Tài liệu Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật dứa dại (pandanus odoratissimus), nhó đông (morinda longissima), chùm ruột (phyllanthus acidus) ở việt nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN CÔNG THÙY TRÂM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH BẢO VỆ GAN CỦA BA LOÀI THỰC VẬT DỨA DẠI (PANDANUS ODORATISSIMUS), NHÓ ĐÔNG (MORINDA LONGISSIMA), CHÙM RUỘT (PHYLLANTHUS ACIDUS) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật Mã số: 942 01 04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Đỗ Thị Thảo Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cƣờng Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên Hà Nội, 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án hoàn toàn trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Công Thùy Trâm i LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Phòng thử nghiệm sinh học, viện Công nghệ sinh học và phòng Hoạt chất sinh học, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Đỗ Thị Thảo và PGS.TS Nguyễn Mạnh Cường là những người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện Công nghệ sinh học, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm và Khoa học Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, hỗ trợ kinh phí hóa chất và thực hiện các thí nghiệm liên quan trong quá trình làm luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Ninh Thế Sơn (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên), ThS Nguyễn Thị Cúc, ThS. Nguyễn Thị Nga, ThS. Đỗ Thị Phương (Viện Công nghệ Sinh học) đã giúp tôi tách chiết và nuôi cấy tế bào trong quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc đại học Đà Nẵng, Ban Giám hiệu trường đại học Sư Phạm, Đà Nẵng đã hỗ trợ kinh phí và tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận án. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà nội, ngày tháng năm 2019 Nghiên cứu sinh Nguyễn Công Thùy Trâm ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4 1.1. Gan và một số bệnh về gan ........................................................................... 4 1.1.1. Cấu trúc của gan .......................................................................................... 4 1.1.2. Chức năng và một số hoạt động sinh lý của gan ......................................... 6 1.1.3. Một số dạng bệnh lý thường gặp của gan ................................................... 7 1.2. Stress oxy hóa trong các bệnh gan ........................................................... 9 1.2.1. Gốc tự do ..................................................................................................... 9 1.2.2. Stress oxy hóa trong bệnh gan .....................................................................10 1.2.3. Chống oxy hóa và bảo vệ gan ......................................................................10 1.2.4. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trong bảo vệ gan in vitro, ex vivo ..........13 1.3. Vai trò của một số cytokine và hệ chuyển đổi tín hiệu hoạt hóa phiên mã 3 (signal transducer and activator of transcription 3- stat3) trong bệnh gan .......14 1.3.1. Một số cytokine liên quan đến sinh học bệnh gan .......................................14 1.3.2. Tín hiệu hoạt hóa phiên mã 3 (Signal transducer and activator of transcription 3 – STAT3) trong tế bào Kupffer và trong bệnh gan..............18 1.4. Các loài thực vật sử dụng trong nghiên cứu ............................................19 1.4.1. Cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f) .................................................19 1.4.2. Cây Nhó đông(Morinda longissima Y.Z.Ruan)...........................................22 1.4.3. Cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus L. Skeels) ...........................................26 Chƣơng 2.VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................31 2.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................31 2.1.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu ...............................................................31 2.1.2. Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu .............................................................32 2.1.3. Thiết bị .........................................................................................................32 2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu hóa học .....................................................33 2.2.1. Phương pháp điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật để sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan ............................................................33 iii 2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất .............................................................37 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ...............................................37 2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu sinh học ....................................................38 2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH .......................38 2.3.