Tài liệu “nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (carica papaya linn)

  • Số trang: 147 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 662 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO hiên cứu sinh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hồ Thị Hà Hồ Thị Hà NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya Linn) LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hồ Thị Hà NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT TÁCH TỪ LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya Linn) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Đỗ Thị Hoa Viên 2. TS. Lê Quang Hòa Hà Nội – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Những số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố. Hà Nội, ngày tháng Hồ Thị Hà i năm 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều thầy, cô giáo và tập thể nghiên cứu khoa học. Tôi xin bày tỏ lòng cảm tạ và đội ơn sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Thị Hoa Viên và TS. Lê Quang Hòa – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, là những người đã tận tình hướng dẫn, định hướng, đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN đã giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - ĐHBKHN đã giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trau dồi kiến thức chuyên môn và cuộc sống. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Văn Cường, TS. Đoàn Thị Mai Hương, ThS. Nguyễn Thùy Linh phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa Sinh Biển, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn tôi quy trình công nghệ tách chiết các chất trong lá đu đủ. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong khoa công nghệ Lương thực thực phẩn, lãnh đạo trường Cao đẳng Công nghệ và Kinh tế Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ về thời gian và vật chất để tôi hoàn thành Luận án này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn tới gia đình, bạn bè đã thực sự động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Nghiên cứu sinh Hồ Thị Hà ii MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................................ iii  DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ........................................................................... vi  DANH MỤC CÁC BẢNG, SƠ ĐỒ .................................................................................. iviii  DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................... ix  ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................................... 1  CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................................. 4  1.1. Giới thiệu về cây đu đủ ............................................................................................... 4  1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................................... 6  1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ ................................................ 6  1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ .................................................. 6  1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................................. 7  1.3.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ ................................................ 7  1.3.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ ................................................ 10  1.4. Sơ lược về nhóm alkaloid ......................................................................................... 22  1.4.1. Phân bố trong thiên nhiên ............................................................................... 22  1.4.2. Cấu tạo hóa học và phân loại alkaloid ............................................................ 23  1.4.3. Tính chất chung của alkaloid ........................................................................... 24  1.4.4. Các alkaloid có trong lá đu đủ.......................................................................... 25  1.5. Quá trình caspase ..................................................................................................... 27  1.5.1. Khái niệm caspase ............................................................................................ 27  1.5.2. Phân loại caspase.............................................................................................. 27  1.5.3. Cơ chế của quá trình caspase ........................................................................... 28  1.6. Kích thích miễn dịch................................................................................................. 30  1.6.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch .......................................................... 30  1.6.2. Cơ chế chống ung thư của hệ miễn dịch ......................................................... 32  CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................... 33  2.1. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................................... 33  2.1.1. Các thiết bị dùng cho nghiên cứu hóa học ....................................................... 33  2.1.2. Các thiết bị dùng cho nghiên cứu sinh học ...................................................... 33  2.2. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................... 33  2.2.1. Mẫu thực vật..................................................................................................... 33  iii 2.2.2. Hóa chất và các vật liệu khác ........................................................................... 