Tài liệu Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật metagenomics

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN TRONG RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - Năm 2015 1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA ENZYME THAM GIA THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI KHUẨN RUỘT MỐI BẰNG KỸ THUẬT METAGENOMICS LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS Trương Nam Hải 2. TS Đỗ Thị Huyền Hà Nội - Năm 2015 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được tác giả nào công bố trong bất kì công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Thảo 3 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Trương Nam Hải và TS Đỗ Thị Huyền phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã thu nhận, hướng dẫn tận tình, quan tâm hết mực và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này. Luận án được thực hiện tại phòng Kỹ thuật di truyền. Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và được hỗ trợ bởi đề tài Nghị định thư với Nhật Bản: “Phân lập hệ gen mã hóa cho enzyme thủy phân lignocellulose từ khu hệ vi sinh ruột mối Việt Nam bằng kỹ thuật Metagenomics”. Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật di truyền, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và sự chỉ bảo tận tình về chuyên môn của tập thể cán bộ nghiên cứu của phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó! Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức chuyên môn và kỹ năng cần thiết. Để hoàn thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu và nhiệt tình của các đồng nghiệp công tác tại khoa Sinh học, Trường Đại học Vinh, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó! Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, bố mẹ, chồng và con, những người thân đã thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn cùng tôi trong thời gian qua! Nguyễn Thị Thảo 4 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................................. 14 1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 18 2. Mục tiêu của đề tài ......................................................................................... 20 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .................................................................. 20 4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 20 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ....................................................... 20 6. Đóng góp mới của đề tài ................................................................................ 20 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 21 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LIGNOCELLULOSE ........................................................ 21 1.1.1. Cellulose .................................................................................................... 22 1.1.2. Hemicellulose ............................................................................................ 23 1.1.3. Lignin ......................................................................................................... 24 1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CELLULASE................................................................ 24 1.2.1. Cơ chế hoạt động của cellulase và sự thủy phân cellulose ........................ 24 1.2.2. Cấu trúc của cellulase ................................................................................ 26 1.2.2.1. Cấu trúc chung của cellulase ..................................................................... 26 1.2.2.2. Cellulosome thủy phân cellulose ............................................................. 27 1.3. CELLULASE CỦA VI KHUẨN .................................................................... 28 1.3.1. Sơ lược về họ cellulase ............................................................................... 28 1.3.2. Cellulase của vi khuẩn và vi khuẩn cổ ....................................................... 30 1.3.2.1. Cellulase vi khuẩn và vi khuẩn cổ ưa ấm ................................................ 30 1.3.2.2. Cellulase ở vi khuẩn và vi khuẩn cổ ưa nhiệt .......................................... 31 1.3.3. Ứng dụng của cellulase .............................................................................. 31 1.3.3.1. Ứng dụng của cellulase trong công nghệ sản xuất bia, rượu vang, chế biến thực phẩm và thức ăn ......................................................................... 32 1.3.3.2. Ứng dụng cellulase trong dệt may ........................................................... 33 1.3.3.3. Ứng dụng cellulase trong chế biến bột giấy và giấy ............................... 