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế peroxyl hóa lipid (thử nghiệm MDA)...39 2.3.3. Phương pháp xác định khả năng bảo vệ tế bào gan .....................................40 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính cảm ứng/ức chế cytokine .........................41 2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu .............................................................................42 Chƣơng 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................43 3.1. Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và phân tích sơ bộ thành phần hóa học các phân đoạn của quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá Chùm ruột ..........43 3.1.1. Điều chế các phần chiết từ quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ....43 3.1.2. Sơ bộ phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn tách chiết từ quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá Chùm ruột..................................................43 3.1.3. Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ....................................................................45 3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ các phân đoạn PO-B;ML-B và PA-C .............................................................................................................49 3.2.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PO-B của quả Dứa dại..49 3.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn ML-B của rễ cây Nhó đông...51 3.2.3. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PA-C của lá cây Chùm ruột.....54 3.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất đƣợc tách chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ..60 3.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PO-B quả cây Dứa dại ................................................................60 3.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông ..........................................................65 3.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột ..........................................................69 Chƣơng 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ......................................................................85 iv 4.1. Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột .................................................................85 4.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ các phân đoạn PO-B; ML-B và PA-C .......................................................................................................86 4.2.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PO-D của quả cây Dứa dại .86 4.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn ML-B của rễ cây Nhó đông...90 4.2.3. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PA-E của lá Chùm ruột.........92 4.3. Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất đƣợc tách chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ........106 4.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PO-B quả cây Dứa dại ..............................................................106 4.3.2. Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông .............................................................108 4.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột .............................................................. 109 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 116 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ...................................................... 118 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐLIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ................................................................................................................... 