Tài liệu Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy nấm men rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận beta carotene

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN RHODOTORULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ĐỂ THU NHẬN BETA CAROTENE CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ SỐ NGÀNH: 2.11.00 GVHD: PGS.TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO HVTH: TẠ ĐĂNG KHOA TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 07 NĂM 2008 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM  Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO Ký tên: ............................................ Cán bộ chấm nhận xét 1: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Ký tên: ............................................ Cán bộ chấm nhận xét 2: PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN Ký tên: ............................................ LUẬN VĂN THẠC SĨ ĐƯỢC BẢO VỆ TẠI HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Ngày ........... tháng ........... năm 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH -----o0o----- CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc -----o0o----- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: TẠ ĐĂNG KHOA Ngày, tháng, năm sinh: 15/12/1983 Chuyên ngành: Khoa học và Công Nghệ Thực Phẩm Phái: NAM Nơi sinh: ĐỒNG THÁP MSHV: 01106254 I. TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN RHODOTORULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ĐỂ THU NHẬN BETA CAROTENE II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Chọn môi trường thích hợp và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh beta carotene của nấm men Rhodotorula sp.CBS10104. - Tìm hiểu một số phương pháp chiết tách beta carotene phù hợp. - Nghiên cứu, tối ưu hóa các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy bán rắn. - Tạo beta carotene theo thời gian và sản xuất thử nghiệm sản phẩm bột màu từ canh trường nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp .CBS1010. III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2008 IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/07/2008 V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO PGS.TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua. TRƯỞNG PHÒNG ĐT-SĐH Ngày ........ tháng ........ năm 2008 TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH TS PHẠM THÀNH QUÂN LỜI CẢM ƠN Để được kết quả như ngày hôm nay, với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành gởi đến:  Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Đống Thị Anh Đào đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm sống quý báu cho em trong suốt thời gian học, cũng như trong quá trình thực hiện luận văn.  Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Nguyệt đã quan tâm, hỗ trợ và giúp đỡ tôi rất nhiều để có thể hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này  Ban giám hiệu trường Đại Học Bách Khoa TpHCM, quý Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm: đã giảng dạy, hướng dẫn để tôi có được nền kiến thức như ngày hôm nay.  Quý Thầy Cô phụ trách phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Đặc biệt là Cô Nguyễn Thị Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tại phòng thí nghiệm.  Các anh chị, các bạn học viên cao học niên khóa 2006 ngành Công Nghệ Thực Phẩm, Công Nghệ Sinh Học, và các bạn sinh viên trường Đại Học Công Nghiệp TpHCM đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn.  Lời cám ơn cuối cùng xin dành cho gia đình tôi, ba mẹ, chị hai, anh Trương Văn Luật là nguồn động viên, an ủi, chia sẻ và giúp đỡ tôi về vật chất cũng như tinh thần giúp tôi thêm nghị lực đi hết đoạn đường đã qua. Xin chân thành cảm ơn ! TpHCM, Tháng 07 Năm 2008 TẠ ĐĂNG KHOA . TÓM TẮT -i- NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN RHODOTORULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ĐỂ THU NHẬN BETA CAROTENE Quá trình lên men bán rắn từ nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 đã tạo được hướng đi mới trong việc tận dụng các nguồn phụ phẩm rẻ tiền trong sản xuất nông nghiệp và ngành công nghiệp thực phẩm thành các chế phẩm giàu dinh dưỡng và hàm lượng beta carotene. Mục tiêu nghiên cứu: tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận beta carotene. Bước đầu chúng tôi đã đạt được một số kết quả khả quan khi thu nhận được 258,168 ppm beta carotene /g canh trường khô (bằng phương pháp đo quang UV Vis) sau 7 ngày nuôi cấy với các điều kiện sau:  Gạo tấm phụ phẩm ngâm 24 giờ, pH 3,0 trước khi hồ hóa.  