màng tang L. cubeba LC19 và BV27 đến tỉ lệ sống, kích thước, màng tế bào và ADN của
E. coli
Tế bào bất thưởng (%)
Mẫu xử lý
Kiểm chứng
LC19
(1,8-cineole – type)
BV27
(linalool – type)
0.5 MIC
1 MIC
2 MIC
0.5 MIC
1 MIC
2 MIC
PI
DAPI
FM4-64
1,37 ± 0,42a
34,57 ± 3,33b
56,12 ± 8,50c
97,52 ± 2,38d
99,23 ± 0,26d
100 ± 0,0d
100 ± 0,0d
1,48 ± 0,14a
32,95 ± 1,03b
45,53 ± 3,75c
81,80 ± 2,63d
43,55 ± 2,02c
98,10 ± 0,58e
97,94 ± 1,44e
1,12 ± 0,13a
10,24 ± 0,73b
16,59 ± 2,14c
22,91 ± 2,06d
29,99 ± 2,88e
94,05 ± 8,22f
97,82 ± 0,19f
16
Giảm sự sống
sót (%)
Tế bào phân
sợi (%)
Chiều dài
(m)
Chiều rộng
(m)
Dài/rộng
26,79
34,65
80,57
38,28
100
100
<0.001a
1,070c
1,431d
0,138ab
0,305b
0,035a
0,000a
2,00 ± 0,09c
2,92 ± 0,07a
3,02 ± 0,18a
3,04± 0,04a
2,39 ± 0,05b
2,46 ± 0,05b
2,50 ± 0,04b
0,66 ± 0,03d
1,00 ± 0,01b
1,03 ± 0,05b
1,01 ± 0,05b
0,87 ± 0,02c
1,15 ± 0,01a
1,17 ± 0,01a
3,02 ± 0,25a
2,93 ± 0,03a
2,95 ± 0,06a
3,01 ± 0,11a
2,72 ± 0,03b
2,16 ± 0,03c
2,14 ± 0,01c
3.3.2. Ảnh hưởng của TD lá màng tang L. cubeba (LC19 và BV27) đến
màng tế bào E. coli
Ảnh hưởng của TD LC19 và BV27 đến tính thấm màng tế bào được giới
thiệu trong Hình 3.3. Khi tăng nồng độ TD, số lượng tế bào nguyên vẹn (màu
xanh) giảm và số lượng tế bào bị tổn thương màng tế bào (màu đỏ) tăng. Tuy
nhiên, ảnh hưởng của TD LC19 và BV27 đến sự nguyên vẹn của màng tế
bào E. coli là khác nhau (Hình 3.3). Lượng tế bào màu đỏ tỉ lệ thuận với
lượng vi khuẩn chết sau 2h ngoại trừ trường hợp LC19 ở 0,5 và 1 MIC.
LC19 (1,8-cineole-type)
BV27 (linalool-type)
Control
0.5 MIC
1 MIC
2 MIC
Tế bào tổn thương màng (%)
Tỉ lệ tế bào màu đỏ (%)
100
100
80
60
40
20
0
Control
0.5 MIC
1 MIC
80
60
40
20
0
LC 19 (1,8-cineole type)
2 MIC
Hình 3.3: Ảnh hưởng của 2 tinh dầu lá
màng tang L. cubeba LC19 (type 1,8cineole) và BV27 (type linalool) đến tính
thấm màng tế bào của E. coli bằng
LIVE/DEAD Baclight kit
e
4,00
3,50
b
cd
3,00
2,50
Hình 3.4: Ảnh hưởng của 2 tinh dầu lá màng
tang L. cubeba LC19 (type 1,8-cineole) và
BV27 (type linalool) đến màng tế bào của E.
coli bằng kit nhuộm màu huỳnh quang FM 464 sau 2h xử lý
LC19-Red cells
LC19-Green cells
BV27-Red cells
BV27-Green cells
b
b b
cd
c d
Control
d
a a
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
Control
0.5 MIC
1 MIC
1 MIC
2 MIC
80
60
40
20
0
LC 19 (1,8-cineole type)
2 MIC
Mẫu xử lý
Hình 3.6: Ảnh hưởng của 2 tinh dầu lá
màng tang L. cubeba LC19 (type 1,8cineole) và BV27 (type linalool) đến chiều
dài vi khuẩn E. coli màu xanh (sống sót) và
màu đỏ (chết) sau 2h xử lý.