123 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 124 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ ATP Adenosine triphosphate ADN Deoxyribonucleic acid Bcl-xl B-cell lymphoma-extra large CCl4 Carbon tetrachloride C-NMR Carbon nuclear magnetic res COSY Correlation spectroscopy d Doublet dd Doublet of doublet DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer DMEM Dulbescco´s modified eagle medium DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl EtOAc Ethyl acetate HMBC Heteronuclear multiple bond correlation H-NMR Proton nuclear magnetic resonance HSQC Heteronuclear singlet quantum coherence spetroscopy IC Inhibitory concentration (Nồng độ ức chế) IL Interleukin IR Infrared spetroscopy (Phổ hồng ngoại) LPS lipopolysaccharide MDA Malondialdehyde MKK Mitogen - activated protein kinase kinase MMP matrix metalloproteinases MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide MS Mass spetrometry (Phổ khối) vi NF-B Nuclear factor kappa B NOESY Nuclear overhause effect ROS Reactive oxygen species s Singlet STAT3 Signal transducer and activation of transcription 3 TNF- Tumor necrosis factors C Carbon chemicalshift ( độ dịch chuyển hóa học Carbon) H Proton chemicalshifrt (độ dịch chuyển hóa học Proton) vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các phân đoạn chiết của quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ................................................................................................43 Bảng 3.2.Kết quả định tính nhóm các hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn chiết xuất từ quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ...........44 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH của các phân đoạn từ quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ................................46 Bảng 3.4.Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa thông qua ức chế peroxy hóa lipid (thử nghiệm MDA) của quả Dứa dạiquả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột ........................................................................47 Bảng 3.5.Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PO-B quả Dứa dại ....................................63 Bảng 3.6.Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông ............................68 Bảng 3.7.Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột ............................73 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào RAW 264.7. của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột ....................77 Bảng 4.1. Số liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của chất PA5 và PA8 (500 & 125 MHz, MeOD) ........................................................................................101 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ con đường tác động của TNF-α trong tế bào gan .......................16 Hình 1.2. Tính hiệu STAT3 trong tế bào Kupffer .................................................19 Hình 1.3. Cây Dứa dại ...........................................................................................20 Hình 1.4. Cây Nhó đông ........................................................................................23 Hình 1.5. Cây Chùm ruột........................................................................................26 Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn PO-B quả Dứa dại ....................50 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn PO-B rễ cây Nhó đông .............52 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột ...........55 Hình 3.4. Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất PO1: Vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)-medioresinol phân lập từ phân đoạn chiết PO-B quả Dứa dại và acid ascorbic .............61 Hình 3.5. Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất PO1: Vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)- medioresinol ..........................................................................................62 Hình 3.6. Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây ra của các hợp chất PO1: vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)syringaresinol; PO4: (+)-medioresinol được tách chiết từ phân đoạn POB của quả Dứa dại ...................................................................................65 Hình 3.7. Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol phân lập từ phân đoạn chiết ML-B rễ cây Nhó đông và acid ascorbic ..........................................................................................66 Hình 3.8. Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol phân lập từ phân đoạn chiết ML-B rễ cây Nhó đông ..........67 Hình 3.9. Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây ra của các hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol được tách chiết từ phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông ........................................................69 ix Hình 3.10. Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất PA1: kaempferol; PA2: kaempferol -3-O-β-D-glucopyranoside; PA3: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L- arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C lá cây Chùm ruột và acid ascorbic ..................................................................................................70 Hình 3.11. Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất PA1: kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside; PA3: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[αL-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L- arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C của lá cây Chùm ruột .............71 Hình 3.12. Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây ra của các hợp chất PA1: kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-Dglucopyranoside; PA3: (Quercitrin); Kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside; PA4: quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside PA5: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-Dglucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D-galactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl x ester; PA9: kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L- arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutin được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột ...................................76 Hình 3.13. Kết quả ức chế sản xuất TNF-α từ tế bào RAW của các hợp chất PA5: kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D- galactopyranoside; PA8: kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-ß-Dglucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C lá cây Chùm ruột tại thời điểm 24 giờ và 48 giờ ................80 Hình 3.14. Kết quả tác động của các hợp chất PA5: kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside; PA8: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C lá cây Chùm ruột đến quá trình sản sinh IL-6 từ tế bào RAW tại thời điểm 24 giờ và 48 giờ ...........................81 Hình 3.15.Kết quả tác động của các hợp chất PA5: kaempferol-3-O-[α-Lrhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-Dgalactopyranoside; PA8: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA10: isoquercitrin phân lập từ phân đoạn chiết PA-C lá cây Chùm ruột đến quá trình sản sinh IL-10 từ tế bào RAW 264.7 tại thời điểm 24 giờ và 48 giờ ................83 xi 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiêt của đề tài Gan là một nội quan lớn của cơ thể người và động vật, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình trao đổi chất, thải độc và là cơ quan miễn dịch quan trọng của cơ thể. Máu cung cấp cho gan từ hai nguồn, khoảng 75% lưu lượng máu đi đến gan là từ các bộ phận của hệ tiêu hóa, lách thông qua tĩnh mạch cửa và 25% còn lại từ động mạch gan. Chính vì vậy, áp suất riêng phần của oxi trong máu mang đến cung cấp cho gan rất thấp. Ngoài ra, gan nhận các chất, trao đổi chất và chuyển hóa các chất từ máu mang đến. Do đó gan thường xuyên tiếp xúc với nội độc tố, các chất độc, vi khuẩn, virut... đây là những nguyên nhân làm gan tổn thương và dẫn đến các bệnh về gan (Higuchi và Gores, 2003). Các độc tố khi vào gan, kích thích tế bào gan sản xuất các cytokine tiền viêm như yếu tố hoại tử khối u (TNF-), interleukin-6 (IL-6) và interleukin-10 (IL10)…đóng vai trò quan trọng trong quá trình miễn dịch và gây chết tế bào. Các cytokine tiền viêm gây ra phản ứng viêm gan, khởi động cho quá trình tự điều chỉnh để chữa bệnh. Tuy nhiên nếu tình trạng viêm không giảm sau một thời gian ngắn, việc sản xuất các cytokine liên tục sẽ dẫn đến sự hình thành xơ hóa và xơ gan (Mannaa và Abdel-Wahhab, 2016). Do đó, có thể thông qua việc điều chỉnh quá trình sản xuất và hoạt động của các cytokine để bảo vệ gan. Bên cạnh đó, stress oxy hóa cũng là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến tổn thương và hoại tử tế bào gây ra trong bệnh về gan. Các gốc oxy hóa như hydroxyl, anion superoxide và hidrogen peroxide… phá hủy mô gan, gây tổn thương tế bào thông qua quá trình peroxy hóa lipid màng, đột biến ADN (Cochrane, 1991). Vì vậy, việc tìm ra các tác nhân có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp có hoạt tính chống oxy hóa được đề xuất để ngăn ngừa và điều trị bệnh gan do stress oxy hóa. Cây thảo dược đóng vai trò quan trọng trong việc chăm sóc sức khỏe con người. Các loại thuốc được chiết xuất từ thảo dược được dùng phổ biến trong điều trị bệnh, trong đó có bệnh gan do hiệu quả, mức an toàn và chi phí hợp lý. Cơ chế bảo vệ gan 2 của các loại thảo dược thường thông qua hoạt động chống oxy hóa, kháng virus, chống viêm, chống xơ và các hoạt động miễn dịch. Tuy nhiên, chỉ có một số các dịch chiết và một số các hợp chất được phân lập từ các loài thảo dược đã được khảo sát, đánh giá hiệu quả hoạt tính bảo vệ gan trong các mô hình in vitro, ex vivo và in vivo. Hầu hết các loại thảo dược đều chưa được thử nghiệm để chứng minh hiệu quả bảo vệ gan mặc dù được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và trong dân gian (Dhiman và Chawla, 2005). Việt Nam là một trong những nước có nguồn tài nguyên thực vật phong phú, đa dạng. Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 5.117 loài và dưới loài thực vật bậc cao có mạch được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa bệnh (Viện Dược liệu, 2017). Đây là nguồn dược liệu quý cần được nghiên cứu, khai thác sử dụng có hiệu quả và bảo tồn, phát triển bền vững cho cộng đồng . Trong số những loài đã được phát hiện, cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus), cây Nhó đông (Morinda longissima), cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus) là những cây được sử dụng nhiều trong các bài thuốc dân gian để điều trị bệnh trong đó có bệnh gan. Tìm hiểu về thành phần hóa học và hoạt tính bảo vệ gan của ba loại cây này sẽ bổ sung thêm nguồn nguyên liệu dược liệu sử dụng trong quá trình hỗ trợ, điều trị bệnh gan. Xuất phát từ nhữnglý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật Dứa dại (Pandanus odoratissimus), Nhó đông (Morinda longissima), Chùm ruột (Phyllanthus acidus)Việt Nam với các mục tiêu sau: 1. Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa từ các dịch chiết của quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông, lá cây Chùm ruột phân bố ở Việt Nam. 2. Chiết tách và phân lập một số hợp chất từ 3 loài thực vật này, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập. 3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan in vitro của các hợp chất được phân lập Đề tài này là cần thiết, đóng góp vào việc nghiên cứu về hoạt tính bảo vệ gan, chống oxy hóa của các dịch chiết, phát hiện các hợp chất tinh khiết có tác 3 dụng bảo vệ gan được tách chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột phân bố ở Việt Nam. Các kết quả của đề tài góp phần giải thích về hoạt tính bảo vệ gan của các bài thuốc dân gian, nâng cao giá trị sử dụng của các loài cây này. 2. Những đóng góp mới của luận án Lần đầu tiên 4 hợp chất được phân lập từ quả Dứa dại và 3 hợp chất được phân lập rễ cây Nhó đông được tiến khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan HepG2 chống lại tác động gây độc của CCl4. 11 hợp chất được phân lập từ lá Chùm ruột phân bố ở Việt Nam đã được xác định cấu trúc trong đó có một hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Phyllanthus và một hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên là kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl . Các hợp chất được tách chiết từ lá Chùm ruột đã được khảo sát hoạt tính chốg oxy hóa bảo vệ gan, trong đó hợp chất myricitrin thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào gan mạnh nhất thông qua hoạt động chống oxy hóa. Đặc biệt hợp chất mới kaempferol3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-ß-D- glucuronopyranosyl methyl ester có hoạt tính bảo vệ gan mạnh thông qua tác dụng ức chế các cytokine tiền viêm, hoạt động điều chỉnh hàm lượng các cytokine theo thời gian như TNF-α, IL-6, IL-10 trong con đường signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GAN VÀ MỘT SỐ BỆNH VỀ GAN 1.1.1. Cấu trúc của gan Gan là một tạng lớn nhất của cơ thể với trọng lượng trung bình khoảng 1500g, chiếm khoảng 2,5% trọng lượng cơ thể. Gan nằm bên dưới cơ hoành, ở vị trí một phần tư bên phải khoang bụng, giữa dạ dày và tim. Mặt ngoài được phủ bởi phúc mạc. Dưới phúc mạc là áo xơ (tunica fibrosa). Ở cửa gan, áo xơ đi vào trong gan cùng các mạch tạo nên bao xơ quanh mạch (bao Glisson) (Robin và cs., 2012). Gan được chia thành 4 thùy chính và 50.000-100.000 tiểu thùy (được xem là đơn vị chức năng). Mỗi tiểu thùy có dạng hình trụ có chiều dài vài milimet (mm) và đường kính có khi lên đến 2 mm. Ở mỗi góc tiểu thùy có một khoảng mô liên kết gọi là khoảng cửa chứa nhánh tĩnh mạch cửa, nhánh động mạch gan và ống dẫn mật. Ở trung tâm của mỗi tiểu thùy gan có tĩnh mạch trung tâm. Từ tĩnh mạch trung tâm có những đôi dây tế bào gan hình lập phương tỏa ra ngoại vi. Giữa hai đôi dây tế bào gan liền nhau là những mao mạch dạng xoang dẫn máu từ nhánh tĩnh mạch cửa và nhánh động mạch gan ở khoảng cửa tới tĩnh mạch trung tâm. Thành của mao mạch dạng xoang được tạo ra bởi các tế bào nội mô. Tĩnh mạch trung tâm của các tiểu thùy hợp lại thành tĩnh mạch lớn hơn và cuối cùng tạo thành tĩnh mạch gan chạy ra khỏi gan và đổ vào tĩnh mạch chủ dưới. Ngoài ra, giữa các đôi dây tế bào gan là các vi quản mật, có đầu ngoại vi đổ vào ống mật ở khoảng cửa (ống gian tiểu thùy). Các ống