33  2.3. Các phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hợp chất ....................................... 34  2.3.1. Phương pháp chiết ............................................................................................ 34  2.3.2. Sắc ký cột ........................................................................................................ 34  2.3.3. Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 35  2.3.4. Phổ hồng ngoại ................................................................................................ 35  2.3.5. Phổ khối lượng ................................................................................................ 35  2.3.6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân............................................................................. 36  2.4. Các phương pháp thử hoạt tính sinh học .................................................................. 36  2.4.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro............................................................... 36  2.4.2. Phương pháp thử độ độc tế bào (cytotoxic assay)............................................ 36  2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase 3/7 ..................................... 38  2.4.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng cách loại bỏ gốc tự do DPPH ......................................................................................................................... 39  2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test) ................................................................................. 40  2.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro trên tế bào gan chuột .................................................................................................................................... 41  2.4.7. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm ......................................... 42  2.4.8. Phương pháp thử hoạt tính kích thích miễn dịch ............................................. 43  CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 45  3.1. Phân lập một số hợp chất có trong lá đu đủ .............................................................. 45  3.1.1. Chiết phân đoạn cặn chiết trong lá đu đủ ......................................................... 45  3.1.2. Chiết tách thu cặn chiết ở phân đoạn CH2Cl2 .................................................. 47  3.1.3. Phân lập cặn chiết phân đoạn CH2Cl2 .............................................................. 48  3.1.4. Phân lập các hợp chất từ một số phân đoạn của cặn chiết CH2Cl2 .................. 49  3.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã được phân lập .............................................. 52  3.2.1. Hợp chất CP1 ................................................................................................... 52  3.2.2. Hợp chất CP2 ................................................................................................... 55  3.2.3. Hợp chất CP3 ................................................................................................... 60  3.2.4. Hợp chất CP4 ................................................................................................... 61  3.2.5. Hợp chất CP5 ................................................................................................... 65  3.2.6. Hợp chất CP6 ................................................................................................... 68  iv 3.3. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết ................. 71  3.3.1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết ........ 71  3.3.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn từ cặn chiết CH2Cl2 ........................................................................................................ 75  3.4. Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............... 77  3.4.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ .................................................................................................... 77  3.4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ .................................................................................................... 79  3.4.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi LU-1 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............................................................................................................. 82  3.4.4. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............................................................................................................. 83  3.4.5. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào thường NIH 3T3 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............................................................................................................. 85  3.5. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và pseudocarpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1 ................................................................. 89  3.5.1. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1 ............................................................................................... 90  3.5.2. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất pseudocarpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1 ..................................................................................... 