33 5 1.3.3.4. Ứng dụng của cellulase trong sản xuất cồn sinh học .............................. 34 1.4. MỐI VÀ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐI LIÊN QUAN ĐẾN SỰ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE .................................................................................................... 35 1.4.1. Sơ lược về mối và đa dạng mối ở Việt Nam .............................................. 35 1.4.2. Hệ vi sinh vật trong ruột mối bậc thấp ....................................................... 36 1.4.3. Sự tiêu hóa lignocellulose của mối ............................................................. 38 1.4.4. Tình hình nghiên cứu gen mã hóa cellulase của sinh vật trong đường ruột mối bậc thấp ....................................................................................... 39 1.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ METAGENOMICS ............................................................ 41 1.5.1. Phương pháp tiếp cận tìm gen mới bằng Metagenomics ........................... 42 1.5.2. Phân lập gen từ thư viện DNA đa hệ gen .................................................. 43 1.5.3. Khai thác và phân lập gen từ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gen .................. 45 1.5.3.1. Phương pháp giải trình tự của một số hệ thống máy thế hệ mới ............ 45 1.5.3.2. Tập hợp các read thành contig ................................................................. 47 1.5.4. Ứng dụng của Metagenomics .................................................................... 50 1.5.4.1. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen mới và đánh giá sự đa dạng vi sinh vật ..................................................................................... 50 1.5.4.2. Tiềm năng ứng dụng của Metagenomics ................................................. 53 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 55 2.1. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC ......................... 55 2.1.1. Đối tượng và vật liệu .................................................................................. 55 2.1.2. Hóa chất và thiết bị máy móc ..................................................................... 56 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................... 58 2.2.1. Các phương pháp vi sinh ............................................................................ 59 2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử ............................................................ 59 2.2.2.1. Tách chiết DNA hệ gen của mối .............................................................. 59 2.2.2.2. Phương pháp thu nhận vi khuẩn ruột mối và tách chiết DNA đa hệ gen của chúng ............................................................................................ 59 2.2.2.3. Tinh sạch DNA đa hệ gen bằng phương pháp máng đơn (troughing) .... 60 6 2.2.2.4. Giải trình tự DNA đa hệ gen bằng máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq2000 của Illumina ............................................................................ 61 2.2.2.5. Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E. coli bằng sốc nhiệt ... 62 2.2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E. coli .......... 63 2.2.2.7. Phương pháp cắt và ghép nối gen ........................................................... 63 2.2.2.8. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit.............................................................................................. 64 2.2.2.9. Kỹ thuật PCR ........................................................................................... 64 2.2.2.10. Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen egc ............................. 66 2.2.2.11. Điện di DNA trên gel agarose ............................................................... 66 2.2.2.12. Phương pháp biểu hiện gen ................................................................... 66 2.2.2.13. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide-SDS ....................... 67 2.2.2.14. Điện di protein trên gel polyacrylamide không SDS ............................. 68 2.2.3. Các phương pháp hóa sinh protein ............................................................. 68 2.2.3.1. Phương pháp tinh chế protein bằng sắc kí ái lực his-tag ...................... 68 2.2.3.2. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ................................... 69 2.2.3.3. Định lượng đường khử bằng phương pháp DNS ..................................... 69 2.2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính endoglucanase .................................... 70 2.2.3.5. Phương pháp xác định hoạt tính β-glucosidase và β-xylosidase ............ 71 2.2.3.6. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, các ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt tính endoglucanase .............................................................. 72 2.2.3.7. Xác định độ bền của enzyme ................................................................... 72 2.2.3.8. Xác định thông số động học của enzyme ................................................. 72 2.2.4. Các phương pháp tin sinh học và xử lý số liệu bằng phần mềm sinh học. 73 2.2.4.1. Phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối .............................. 73 2.2.4.2. So sánh trình tự ORF của dữ liệu DNA đa hệ gen với CSDL của NCBI ..... 74 2.2.4.3. Thiết kế mồi bằng phần mềm FastPCR ................................................... 75 2.2.4.4. Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gen quan tâm bằng phần mềm trực tuyến RestrictionMapper ........................................................... 75 7 2.2.4.5. Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằng chương trình dịch mã ExPASy ......................................................................................... 75 2.2.4.6. Xây dựng cây phát sinh loài của loài mối nghiên cứu với các loài mối khác bằng phần mềm Genedoc và MEGA5 ............................................... 75 2.2.4.7. Dự đoán cấu trúc của EGC bằng phần mềm Phyre2 .............................. 76 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 77 3.1. KẾT QUẢ ĐỊNH LOÀI MỐI NGHIÊN CỨU BẰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TỬ . 77 3.1.1. Tách chiết DNA hệ gen của mối................................................................. 79 3.1.2. PCR khuếch đại đoạn DNA của gen mã hóa RNA ribosome 16S ti thể mối . 79 3.1.3. Phân tích sản phẩm PCR................................................................................76 3.2. TÁCH CHIẾT, ĐỌC VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ DNA ĐA HỆ GEN VI KHUẨN RUỘT MỐI C. gestroi ..................................................................................................... 86 3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi ....... 86 3.2.2. Đọc và phân tích trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi ............. 87 3.2.2.1. Tập hợp trình tự và xác định gen ............................................................. 87 3.2.2.2. Đa dạng vi sinh vật ruột mối C. gestroi ................................................... 90 3.3. GEN MÃ HÓA ENZYME THUỶ PHÂN CELLULOSE CỦA VI KHUẨN RUỘT MỐI C. gestroi ................................................................................................................. 96 3.3.1. Dự đoán chức năng gen của DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi..... 96 3.3.2. Gen mã hóa enzyme phân hủy cellulose .................................................... 98 3.3.3. Lựa chọn ORF cellulase để biểu hiện ....................................................... 100 3.4. TÁCH DÕNG GEN egc...................................................................................................104 3.4.1. Trình tự ORF GL0130684 ........................................................................ 105 3.4.2. Khuếch đại gen egc ................................................................................... 105 3.4.3. Ghép nối sản phẩm khuếch đại gen egc vào vector tách dòng pJET1.2/blunt ......................................................................................... 106 3.4.4. Biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào E. coli DH10b ........................... 107 3.4.5. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme hạn chế ............................. 108 8 3.4.6. Phân tích trình tự gen wegc phân lập được từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi ................................................................................... 108 3.4.7. Khuếch đại gen egc không chứa tín hiệu tiết từ khuôn pJET-wegc ......... 111 3.4.8. Thiết kế vector biểu hiện gen egc ............................................................. 111 3.4.8.1. Ghép nối gen egc vào vector biểu hiện.................................................. 111 3.4.8.2. Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22-egc........................................... 113 3.5. BIỂU HIỆN GEN egc TRONG VI KHUẨN E. coli BL21(DE3) ................... 114 3.5.1. Chọn dòng biểu hiện gen egc trong tế bào E. coli BL21(DE3) ................ 114 3.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự biểu hiện gen egc trong tế bào E. coli BL21(DE3) .............................................................................................. 116 3.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến hiệu quả cảm ứng ............................. 