mật ở khoảng cửa hợp nên những ống mật lớn dần và cuối cùng thành các ống gan phải và ống gan trái đi ra khỏi gan (Nguyễn Văn Huy và cs., 2007; Robin và cs., 2012). Gan được cấu tạo bởi tế bào nhu mô gan hay còn gọi là tế bào gan và các tế bào không phải là tế bào nhu mô như tế bào Kupffer, tế bào hình sao, tế bào nội mô xoang, tế bào đuôi gai (Robin và cs., 2012). Tế bào gan chiếm khoảng 70-80% số lượng tế bào có trong gan và tham gia hầu hết các chức năng quan trọng, đặc trưng của gan như: chuyển hóa glucid, lipid, 5 protein, dự trữ các chất dinh dưỡng, giải độc trong máu trước khi chất độc tham gia vào vòng tuần hoàn và tạo mật (Duncan và cs., 2009). Ngoài ra, tế bào gan tham gia tổng hợp hormon, thrombopoietin, ethythropoientin và chúng còn tổng hợp các cytokine như IL-8, IL-6 trong giai đoạn viêm cấp tính. Tuy nhiên, khi hoạt động bảo vệ không thể chống trả lại tác động của các yếu tố gây hại, tế bào nhu mô gan bắt đầu tổng hợp chemokine nhằm thu hút các tế bào kháng viêm như bạch cầu có hạt, đại thực bào đơn nhân và kích hoạt các đại thực bào cư trú tại gan (Ramadori và cs., 2008). Khi tế bào nhu mô gan dày lên là biểu hiện hoạt động tái sinh, tuy nhiên trong trường hợp tổn thương gan, sự dày lên của tế bào gan dấu hiệu của việc xuất hiện các khối u. Ngoài ra, các tế bào gan nằm sát với cửa tĩnh mạch tạo thành một lớp màng và sẽ biểu hiện các hoạt động viêm, trong tình trạng tổn thương hay viêm (Krithika,1013). Tế bào Kupffer là tế bào miễn dịch nằm trong huyết quản chiếm khoảng 8090% loại tế bào đại thực bào trong hệ thống lưới nội mô, khoảng 15% trong tổng số tế bào gan (Suraweera và cs., 2015). Tế bào Kupffer đóng vai trò quan trọng trong hoạt động chức năng sinh lý và cân bằng nội môi của gan, cũng như tham gia vào các phản ứng cấp và mạn tính của gan. Tế bào này có khả năng loại bỏ vi khuẩn, virus, phức hợp fibrin – fibrinnogen, hồng cầu bị hư hỏng (Canbay và cs., 2003; Roberts và cs., 2007). Tế bào Kupffer có thể hoạt động như tế bào trình diện kháng nguyên (antigen - presenting cell) và tham gia kiểm soát khối u cũng như quá trình tái sinh gan, nó đóng vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch bẩm sinh và bảo vệ gan thông qua sự sản xuất, bài tiết các chất trung gian gây phản ứng viêm. (Kolios và cs., 2006). Tế bào hình sao (Hepatic Stellate Cell: HSC) là những tế bào trung mô đặc trưng ở gan nằm trong khoảng Disse (khoảng giữa tế bào gan và tế bào nội mô xoang mạch), chiếm khoảng từ 5-8% tổng số tế bào gan. Các tế bào này là nơi dự trữ vitamin A đầu tiên của cơ thể.Tế bào hình sao đóng vai trò chủ yếu trong việc phát triển tế bào, tái tạo gan, trao đổi lipoprotein và retinoid trong gan, quy định quá trình miễn dịch ở gan trong trạng thái sinh lý bình thường và tạo xơ đáp ứng với sự tổn thương gan (Yin và cs., 2013; Mallat và Lotersztajn, 2013; Lingwal và cs., 2015;). 6 Tế bào nội mô xoang (Hepatic sinusoidal endothelia cell: HSEC) chiếm khoảng 15-20% tế bào gan và khoảng 70% tổng số tế bào không phải là tế bào nhu mô của gan, lót bên trong các xoang gan tạo thành lớp nội mô cho phép tế bào máu, huyết tương và các thành phần khác có đường kính nhỏ hơn đường kính lỗ có thể khuếch tán vào bên trong khoảng Disse, tạo điều kiện cho quá trình trao đổi chất và quá trình miễn dịch (Svistounov và cs., 2012; Xing và cs., 2016). Tế bào nội mô xoang có khả năng thực bào và có các kháng nguyên thực hiện chức năng sinh lý và có khả năng đáp ứng miễn dịch và sự biểu hiện của kháng nguyên này giống sự biểu hiện của tế bào đuôi gai (Braet và Wisse, 2002, Xing và cs., 2016) Tế bào đuôi gai (Dendritic cell: DC) phân bố chủ yếu ở ngoại vi vùng tĩnh mạch cửa và một số ít trong nhu mô gan. Tế bào đuôi gai đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm ứng và điều chỉnh các phản ứng miễn dịch cũng như thực hiện chức năng thực bào, kích thích tế bào T. (Lau và Thomson, 2003; Geissmann và cs., 2010). 1.1.2. Chức năng và một số hoạt động sinh lý của gan Gan thực hiện hơn 500 chức năng khác nhau và gắn liền với các quá trình sinh lý xảy ra trong cơ thể. Gan nhận máu từ hệ tiêu hóa thông qua tĩnh mạch cửa. Vì vậy gan là cơ quan đầu tiên, kiểm soát, tiếp nhận các chất dinh dưỡng, trao đổi, chuyển hóa các chất và loại bỏ độc tố ra khỏi các chất dinh dưỡng trước khi các chất dinh dưỡng này được vận chuyển đến cung cấp cho các cơ quan, mô, tế bào trong cơ thể. Do đó, khi hoạt động chức năng của gan bị rối loạn sẽ dẫn đến rối loạn các quá trình sinh lý khác xảy ra trong cơ thể (Higuchi và Gores, 2003; Robin và cs., 2012). Gan đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất, cung cấp năng lượng cần thiết cho cơ thể. Gan quy định việc sản xuất, lưu trữ và