91  3.6. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............... 93  3.6.1. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............................................................................... 93  3.6.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm MDA của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............................................................................................................. 94  3.6.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan chuột của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ................................................................................................................... 95  3.7. Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ.. 96  3.8. Đánh giá khả năng kích thích tế bào lympho của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ98  KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 101  TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 103  DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ......................................................... 113  v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribo nucleic ATCC American Type Culture Collection br Broad BuOH Buthanol CASP Caspase CC Column Chromatography CH2Cl2 Diclorometan 13 Carbon - 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy C-NMR d Doublet dd doublet doublet DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ED50 Effetive Dose ESI-MS Electron Spray Ionization – Mass Spectroscopy EtOAc Ethyl acetate EtOH Ethanol FBS Fetal bovine serum HL-60 Human acute promyelocytic leukemia HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation 1 Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy H-NMR HPLC High Performance Liquid Chromatography HR-ESI-MS High Resolution Electron Spray Ionization – Mass Spectroscopy HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IC50 Inhibitory concentration 50% IR Infrared Spectroscopy J (Hz) Spin-spin J(Hz) KB Human epidermic carcinoma in the mouth LU-1 Human lung carcinoma m Multiplet vi MBC Minimum bactericidal concentration MCF-7 Human breast carcinoma MDA Malonyl dialdehyd MEME Minineal Essential Medium with Eagle’s Salt MeOH Methanol MIC Minimum inhibitory concentration MHA Mueller Hinton Agar MHB Mueller Hinton Broth mp Melting point NIH3T3 Mouse embryonic fibroblast NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy OD Optical density PBS Phosphate Buffer Saline PSF Penicillin - Streptomicin - Fungizone RFU Fluorescence RIPs Ribosome inactivating protein s Singlet SI Stimulate index SRB Sulforhodamine B t Triplet TAC Acid trichloracetic TBA Acid Thiobarbituric TLC Thin Layer Chromatography TSB Tryptic Soy Broth δ (ppm) δ (ppm = part per million) vii DANH MỤC CÁC BẢNG,SƠ ĐỒ Bảng 1.1: Tác dụng của chất chiết từ đu đủ lên các dòng tế bào ung thư khác nhau .......... 13  Bảng 1.2: Hoạt tính chống ung thư của glucosinolate, phenolic và carotenoid trong đu đủ ............................................................................................................................................. 14  Bảng 1.3: Tính chất hoá học của carpaine và dẫn xuất của carpaine trong lá đu đủ Carica papaya ................................................................................................................................. 26  Bảng 3.1: Kết quả chiết phân đoạn cặn chiết trong lá đu đủ ............................................... 45  Bảng 3.2: Khối lượng các phân đoạn từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ ............................. 48  Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR của hợp chất CP1 và chất tham khảo ..................................... 54  Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của hợp chất CP4 và chất tham khảo ..................................... 64  Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ......................................................................................................................................... 96  Bảng 3.6: Kết quả kích thích tế bào lympho của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ........... 98  Sơ đồ 3.1: Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá đu đủ ......................................................... 46  Sơ đồ 3.2: Sơ đồ chiết thu cặn CH2Cl2 từ lá đu đủ .............................................................. 47  Sơ đồ 3.3: Phân lập các hợp chất từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ .................................... 51  viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cây và lá đu đủ ...................................................................................................... 5  Hình 1.2: β- sitosterol  Hình 1.3: Daucosterol ................................................................. 6  Hình 1.4: Sterculin A,  Hình 1.5: Cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol ............................... 6  Hình 1.6: Carpaine,   Hình 1.7: Pseudocarpaine ............................................................. 8  Hình 1.8: Dehydrocarpaine I,   Hình 1.9: Dehydrocarpaine II ............................................ 8  Hình 1.10: Prunasin   Hình 1.11: Sambunigrin................................................................ 8  Hình 1.12: 5,7 - dimethoxycoumair Hình 1.13: Axit protocatechuic Hình 1.14: Axit chlorogenic ............................................................................................................................ 