117 3.5.4. Điện di và kiểm tra hoạt tính endoglucanase của EGC ............................... 119 3.5.5. Tinh chế protein EGC bằng cột sắc kí ái lực His-tag ............................... 120 3.5.6. Tính đặc hiệu cơ chất của EGC ................................................................ 124 3.5.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase của EGC ............. 126 3.5.8. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của EGC .............................................. 127 3.5.9. Độ bền nhiệt của EGC .............................................................................. 128 3.5.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại và hóa chất lên hoạt tính của EGC 128 3.5.11. Đặc điểm động học của EGC.................................................................. 132 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................................................135 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................138 9 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt BglB BglF BglG Tên tiếng Anh Beta-glucosidase B Beta-glucosidase F Beta-glucosidase G BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp BSA Base pair Bovine serum albumin BWA Burrows-Wheeler Aligner CD Carbohydrate binding domain Catalytic domain cDNA Complementary DNA CBD Cel12A Cel45A (EGV) Cel48A Cel5A Cel6A (CBHII) Cel6B (EGVI) Cel7A (CBHI) Tên tiếng Việt Beta-glucosidase B Beta-glucosidase F Beta-glucosidase G Công cụ so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide/axit amin trực tuyến của NCBI Cặp base Albumin huyết thanh bò Phần mềm kiểm tra các sai lệch nhỏ trong quá trình giải trình tự các đoạn DNA, cũng như quá trình tập hợp so với hệ gene tham khảo lớn Vùng liên kết với carbohydrate Vùng xúc tác DNA được tổng hợp từ khuôn mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase Endoglucanase glycoside hydrolase family 12 Endoglucanase glycoside hydrolase family 45 Exoglucanase glycoside hydrolase family 5 Endoglucanase glycoside hydrolase family 5 cellobiohydrolase cel6A (cellobiohydrolase II) Endoglucanase thuộc họ 12 Endoglucanase thuộc họ 45 Exoglucanase thuộc họ 48 Endoglucanase thuộc họ GH 5 Cellobiohydrolase II (exoglucanase II) thuộc họ GH6 Endoglucanase EGVI Endoglucanase thuộc họ GH 6 Cellobiohydrolase cel7A (Cellobiohydrolase I) Cellobiohydrolase I (exoglucanase II) thuộc họ GH7 10 Endoglucanase Cel9A Endoglucanase thuộc họ 9 glycoside hydrolase family 9 Enzyme phân huỷ cellulose thuộc glycoside hydrolase family 9 Cel9B họ GH 9 Carboxymethyl cellulose Cơ chất carboxymethyl cellulose CMC Cơ sở dữ liệu protein của sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn đơn bào/cơ Clusters of Orthologous/ sở dữ liệu từ 7 hệ gen sinh vật nhân COG/KOG eukaryotic orthologous chuẩn: 3 loài động vật, 1 loài thực groups Group vật, Arabidopsis thaliana, 2 loài nấm và các ký sinh trùng nội bào Cơ sở dữ liệu CSDL 2'-deoxyadenosine 5'2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate dATP triphosphate 2'-deoxycytidine 5'2'-deoxycytidine 5'-triphosphate dCTP triphosphate 2'-deoxyguanosine 5'2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate dGTP triphosphate Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNA Acid 3,5-Dinitrosalicylic DNS/DNSA 3,5-Dinitrosalicylic 2’-deoxyribonucleoside 5’2’-deoxyribonucleoside 5’dNTP triphosphate triphosphate 2'-deoxythymidine 5'2'-deoxythymidine 5'-triphosphate dTTP triphosphate Ethylene diamine tetraacetic Axit ethylene diamine tetraacetic EDTA acid Endoglucanase Endoglucanase EGC Evolutionary genealogy of Cơ sở dữ liệu chứa các nhóm genes: Non-supervised eggNOG orthologous Orthologous Groups Một trong 3 tiểu đơn vị chính của Endoglucanase E cellulosome ở Clostridium EngE cellulovorans Emultion PCR PCR nhũ tương ePCR expressed sequence tag Trình tự cDNA ngắn EST FragGeneScan Phần mềm dự đoán gen FGS Cel9A 11 Kb Km LB Gigabyte Glycoside hydrolase Histidin High performance liquid chromatography High Throughput Sequencing Integrated Microbial Genomes Isopropy-β-Dthiogalactosidase International Union of Biochemistry and Molecular Biology Kilo base Kilodalton Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Kilobase Michaelis constant Luria-Betani LBA Luria-Betani ampicillin Mb Megabyte MEGAN MEtaGeneomic ANalyser MGA MetaGeneAnnotator MGM MetaGeneMark Gb GH His (H) HPLC HTS IMG IPTG IUBMB Kb kdal KEGG MG-RAST NCBI Metagenomic Rapid Annotations using Subsystems Technology National Center for Biotechnology Information 12 FragGeneScan Gigabyte Glycoside hydrolase Axit amin histidin Sắc ký lỏng hiệu năng cao Giải trình tự thông lượng cao Cơ sở dữ liệu tích hợp hệ gen vi sinh vật Chất cảm ứng Isopropy-β-Dthiogalactosidase Liên