0.5 MIC
100
Tế bào tổn thương ADN (%)
Chiều dài trung bình (µm)
4,50
BV27 (linalool-type)
Mẫu xử lý
Mẫu xử lý
BV27 (linalool-type)
Mẫu xử lý
Hình 3.7: Ảnh hưởng của 2 tinh dầu lá màng
tang L. cubeba LC19 (type 1,8-cineole) và
BV27 (type linalool) đến ADN của E. coli bằng
kit nhuộm màu huỳnh quang DAPI sau 2h xử lý
17
LC19 và BV27 có cơ chế tác động khác nhau đến E. coli, BV27 có ảnh
hưởng lớn hơn LC19 đến sự nguyên vẹn màng tế bào E. coli (Hình 3.4). Tế
bào xử lý với LC19 có sự khuếch tán không đồng đều hoặc sự biến mất của
chất nhuộm huỳnh quang (FM4-64) trên màng tế bào (Hình 3.4, Hình 3.5).
Đối với BV27, 5, 94 và 95% tế bào xử lý ở 0,5; 1 và 2 MIC BV27 có sự
ngưng tụ và thẩm thấu của FM4-64 vào bên trong tế bào và đặc biệt sự thay
đổi hình dạng tế bào (lên đến 2% ở 2 MIC) được quan sát thấy ở các mẫu xử
lý TD. Kết quả thu được chứng minh sự nguyên vẹn của màng tế bào bị ảnh
hưởng khi xử lý với LC19 và BV27. Trong khi chỉ có một phần nhỏ tế bào
xử lý với LC19 bị ảnh hưởng đến màng tế bào thì phần lớn tế bào xử lý với
BV27 bị ảnh hưởng đến màng.
A
B
Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm huỳnh
quang FM4-64 của màng tế bào E.
coli sau 2h xử lý với tinh dầu màng
tang L. cubeba ở nồng độ khác
nhau. Thanh tỉ lệ 2m
C
D
E
F
A) Mẫu kiểm chứng; (B) Thay đổi hình
dạng tế bào (0,39; 0,78 và 2,11% ở 0,5 ;
1 và 2 MIC BV27); (C) Tế bào thấm-Cell
permeabilization (5,7; 94,0 và 95,5% ở
0.5 ; 1 và 2 MIC BV27), tỉ lệ này ở mẫu
kiểm chứng là 0,13%;(D) Ngưng tụ FM464 trên màng tế bào (22,3; 0 and 0% ở
0,5; 1 và 2 MIC BV27); (E) Phân bố
FM4-64 không đều trên màng tế bào (8,0;
10,9 và 10,3% ở 0,5; 1 và 2 MIC LC19);
(F) tổn thương màng tế bào (1,04; 4,07 và
11,82% ở 0,5; 1 và 2 MIC LC19).
3.3.3. Ảnh hưởng của TD lá màng tang L. cubeba (LC19 và BV27) đến
kích thước tế bào E. coli
Chiều dài của E. coli sau khi xử lý 2h với TD LC19 và BV27 tăng lên so
với mẫu kiểm chứng (2,00 µm) (Hình 3.6, Bảng 3.9). Khi xử lý với LC19
và BV27, chiều dài vi khuẩn tương ứng tăng lên khoảng 50% và 25% so với
mẫu kiểm chứng. Một tỉ lệ nhỏ (<1,0%) tế bào phân sợi (chiều dài >6 µm)
được quan sát thấy ở mẫu xử lý TD (Bảng 3.9). Đáng chú ý, tỉ lệ tế bào phân
sợi khi xử lý với LC19 ở 1 và 2 MIC cao hơn lần lượt là 40 và 15 lần so với
khi xử lý với BV27, đồng thời tỉ lệ tế bào phân sợi cũng giảm đi khi tăng
nồng độ BV27. Chiều rộng của tế bào cũng tăng lên ở mẫu có xử lý TD. Tỉ
lệ chiều dài/chiều rộng tế bào không tăng đối với tế bào xử lý với LC19,
nhưng tăng lên khi xử lý với BV27 (Bảng 3.9). Điều này cho phép dự đoán
sự ảnh hưởng khác nhau của LC19 và BV27 đến chu trình tế bào.
18
- Xem thêm -
.PDF 
27 
272 
88 