9  Hình 1.15: Axit malic  Hình 1.16: Axit quinic ............................................................... 9  Hình 1.17: Nicotiflorin  Hình 1.18: Rutin ...................................................................... 10  Hình 1.19: Caffeoyl malate, Hình 1.20: ρ-coumaroyl malate, Hình 1.21: Feruloyl malate 10  Hình 1.22: Benzyl isothiocyanate  Hình 1.23: Benzyl glucosinolate ................................ 14  Hình 1.24: Quá trình hoạt hóa tiền caspase xúc tác bởi các caspase đã hoạt hóa .............. 28  Hình 1.25: Quá trình hoạt hóa caspase hành quyết và qua đó khuếch đại mức độ caspase hoạt hóa trong tế bào ........................................................................................................... 28  Hình 2.1. Sơ đồ biểu diễn phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa ..... 39  Hình 2.2: Tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ DPPH.................................................. 40  Hình 2.3: Phản ứng tạo phức màu giữa MDA và axit thiobarbituric ................................. 41  Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP1 .......................................................................... 53  Hình 3.2: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP1 ......................................................................... 53  Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất danielone ............................................................ 54  Hình 3.4: Phổ HR-ESI-MS (+) của hợp chất CP2 ............................................................... 55  Hình 3.5: Phổ positive [M + Na] của hợp chất CP2 ............................................................ 56  Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP2 ......................................................................... 56  Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP2 .......................................................................... 57  Hình 3.8: Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của CP2 .............................. 57  Hình 3.9: Phổ COSY của hợp chất CP2 .............................................................................. 58  Hình 3.10: Phổ HMBC của hợp chất CP2 ........................................................................... 58  Hình 3.11: Phổ HSQC của hợp chất CP2 ............................................................................ 59  Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất carpainone ........................................................ 59  Hình 3.13: Phổ ESI-MS negative của hợp chất CP3 ........................................................... 60  Hình 3.14: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP3 ........................................................................ 61  Hình 3.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất axit pluchoic ..................................................... 61  ix Hình 3.16: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP4 ....................................................................... 62  Hình 3.17: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP4 ........................................................................ 63  Hình 3.18: Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của chất CP4 .................... 63  Hình 3.19: Cấu trúc hóa học của hợp chất apocynol A ....................................................... 64  Hình 3.20: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP5 ....................................................................... 65  Hình 3.21: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP5 ........................................................................ 66  Hình 3.22: Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của hợp chất CP5 ............. 66  Hình 3.23: Phổ DEPT của hợp chất CP5............................................................................. 67  Hình 3.24: Cấu trúc hóa học của hợp chất carpaine ............................................................ 67  Hình 3.25: Phổ 13C-NMR của hợp chất CP6 ....................................................................... 69  Hình 3.26: Phổ 1H-NMR của hợp chất CP6 ........................................................................ 69  Hình 3.27: Phổ DEPT của hợp chất CP6............................................................................. 70  Hình 3.28: Cấu trúc hóa học của hợp chất pseudocarpaine................................................. 70  Hình 3.29: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn cặn chiết từ lá đu đủ .................................................................................................................................... 71  Hình 3.30: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi LU-1 của các phân đoạn cặn chiết từ lá đu đủ .................................................................................................................................... 72  Hình 3.31: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các phân đoạn cặn chiết từ lá đu đủ .................................................................................................................................... 73  Hình 3.32: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết ...... 74  Hình 3.33: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân đoạn từ cặn chiết CH2Cl2 của lá đu đủ ............................................................................................................. 