minh Quốc tế về Hóa sinh và Sinh học phân tử Kilo base Đơn vị đo trọng lượng của protein Cơ sở dữ liệu về hệ gene, enzyme và các sản phẩm sinh học Kilobase Hằng số Michaelis Môi trường nuôi cấy LB Môi trường nuôi cấy LB bổ sung ampicillin Megabyte Phần mềm phân tích trình tự đa hệ gene MEGAN Phần mềm dự đoán gene MetaGeneAnnotato Phần mềm dự đoán gene MetaGeneMark Cơ sở dữ liệu để dự đoán chức năng gene và đa dạng sinh vật Trung tâm thông tin về Công nghệ Sinh học của Mỹ NGS Next-Generation Sequencing Đọc trình tự bằng máy thế hệ mới NR Non-Redundant OD OPH ORF PCR Optimal density Orphelia Open Reading Frame Polymarase Chain Reaction PE pair-end PFAM pNPG protein families p-nitrophenol-β-glucoside 4-nitrophenyl β-Dxylopyranoside Prodigal quantitative PCR (real -time PCR) Rapid Annotation using Subsystem Technology pNPX PRD qPCR RAST RDP Ribosomal Database Project RNA SDS Ribonucleic acid Sodium dodecyl sulphate SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE SE SMF TEMED w/v Vmax single-end read Sequencing and Microarray Facility N, N, N’, N’tetramethylethylenediamine Weight/volume Maximum velocity 13 Cơ sở dữ liệu chứa các trình tự non-redundant từ cơ sở dữ liệu NCBI Mật độ quang học Phần mềm dự đoán gene Khung đọc mở Phản ứng trùng hợp Read có cả hai đầu tương đồng với contig Cơ sở dữ liệu các họ protein p-nitrophenol-β-glucoside 4-nitrophenyl β-D-xylopyranoside Phần mềm dự đoán gene Prodigal PCR định lượng Công nghệ dự đoán hệ gene vi khuẩn và vi khuẩn cổ Cơ sở dữ liệu trình tự rRNA tiểu đơn vị nhỏ của vi khuẩn và vi khuẩn cổ Axit ribonucleic Sodium dodecyl sulphate Điện di trên gel polyacrylamide biến tính Read có một đầu tương đồng với contig Cơ sở dữ liệu trình tự N, N, N’, N’tetramethylethylenediamine Khối lượng/thể tích Vận tốc tối đa DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tỷ lệ của cellulose, hemicellulose và lignin trong sinh khối lignocellulose. ........................................................................................... 22 Bảng 1.2. Các nhóm cellulase chính của vi khuẩn. .................................................. 29 Bảng 3.1. Tỷ lệ tương đồng và sai khác về trình tự nucleotide giữa các vùng 430 bp gen rRNA 16S ti thể mối Coptotermes thu thập từ 6 địa điểm. .. 81 Bảng 3.2. Mức độ tương đồng vùng trình tự 430 bp gen rRNA 16S ti thể của 6 mẫu mối Coptotermes với trình tự tương ứng của cơ sở dữ liệu NCBI. ..... 83 Bảng 3.3. Mức độ tương đồng vùng trình tự 126 bp gen rRNA 16S của 2 mẫu mối Coptotermes với trình tự tương ứng của cơ sở dữ liệu NCBI. ......... 83 Bảng 3.4. Các tham số trình tự nucleotide của DNA đa hệ gen vi khuẩn trong C. gestroi được tập hợp bằng phần mềm SOAPdenovo. .......................... 89 Bảng 3.5. Kết quả dự đoán gen................................................................................. 89 Bảng 3.6. Kết quả so sánh các read chất lượng cao với các CSDL hệ gen. ............ 90 Bảng 3.7. Đa dạng vi sinh vật ruột mối C. gestroi được dự đoán bằng MEGAN dựa vào CSDL NR (non-redundant database) của NCBI. ....................... 91 Bảng 3.8. Đa dạng taxon của 7 ngành vi khuẩn chiếm ưu thể nhất sống trong ruột mối C. gestroi. ................................................................................. 93 Bảng 3.9. Các ORF của vi khuẩn sống trong ruột C. gestroi nghiên cứu mã hóa enzyme thuộc các họ GH có khả năng phân hủy cellulose. ......................... 99 Bảng 3.10. Các ORF mã hóa cellulase của vi sinh vật sống trong ruột C. gestroi. .... 100 Bảng 3.11. Sự tương đồng trình tự nucleotide 5 ORF hoàn thiện của vi khuẩn sống trong ruột C. gestroi mã hóa endoglucanase với trình tự của các gen tương ứng của NCBI. ...................................................................... 102 Bảng 3.12. Sự tương đồng trình tự axit amin của các ORF vi sinh vật sống trong ruột C. gestroi mã hóa endoglucanase với trình tự tương ứng của NCBI. 102 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá hàm lượng protein EGC được tinh chế. .................. 123 Bảng 3.14. Kết quả đánh giá hàm lượng protein EGC được tinh chế ở phân đoạn 5... 123 14 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose . .................................................................... 21 Hình 1.2. Cấu trúc tinh thể và vô định hình của cellulose.. ..................................... 23 Hình 1.3. Cơ chế phân hủy/khử polime hóa cellulose bằng cellulase...................... 25 Hình 1.4. Hoạt động của exoglucanase Cel7A ở Trichoderma reesei. .................... 26 Hình 1.5. Một mô hình cấu trúc cellulosome của C. cellulovorans.. ....................... 28 Hình 1.6. Sơ đồ chuyển hóa sinh khối lignocellulose thành cồn sinh học. .............. 