Thành phần môi trường nuôi cấy gồm cơm tấm : bã đậu nành : dầu ăn theo tỷ lệ 97% (w/w) : 3% (w/w) : 1% (v/w).  Nồng độ khoáng tối ưu (µg/100g cơ chất): N = 3500, P = 1000, S = 841,3  Điều kiện nuôi cấy tối ưu với các thông số ban đầu pH = 5.5, độ ẩm = 60% và mật độ cấy giống = 7,225.x107 CFU/g cơ chất.  Phương pháp phá mẫu hiệu quả được xác định là sự kết hợp giữa lạnh đông chậm -2 ÷ 0oC, trong thời gian 24h; sốc nhiệt 50oC trong bể điều nhiệt với thời gian 4 ÷ 6 phút và đánh siêu âm trên máy Vibra Cell VCX 500 trong thời gian 15 phút 5 phút họat động và 10 giây nghỉ (pulse 5, pulse off 10s) – có bổ sung bột thủy tinh với tỷ lệ 1:2 trong điều kiện giữ lạnh mẫu trong nước đá, tránh ánh sáng bằng giấy bạc, nhiệt độ đánh mẫu là 4oC, mức biên độ năng lượng (amplitude) là 50%.  Hệ dung môi dung môi chiết tách Acetonitrile : 2 – propanol : ethyl acetate tỉ lệ 4 : 4 : 2 ở bước sóng 454nm. GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . TÓM TẮT - ii - Sau quá trình nghiên cứu. Thu toàn bộ canh trường bước đầu tạo sản phẩm bột màu giàu beta carotene. Sản phẩm thu được có độ ẩm 12,81%, đạt hàm lượng beta-carotene 198,091 ppm/g chế phẩm khô. GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . ABSTRACT - iii - STUDYING THE EFFECT OF CULTURE CONDITIONS ON COLLECTING BETA CAROTENE FROM THE RED YEAST RHODOTORULA SP IN SOLID - STATE FERMENTATION. In this research, we have studied a new technique of solid - state fermentation from the red yeast Rhodotorula sp.CBS10104 which uses cheap residuals from agricultural production and food industry to make products with high nutrition and beta carotene. The purpose of this research is to find out the effects of cultures on collecting beta carotene from the solid - state fermentation and achieving initial success. We have collected 258,168 ppm beta carotene/ g dried culture (UV Vis method) after cultivating in 7 days with these conditions:  The by-product broken rice is soaked in 24 hours, pH 3,0 before being starched  The composition of culture cultivating the red yeast Rhodotorula sp consists of starched broken rice, cooking oil, soybean residue. They are chosen with the 97% (w/w) : 3% (w/w) : 1% (v/w) ratio.  The optimal mineral content (µg/100g substances) is: N: 3500; P: 1000; S: 841.3  The optimal cultivating conditions which we achieved initially are pH: 5.5, the culture’s moisture: 60%, and the yeast density: 7.625x107 CFU/g substances.  The effective cell-disrupting method is the combination between the slow freeze in 24 hours at -2 ÷ 0oC; thermal shock in the temperatue-controlling box at 50oC in 4 to 6 minutes and ultrasonic processing of Vibracell VCX 500 in 15 minutes at 4oC - pulse on in 5 minutes and off in 10 seconds – with the amplitude 50%, the presence of glass beads of the 1:2 ratio in the sample to provide extra shearing action, keep the sample cold with ice and keep away from the light by the silver paper. GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . ABSTRACT - iv -  To extract the beta carotene, we use the mixture of solvens with the ratio 4 : 4 : 2 of Acetonitrile : 2 – propanol : ethyl acetate at the wave length 454nm. After the hard-working time of the research, we have made the raw pigment powder from the culture of the solid-state fermentation. The red yeast Rhodotorula sp culture powder which we achieved has the content of 12.81% moisture and 198.091 ppm beta-carotene/g of dried culture. GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . MỤC LỤC -v- MỤC LỤC  MỞ ĐẦU ................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................3 1.1. Nấm men Rhodotorula ............................................................................ 3 1.1.1. Tổng quan về nấm men ......................................................................... 3 1.1.1.1. Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men ....................................... 3 1.1.1.2. Dinh dưỡng nấm men............................................................................. 3 1.1.1.3. Sự sinh sản của nấm men ....................................................................... 7 1.1.2. Nấm men Rhodotorula.............................................................................. 9 1.1.2.1 Giới thiệu ................................................................................................ 9 1.1.2.2. Hình dạng và kích thước ........................................................................ 10 1.1.2.3. Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula ..................................... 