giải phóng glucid, lipid, protid của cơ thể. Gan duy trì đường huyết ở mức tương đối ổn định, chịu trách nhiệm cho oxi hóa khử gốc amin và chuyển hóa amin để tạo nguyên liệu cho sự tổng hợp axit amin và tổng hợp carbohydrat. Thông qua chu trình urê, gan đào thải nitơ ở dạng urê. Gan tổng hợp khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể từ acetyl-CoA và loại bỏ cholesterol thông qua hệ tuần hoàn. Gan còn tham gia vào quá trình tổng hợp, lưu trữ và bài tiết triglyceride, gan chuyển đổi các axit amin dư 7 thừa thành axit béo và sau đó chuyển chúng thành ketone tạo năng lượng cho gan. Gan tham gia vào quá trình tổng hợp các protein quan trọng của cơ thể như các protein huyết tương (albumin, globulin), các yếu tố đông máu như fibrinogen, prothrombin. Ngoài ra, gan còn dự trữ nhiều chất quan trọng cho cơ thể như vitamin (A,D,K, E và B12), sắt, đồng (Robin và cs., 2012). Gan là cơ quan sản xuất mật. Mỗi ngày, tế bào gan tiết ra khoảng 8001000ml mật. Thành phần của mật gồm nước, muối mật, cholesterol, lecithin, sắc tố mật và một số ion. Sau khi được tạo ra mật được chuyển đến dự trữ ở túi mật. Tại đây, mật được cô đặc lại và dưới tác dụng của một số kích thích, túi mật sẽ co bóp và đưa mật vào tá tràng qua cơ vòng Oddi. Mật có vai trò nhũ tương hóa và phân hủy lipid (Robin và cs., 2012). Bên cạnh các chức năng trên, gan còn được xem là hàng rào bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các yếu tố độc hại. Chức năng này do tế bào gan và tế bào Kupffer đảm nhiệm. Tế bào gan có thể giữ lại một số kim loại nặng như đồng, chì, thủy ngân ... và một số chất màu, sau đó các chất này được thải ra ngoài. Bên cạnh đó, các tế bào gan chuyển hóa các chất độc thành các chất ít độc hơn và thải ra ngoài qua đường mật. NH3 được tạo ra trong cơ thể thông qua quá trình tạo amin hoặc hấp thu từ ruột già sẽ được tế bào gan chuyển hóa thành urê qua chu trình ornithine và sau đó urê được thải ra ngoài trong nước tiểu (Robin và cs., 2012). 1.1.3. Một số dạng bệnh lý thƣờng gặp của gan Bệnh gan là một khái niệm rộng bao gồm tất các vấn đề tiềm ẩn gây ra, dẫn đến gan suy giảm chức năng hoặc không thể thực hiện được chức năng của nó. Thông thường khoảng hơn ¾ mô gan bị ảnh hưởng trước khi xảy ra quá trình giảm chức năng hoạt động. Dựa vào nguyên nhân và sự tiến triển của bệnh, bệnh gan thường được chia thành các dạng bệnh như: viêm gan, bệnh gan nhiễm mỡ, xơ gan...(Ramadori và cs., 2008). Viêm gan Viêm gan là một bệnh của gan đặc trưng bởi sự xuất hiện của viêm tế bào trong các mô gan mà nguyên nhân chính là do nhiễm virus, do thuốc hay do nhiễm độc (Ramadori và cs., 2008). 8 Trong những điều kiện nhất định viêm gan sẽ tiến triển thành gan nhiễm mỡ hoặc xơ gan. Viêm gan có thể không có các triệu chứng hoặc có các triệu chứng như vàng da, chán ăn, mệt mỏi. Viêm gan có thể được chia thành viêm gan cấp tính và mạn tính (Ramadori và cs., 2008):  Viêm gan cấp là bệnh về gan phát sinh đột xuất khi có bất thường về gan dưới 6 tháng, về mặt giải phẫu xuất hiện các tổn thương ở trung tâm tiểu thùy gan.  Viêm gan mạn là biểu hiện của nhiều loại tổn thương gan do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó viêm và hoại tử tế bào gan kéo dài trên sáu tháng. Bệnh gan nhiễm mỡ Bệnh gan nhiễm mỡ là tổn thương gan hay gặp do sự tích lũy triglyceride dưới dạng những vi giọt mỡ trong các tế bào gan. Bình thường trong gan, triglyceride chiếm khoảng 3-8% khối lượng gan, khi hàm lượng triglyceride tăng khoảng từ 10-40% thì được coi là gan nhiễm mỡ. Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh gan nhiễm mỡ, nhưng rượu và béo phì là một trong những nguyên nhân chính. Các nguyên nhân gây bệnh kết hợp với các bệnh khác làm rối loạn quá trình chuyển hóa chất béo, các chất béo tích tụ trong gan với số lượng lớn vì vậy dẫn đến gan nhiễm mỡ (Reddy và Rao, 2006). Xơ gan Xơ gan là hậu quả của bệnh viêm gan mãn tính đặc trưng bởi sự thoái hóa và hoại tử tế bào gan không phục hồi và thay thế các nhu mô gan bằng mô xơ, mô sẹo, các nốt tân tạo cản trở quá trình lưu thông máu trong gan dẫn đến suy giảm và mất chức năng gan. Xơ hóa là quá trình bệnh lý quan trọng trong tiến triển của tất cả các bệnh gan mãn tính dẫn đến xơ gan. Nguyên nhân dẫn đến xơ gan là do nghiện rượu, do nhiễm vi rút viêm gan B và C, gan nhiễm mỡ và có thể do nhiều nguyên nhân khác như viêm gan tự miễn, bất thường về di truyền... (Lee và cs., 2014; Zhou và cs., 2014). Như vậy, có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến các bệnh về gan do tác động của các yếu tố bên ngoài hay ngay trong chính bản thân các tế bào gan. Các yếu tố này dẫn đến xáo trộn sự cân bằng nội tế bào gồm có phá hủy ADN, hoạt hóa glutathion