35 Hình 1.7. Sự phân loại các ngành vi khuẩn ruột sau của 2 loài mối bậc thấp. ......... 37 Hình 1.8. Sự phân hủy cellulose của mối bậc thấp.. ................................................ 38 Hình 1.9. Các phương pháp chính tiếp cận của Metagenomics để tìm gen mới. ..... 42 Hình 1.10. Các bước cơ bản của quá trình giải trình tự DNA bằng máy giải trình tự thế hệ mới của Illumina. .................................................................... 46 Hình 1.11. Hai sơ đồ tạo contig... ............................................................................. 47 Hình 2.1. Các bước cơ bản trong nghiên cứu của đề tài. ......................................... 58 Hình 2.2. Các bước tách vi khuẩn ruột mối từ mối thợ. ........................................... 60 Hình 2.3. Đường chuẩn BSA ................................................................................... 69 Hình 2.4. Đường chuẩn glucose. .............................................................................. 70 Hình 2.5. Đường chuẩn pNG được đo ở bước sóng 410 nm ................................... 71 Hình 2.6. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất theo Lineweaver-Burk. .................................................................................. 73 Hình 2.7. Các bước phân tích và khai thác gen từ dữ liệu DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối Coptotermes. ................................................................ 74 Hình 3.1. Các địa điểm thu thập mối để nghiên cứu. ............................................... 77 Hình 3.2. Mối thu thập ở phường Văn Quán, quận Hà Đông, Hà Nội .................... 78 Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm tách chiết DNA hệ gen của mối nghiên cứu trên gel agarose 0,8%.. .................................................................................. 79 Hình 3.4. Điện di đồ hỗn hợp sản phẩm PCR khuếch đại các đoạn gen mã hóa rRNA 16S ti thể mối bằng cặp mồi thứ nhất ......................................... 80 Hình 3.5. Cây phát sinh loài giữa 6 mẫu mối nghiên cứu và 21 loài khác được xây dựng dựa trên các trình tự có mức độ tương đồng cao nhất với đoạn DNA kích thước 430 bp. .............................................................. 82 15 Hình 3.6. Cây phát sinh loài giữa 2 mẫu mối nghiên cứu và 31 loài khác được xây dựng dựa trên các trình tự tương đồng cao nhất với vùng DNA kích thước 126 bp. ................................................................................. 85 Hình 3.7. Điện di đồ DNA đa hệ gen của hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi trên gel agarose 0,8%.......................................................................................... 87 Hình 3.8. Tỷ lệ % của 7 bảy ngành vi khuẩn chiếm ưu thế nhất có mặt trong ruột mối C. gestroi nghiên cứu. .................................................................... 94 Hình 3.9. Số ORF của 12 bộ vi khuẩn chiếm ưu thế nhất trong ruột mối C. gestroi nghiên cứu. ................................................................................ 94 Hình 3.10. Các lớp chức năng của các ORF tham gia con đường sinh học được dự đoán dựa vào sơ sở dữ liệu KEGG. .................................................. 97 Hình 3.11. Phân tích cây phát sinh loài giữa EGC và các endogucanase dựa trên sự tương đồng về trịnh tự axit amin.. .................................................. 103 Hình 3.12. Dự đoán chức năng của trình tự ORF GL0130684 bằng BlastP với cơ cở dữ liệu gen của NCBI.. ................................................................... 104 Hình 3.13. Mô hình cấu trúc 3D của EGC được xử lý bằng phần mềm Phyre2.. .. 104 Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen wegc trên gel agarose 0,8%.. .... 106 Hình 3.15. Điện di đồ sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ hợp pJET-wegc trên gel agarose 0,8%. ................................................................................. 107 Hình 3.16. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm cắt DNA plasmid tái tổ hợp pJET-wegc trên gel agarose 0,8%. ......................................................................... 108 Hình 3.17. So sánh trình tự axit amin của ORF GL013068 và của đoạn DNA phân lập được từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi.......... 109 Hình 3.18. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện mang gen egc. ..................................... 110 Hình 3.19. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen egc từ khuôn là gen wegc trên gel agarose 0,8%. ......................................................................... 111 Hình 3.20. Cấu trúc 3D của trình tự axit amin gen egc được thiết lập bằng phần mềm Phyre 2 ........................................................................................ 