76  Hình 3.34: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ .................................................................................................................................... 78  Hình 3.35: Tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mô KB của hợp chất carpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml .............................................................................................................. 79  Hình 3.36: Tác dụng ức chế tế bào ung thư biểu mô KB của hợp chất pseudocarpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 79  Hình 3.37: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu HL-60 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ......................................................................................................................................... 80  Hình 3.38: Tác dụng ức chế tế bào ung thư máu HL-60 của hợp chất carpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml .............................................................................................................. 81  Hình 3.39: Tác dụng ức chế tế bào ung thư máu HL-60 của hợp chất pseudocarpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 81  Hình 3.40: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi LU-1 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ......................................................................................................................................... 82  Hình 3.41: Tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 của hợp chất carpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ................................................................................................................... 83  x Hình 3.42: Tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 của hợp chất pseudocarpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 83  Hình 3.43: Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MCF-7 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ......................................................................................................................................... 84  Hình 3.44: Tác dụng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 của hợp chất carpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ................................................................................................................... 85  Hình 3.45: Tác dụng ức chế tế bào ung thư vú MCF-7 của hợp chất pseudocarpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 85  Hình 3.46: Hoạt tính gây độc tế bào thường NIH 3T3 của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ ............................................................................................................................................. 86  Hình 3.47: Tác dụng ức chế tế bào thường NIH 3T3 của hợp chất carpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ................................................................................................................... 87  Hình 3.48: Tác dụng ức chế tế bào thường NIH 3T3 của hợp chất pseudocarpaine ở các nồng độ 20; 4; 0,8 µg/ml ..................................................................................................... 87  Hình 3.49: Tổng hợp kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ .................................................................................................................................... 88  Hình 3.50: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên tế bào.......... 90  Hình 3.51: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất pseudocarpaine lên tế bào ............................................................................................................................................. 91  Hình 3.52: Hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp loại bỏ gốc tự do DPPH của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ............................................................................................... 93  Hình 3.53: Hoạt tính chống oxy hóa bằng phép thử MDA của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ .................................................................................................................................... 94  Hình 3.54: Hoạt tính chống oxy hóa trên tế bào gan chuột của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ .................................................................................................................................... 95  xi ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, mưa nhiều. Với điều kiện thuận lợi như vậy nên hệ thực vật Việt Nam phát triển rất đa dạng, các loại cây ăn quả cũng rất phong phú và mang nhiều nét đặc thù riêng. Chúng là nguồn nguyên liệu quan trọng trong nhiều ngành kinh tế khác nhau và trong đời sống hàng ngày của con người. Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ. Hiện nay, đu đủ được trồng ở các nước vùng nhiệt đới, những nơi có nhiệt độ bình quân trong năm không thấp hơn 150C. Sản lượng đu đủ trên thế giới khoảng trên 5 triệu tấn quả/năm [17]. Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam. Tuy nhiên, chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa. Các tỉnh trồng nhiều đu đủ như: Hà Nội, Hưng Yên, Hà Nam, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, Cần Thơ, các tỉnh Tây Nguyên,…. Diện tích trồng đu đủ của cả nước ước khoảng 10000 – 17000 hecta với sản lượng khoảng 200 – 350 nghìn tấn quả [17]. Cây đu đủ có lợi thế là loại cây dễ trồng, ra quả sớm, năng suất cao đồng thời toàn bộ thân, lá, quả đều được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Ngoài việc lấy quả tươi, dùng làm nguyên liệu cho chế biến, đu đủ còn được trồng để lấy nhựa, dùng làm thức ăn chăn nuôi. Trong dân gian lá cây đu đủ được sử dụng để sát khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán,…Đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ. Lá đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh [32, 88]. Hoạt tính chống oxy hóa này do các hợp chất phenol gây ra [33]. Lá đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm [2,73]. Ngoài ra, lá đu đủ còn có khả năng kháng viêm, giảm đau [23, 35]. Đặc biệt, người dân Việt Nam đã dùng lá đu đủ chữa trị bệnh ung thư. Ở nước ta, cao chiết với cồn từ lá đu đủ được nghiên cứu trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng [10]. Người dân nước Úc đã dùng lá đu đủ chữa trị bệnh ung thư [96]. Đầu năm 2010, một nhóm nghiên cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu,…. Ngoài ra, dịch chiết từ lá đu đủ còn có tác dụng 1 hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine này có khả năng chống lại khối u [72]. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu cho thấy lá đu đủ có tác dụng phòng và điều trị ung thư. Tuy nhiên, những công bố đều chỉ sơ lược ở dạng dịch chiết và chưa xác định được thành phần nào là hoạt chất. Vì vậy, việc tìm hiểu thành phần hóa học và cao hơn nữa là chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của lá đu đủ là một việc làm hết sức cần thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam làm thuốc điều trị bệnh ung thư. Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (Carica papaya Linn)” 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính sinh học và hợp chất mới có trong lá đu đủ. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đã được phân lập làm cơ sở khoa học chứng minh cho việc người dân ở một số nước trên Thế Giới sử dụng lá đu đủ chữa trị một số loại bệnh trong đó có bệnh ung thư. 3. Nội dung nghiên cứu Luận án gồm các nội dung chính như sau: - Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất có trong lá đu đủ. - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn cặn chiết từ lá đu đủ. - Đánh giá khả năng gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ lá đu đủ. - Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và pseudocarpaine trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1. - Đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ. - Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ. - Đánh giá khả năng kích thích miễn dịch của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ. 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đã phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất có trong lá đu đủ. Đây là những đóng góp đáng tin cậy làm phong phú thêm nguồn tư liệu về cây đu đủ trồng ở Việt Nam. Đã đánh giá được một số hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ. 2 5. Tính mới của đề tài Phân lập và xác định cấu trúc của một hợp chất mới từ lá đu đủ (Carica papaya Linn) được đặt tên là carpainone. Đã xác định hoạt tính gây độc lên một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ lá đu đủ, trong đó hợp chất carpaine và pseudocarpaine thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư rõ rệt. Lần đầu tiên xác định được khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine và pseudocarpaine trên tế bào ung thư phổi LU-1. Đánh giá được khả năng chống oxy hóa, kháng vi khuẩn, kháng nấm và khả năng kích thích miễn dịch của một số hợp chất phân lập từ lá đu đủ. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về cây đu đủ Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới [28]. Ở nước ta có 1 chi và một loài. Cây đu đủ có tên khoa học là Carica papaya Linn. Cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2 - 4 mét, thân thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống lá rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt nhẵn [2]. Ở Việt Nam, đu đủ là cây trồng khá lâu đời và chưa xác định được cụ thể thời gian cây được nhập vào. Đu đủ trồng gồm nhiều giống, gần như ở mỗi vùng sinh thái đều có một giống khác nhau. Nhưng vài năm gần đây, một vài giống cho quả sớm, năng suất và chất lượng cao được nhập trồng [17]. Một số giống đu đủ hiện nay đang được trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta, đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ Thái Lan, đu đủ Đài Loan [17]. * Giống đu đủ ta: bao gồm các giống đu đủ có từ lâu đời ở nước ta. Đặc tính chung của nhóm cây này là sinh trưởng khỏe, lá xanh đậm, song phiến lá mỏng, cuống lá dài, mảnh nhỏ và thường có màu xanh. Thịt quả màu vàng, mỏng, năng suất thấp. * Giống đu đủ Mêhico: là giống nhập nội trong những năm 70 của thế kỷ 20. Quả dài, tương đối đặc ruột, thịt quả màu vàng, năng suất cao. Lá xanh đậm, phiến lá dày, cuống lá to, màu xanh. * Giống đu đủ So Lo: còn có tên gọi khác là đu đủ Mỹ, thân cây cao trung bình, sinh trưởng khỏe. Quả hình quả lê, to, thịt quả màu vàng, chất lượng tốt, năng suất cao. Là giống yêu cầu nhiệt cao nên được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Nam. * Giống đu đủ Trung Quốc: là giống nhập từ Quảng Đông, Quảng Tây Trung Quốc. Cây thấp, sinh trưởng trung bình, năng suất khá cao. Quả dài, thuôn dài, thịt quả dày trung bình, thịt quả có màu vàng đến đỏ. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày. * Giống đu đủ Thái Lan: là giống được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp, năng suất cao, quả to, ruột quả màu vàng, chất lượng tốt. Tuy nhiên giống này dễ bị nhiễm bệnh khảm lá. * Giống đu đủ Đài Loan: là giống mới được nhập trồng trong thời gian gần đây. Cây thấp, sinh trưởng khỏe, ít nhiễm bệnh, cho năng suất cao, khoảng 60 – 70 kg quả/ cây. Thịt 4 quả màu đỏ, ngọt, thơm, mềm mà không nát, vỏ quả cứng dễ bảo quản và vận chuyển. Lá có màu xanh đậm, chia thùy sâu, phiến lá dày. Ở nước ta, đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam, tuy nhiên chúng được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng, dọc theo các con sông, trên các loại đất phù sa và nhiều loại đất khác nhau. Các tỉnh trồng nhiều gồm: Hà Nội, Bắc Giang, Hà Nam, Hưng Yên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Tiền Giang, các tỉnh Tây Nguyên. Diện tích trồng đu đủ cả nước ước khoảng 10000 - 17000 hecta, với sản lượng khoảng 200 - 300 nghìn tấn quả [19]. Hiện nay ở Việt Nam nói chung và miền Bắc nói riêng, giống đu đủ Đài Loan được trồng chủ yếu, với diện tích tương đối lớn. Giống đu đủ Đài Loan được trồng là giống lai F1 được nhập từ Đài Loan. Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống đu đủ Đài Loan được trồng ở các huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất,…Với mục đích trồng lấy quả nên cây đu đủ Đài Loan được trồng là đu đủ cái. Với điều kiện thực tế như vậy nên chúng tôi chọn lá đu đủ Đài Loan cho nghiên cứu này. Hình 1.1: Cây và lá đu đủ 5 1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ Ở trong nước, cho đến nay đã có một số công bố về các chất có trong lá đu đủ. Năm 1983, Nguyễn Tường Vân và cộng sự đã chiết xuất và xác định được alkaloid carpaine trong lá đu đủ [19]. Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc đã sử dụng kỹ thuật HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá đu đủ. Kết quả cho thấy β-carotene, luteine chiếm tỷ lệ tương ứng là 57,05 và 11,864% so với tổng các chất carotenoid, tuy nhiên không xác định được lycopene [11]. Gần đây, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân đoạn chiết n-hexan của lá đu đủ. Bao gồm, β- sitosterol, daucosterol, cycloart -23-ene-3β,25-diol (sterculin A) và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol. Trong đó, sterculin A và cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập từ lá đu đủ [4]. H 3C CH3 CH3 CH3 H H O H H CH3 OH O H HO OH HO OH Hình 1.2: β- sitosterol 21 18 Hình 1.3: Daucosterol 22 20 19 21 25 OH 1 2 30 HO 28 29 3 HO 28 Hình 1.4: Sterculin A 4 12 11 19 10 5 29 9 6 20 17 13 14 8 7 16 30 OH 22 18 23 24 25 27 26 15 Hình 1.5: Cycloart-25-ene-3β,24 (R/S)-diol 1.2.2. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá đu đủ Tác giả Phạm Kim Mãn đã chứng minh cao chiết với cồn từ lá đu đủ có tác dụng ức chế sự phát triển u báng gây bởi tế bào ung thư Sarcoma TG -180 ở chuột nhắt trắng. Làm giảm thể tích u, giảm mật độ tế bào ung thư, giảm sự tăng sinh khối u [10]. Theo Đỗ Thị Thảo, cặn chiết methanol của lá đu đủ chỉ có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi LU với IC50 = 19,2 μg/ml, và không có tác dụng gây độc các dòng tế bào ung 6 thư khác như ung thư biểu mô KB, ung thư vú MCF-7, ung thư máu cấp tính HL-60, ung thư tiền liệt tuyến LNCaP, ung thư gan Hepa1c1c7. Đồng thời cặn chiết methanol cũng không gây độc với tế bào gốc tách từ phôi chuột [15]. Năm 1998, Hà Thị Thanh Bình đã ngâm chiết lá đu đủ bằng ethanol, sau đó cặn chiết được chiết phân bố với n-hexan và nước. Phần dịch nước điều chỉnh đến pH = 3 - 4 và chiết rút bằng etyl axetat. Kiểm tra hoạt động của enzyme peroxidase ở bốn nhóm máu người A, B, O, AB với nồng độ từ 0 – 20mg% theo trọng lượng khô của lá. Kết quả: cả ba phân đoạn chiết đều có tác dụng kìm hãm hoạt động của enzyme peroxidase trong máu người, nhưng với mức độ khác nhau. Trong đó phân đoạn chiết rút bằng nước có hiệu quả thấp hơn hẳn so với hai phân đoạn còn lại. Hai phân đoạn etyl axetat và n-hexan đều có tác dụng kìm hãm mạnh hoạt động của enzyme peroxidase máu người. Mức độ kìm hãm của hai phân đoạn này đối với 4 nhóm máu có mối quan hệ như sau: Phân đoạn etyl axetat: AB > O > A > B. Phân đoạn n-hexan: A > O > AB > B [3]. Năm 1999, Nguyễn Quốc Khang và Hà Thị Thanh Bình đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của flavonoid chiết từ lá đu đủ. Các tác giả thí nghiệm với 5 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm gây bệnh. Nồng độ flavonoid thí nghiệm là 0,4 mg/ml. Kết quả, flavonoid trong lá đu đủ thể hiện tính kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm bao gồm: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella typhi T239, Salmonella typhi T241, Candida albicans, Candida stellaloides [6]. Như vậy, các kết quả nghiên cứu đã khẳng định trong lá đu đủ có các hợp chất alkaloid carpaine, carotenoid, flavonoid và một số triterpene. Đồng thời, cặn chiết lá đu đủ đã được chứng minh là có tác dụng gây độc một số dòng tế bào ung thư. 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.3.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ Cho đến nay, đã có nhiều công bố về thành phần hóa học của lá đu đủ. Kết quả phân tích định tính cho thấy trong lá đu đủ ngoài các hợp chất trao đổi sơ cấp còn có các chất: tannin, alkaloid, saponin, glycosid, phytosterol, phenol, flavonoid, steroid, terpenoid,… [74, 99, 104]. Alkaloid có khung piperidin, chủ yếu là carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I, dehydrocarpaine II, choline, …[61, 74]. Ngoài ra còn có vitamin C, E, nguyên tố khoáng Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe,.. [28, 74] 7
- Xem thêm -