112 Hình 3.21. Điện di đồ sản phẩm cắt gen egc và mở vòng vector pET22b(+) bằng cặp enzyme hạn chế NcoI/XhoI trên gel agarose 0,8%.. ..................... 113 Hình 3.22. Điện di đồ kiểm tra plasmid . ............................................................... 113 Hình 3.23. Điện di đồ protein tổng số từ sản phẩm biểu hiện gen egc trong chủng E. coli BL21(DE3) ở môi trường LBA, nhiệt độ 37oC, sau 4 giờ cảm 16 ứng 0,5 mM IPTG ở 3 dòng tế bào khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS. ........................................................... 114 Hình 3.24. Điện di đồ protein kiểm tra khả năng tan của protein EGC biểu hiện trong chủng E. coli BL21(DE3), môi trường LBA ở 37oC sau 4 giờ cảm ứng 0,5 mM IPTG trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS.. ...... 115 Hình 3.25. Điện di đồ protein EGC biểu hiện trong chủng E. coli BL21(DE3) sau 4 giờ cảm ứng 0,5 mM IPTG ở 20oC, 25oC, 30oC và 37oC trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS.. .......................................................... 116 Hình 3.26. Mật độ tế bào biểu hiện E. coli BL21(DE3) mang pET22-egc cảm ứng IPTG ở các nồng độ từ 0,0 đến 2,0 mM. ...................................... 117 Hình 3.27. Điện di đồ protein EGC biểu hiện ở 20oC trong tế bào E. coli BL21(DE3) cảm ứng 10 nồng độ IPTG khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS.. .......................................................... 118 Hình 3.28. Điện di đồ protein EGC biểu hiện ở 20oC trong tế bào E. coli BL21(DE3) trên gel polyacrylamide 9% không có SDS. ................... 119 Hình 3.29. Biểu đồ sắc ký tinh chế protein EGC bằng cột sắc ký ái lực His-tag... 120 Hình 3.30. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm trong các phân đoạn tinh chế enzyme EGC bằng cột sắc kí ái lực His-tag trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS. ...... 121 Hình 3.31. Điện di đồ protein tinh chế trên gel polyacrylamid 9%-0,1% CMC không có SDS.. .................................................................................... 122 Hình 3.32. Phân tích độ sạch của sản phẩm tinh chế protein EGC bằng cột sắc kí ái lực His-tag trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS. ....................... 124 Hình 3.33. Hoạt tính endoglucanase trên các cơ chất khác nhau. .......................... 125 Hình 3.34. Ảnh của nhiệt độ đến hoạt tính endoglucanase của EGC. ................... 126 Hình 3.35. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính endoglucanase của EGC ở 40oC. .... 127 Hình 3.36. Hoạt tính của EGC khi xử lý ở các nhiệt độ khác nhau……………...126 Hình 3.37. Ảnh hưởng của ion kim loại và một số hóa chất lên hoạt tính endoglucanase của EGC. ..................................................................... 129 Hình 3.38. Ảnh hưởng nồng độ Co2+ đến phần trăm hoạt tính endoglucanase của EGC. .................................................................................................... 131 Hình 3.39. Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng của enzyme vào nồng độ cơ chất CMC theo Linewever-Burk. ................................................................ 132 17 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cellulase là nhóm enzyme được sử dụng phổ biến trong các ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, chế biến thức ăn, sản xuất giấy, sản xuất rượu, sản xuất bia, công nghệ dệt…. Đặc biệt, cellulase đang được quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học [8] như cồn sinh học từ nguồn phế phẩm lignocellulose dồi dào thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch đang trên đà cạn kiệt. Trong vòng hơn 25 năm qua, sản lượng cồn sinh học đã tăng trưởng và đạt mức nhảy vọt kể từ năm 2000. Cồn sinh học có thể được dùng như nguồn nhiên liệu độc lập cho các loại xe có động cơ chuyên biệt hoặc làm phụ gia nhiên liệu cho loại xe có động cơ truyền thống với tỉ lệ lên đến 30% [126]. Ở nước ta, ước tính hàng năm, nguồn nguyên liệu lignocellulose từ phế phẩm nông nghiệp như rơm, rạ, lá mía và bã cây mía bỏ phí lên đến 50 triệu tấn. Biện pháp xử lý nguồn phế phẩm này chủ yếu là đốt đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến môi trường sống và sức khoẻ con người [32, 135]. Việc tận dụng được nguồn nguyên vật liệu lignocellulose phế phẩm này vào sản xuất cồn sinh học sẽ đem đến nhiều lợi ích to lớn cho môi trường cũng như cho nền kinh tế của nước ta. Việc sử dụng cellulase thay thế các hóa chất truyền thống như axit, kiềm và nhiệt độ cao vào trong quá trình sản xuất của các ngành công nghiệp đã giải quyết được nhiều vấn đề như hạn chế ô nhiễm môi trường, tiết kiệm năng lượng và bảo vệ được sức khoẻ người lao động cũng như tăng hiệu quả sản xuất. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là cần thiết phải có được nguồn cellulase hoạt động ở điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp cho các quá trình sản xuất đó [95]. Hơn nữa, việc sản xuất cồn sinh học đang gặp một số khó khăn trong việc giảm chi phí sản xuất đặc biệt là nguồn cellulase để phân cắt cellulose thành glucose hiệu quả [62, 154]. Do đó, vấn đề quan trọng nhất là tìm ra được nguồn cellulase mới phù hợp với điều kiện sản xuất của các ngành công nghiệp liên quan, phát triển các phức hợp cellulase hiệu quả và ổn định để khắc phục khó khăn trong quá trình sản xuất. Metagenomics là kỹ thuật cho phép thu nhận trực tiếp DNA đa hệ gen của toàn bộ các vi sinh vật trong môi trường sống nhất định [44, 121]. Chính vì lợi thế 18 là thu nhận và phân tích được tất cả hệ gen của vi sinh vật phong phú và đa dạng, đặc biệt là 99% vi sinh vật chưa nuôi cấy được [4] mà Metagenomics trở thành công cụ giúp các nhà nghiên cứu khai thác nguồn gen mới hiệu quả nhất. Thực tế đã chứng minh, sau 20 năm phát triển, đặc biệt là khoảng 5 năm gần đây, khi kỹ thuật giải mã gen thế hệ mới được áp dụng, Metagenomics đã được sử dụng rất hiệu quả để tìm hiểu sự đa dạng vi sinh vật cũng như khai thác các gen mới từ nhiều môi trường sống khác nhau như nước, đất, sinh vật (các đường tiêu hóa), phế thải, … Mối đóng một vai trò quan trọng đối với hệ sinh thái bởi khả năng phân hủy sinh khối lignocellulose và góp phần vào chu trình carbon. Khả năng phân hủy hiệu quả lignocellulose của mối là kết quả hoạt động tổng hợp của cellulase và hemicellulase được tiết ra từ bản thân mối và từ vi sinh vật sống trong ruột mối. Trong đó, hệ vi sinh vật ruột mối đóng vai trò quan trọng trong việc tiêu hóa hiệu quả nguồn thức ăn lignocellulose của mối [16, 68]. Vì vậy, vi sinh vật ruột mối mang nguồn gen mã hóa enzyme phong phú cần được khai thác nhằm tìm ra các cellulase mới liên quan đến sự phân hủy cellulose. Ở Việt Nam, cho đến nay, hơn 100 loài mối khác nhau đã được mô tả [1, 45]. Tuy nhiên, hệ vi sinh vật của chúng vẫn chưa được nghiên cứu. Vì thế toàn bộ hệ enzyme thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi sinh vật trong ruột mối cũng chưa được điều tra và khảo sát. Với đặc điểm đặc trưng của quần xã vi sinh vật sống trong ruột mối và vai trò của chúng giúp vật chủ phân hủy thức ăn, quần xã vi sinh vật ở mối bậc thấp được xem là nguồn khai thác gen cellulase mới lý tưởng sử dụng trong quá trình thủy phân cellusose. Mặc dù, trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu về gen cellulase của vi sinh vật ruột mối bậc thấp, nhưng tất cả đều tập trung nghiên cứu sự đa dạng của động vật nguyên sinh và nguồn gen của chúng, rất ít nghiên cứu nào đánh giá sự đa dạng của vi khuẩn cũng như sự đa dạng gen cellulase của chúng ở môi trường ruột mối bậc thấp. Chính vì vậy, bằng kỹ thuật Metagenomics với hướng tiếp cận là giải trình tự đa hệ gen, chúng tôi lựa chọn đối tượng là vi khuẩn ruột mối bậc thấp thuộc chi Coptotermes để thực hiện đề tài “Nghiên cứu gen mã hóa enzyme tham gia thủy phân cellulose từ khu hệ vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics”. 19 2. Mục tiêu của đề tài Phân lập, tách dòng và biểu hiện được 1 gen mã hóa cellulase từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối bằng kỹ thuật Metagenomics. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng là vi khuẩn ruột mối thuộc chi Coptotermes. Mối do Viện Sinh thái và Bảo vệ công trình cung cấp. 4. Nội dung nghiên cứu (1) Tách chiết DNA đa hệ gen của vi khuẩn ruột mối Coptotermes. (2) Giải trình tự và xử lý trình tự DNA đa hệ gen. (3) Từ bộ dữ liệu trình tự DNA đa hệ gen, dự đoán gen và chú thích gen theo hai khía cạnh là đa dạng sinh vật và chức năng. (4) Chọn 1 trình tự gen để thiết kế mồi, phân lập, tách dòng và biểu hiện. (5) Xác định đặc điểm của sản phẩm biểu hiện gen phân lập được. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học (1) Đã phân lập, tách dòng và biểu hiện được 1 gen mã hóa endoglucanase từ DNA đa hệ gen của vi khuẩn ruột mối Coptotermes gestroi. (2) Đã đánh giá được sự đa dạng vi khuẩn và đa đạng gen cellulase của vi khuẩn sống trong ruột mối C. gestroi ở Việt Nam. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần đánh giá tiềm năng và khả năng sử dụng nguồn gen mã hóa endoglucanase từ vi khuẩn ruột mối C. gestroi ở Việt Nam vào quá trình phân giải cơ chất cellulose thuộc một số lĩnh vực trong các ngành công nghiệp. 6. Đóng góp mới của đề tài (1) Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam ứng dụng kỹ thuật Metagenomics để tìm hiểu sự đa dạng vi khuẩn trong ruột mối Coptotermes và bước đầu phân lập được gen mã hóa protein có hoạt tính endoglucanase từ DNA đa hệ gen vi khuẩn ruột mối C. gestroi. 20