12 1.1.2.4. Đặc điểm sinh hóa.................................................................................. 15 1.2. Beta carotene (β-Carotene) ......................................................................... 16 1.2.1. Giới thiệu về Carotenoids ........................................................................ 16 1.2.1.1. Tổng quan về Carotenoids ................................................................... 16 1.2.1.2. Cơ chế Sinh tổng hợp carotenoids trong sinh vật ................................. 20 1.2.2. Giới thiệu về β-Carotene .......................................................................... 27 1.2.2.1. Giới thiệu về β-Carotene ....................................................................... 27 1.2.2.2. Tính chất ................................................................................................ 27 1.2.2.3. Sinh tổng hợp β-Carotene ..................................................................... 29 1.2.2.4. Các phương pháp thu nhận và tách chiết sắc tố beta carotene............... 31 1.2.2.5. Sinh tổng hợp vitamin A ....................................................................... 35 1.2.2.6. Tầm quan trọng của β-Carotene đối với sức khỏe ................................ 36 1.3. Lên men bán rắn (Solid State Fermentation: SSF) ..................................... 36 1.3.1. Khái quát về lên men bán rắn ................................................................... 36 1.3.1.1. Các loại vi sinh vật sử dụng trong lên men bán rắn .............................. 37 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . MỤC LỤC - vi 1.3.1.2.Các cơ chất thường dùng trong lên men bán rắn ................................... 37 1.3.1.3.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bề mặt ............................ 38 1.3.2. Các ứng dụng và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi bán rắn với nấm men Rhodotorula sp ........................................................................................... 39 1.3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen ............................................................. 40 1.3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn carbon ............................................................... 41 1.3.2.3. Vai trò của các muối ............................................................................. 41 1.3.2.4. Ảnh hưởng của các chất tự nhiên và dầu bổ sung vào .......................... 42 1.3.2.5. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình lên men bán rắn ....... 42 1.3.2.6. So sánh SSF với quá trình lên men trên môi trường lỏng ..................... 44 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 45 2.1. Nguyên liệu – giống vi sinh vật và môi trường .......................................... 45 2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 45 2.1.2. Giống vi sinh vật và môi trường .............................................................. 46 2.1.2.1. Nguồn giống .......................................................................................... 46 2.1.2.2. Môi trường giữ giống nấm men ............................................................ 47 2.1.2.3. Môi trường hoạt hóa nấm men .............................................................. 47 2.1.2.4. Môi trường nuôi cấy bán rắn ................................................................. 48 2.1.3. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ .................................................................... 48 2.1.3.1. Hóa Chất ................................................................................................ 48 2.1.3.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................ 48 2.2.Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 50 2.2.1. Các phương pháp phân tích, thu nhận, xử lí các chỉ tiêu dùng trong nghiên cứu .......................................................................................................... 50 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................. 51 2.2.2.1. Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 ............... 51 2.2.2.2. Thuyết minh quy trình nuôi cấy............................................................. 52 2.2.3. Các thí nghiệm tiến hành........................................................................... 53 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . MỤC LỤC - vii 2.2.3.1. Thí nghiệm 1: Chọn hệ dung môi chiết tách Beta Carotene thích hợp 53 2.2.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn thích hợp đến khả năng sinh beta carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104.... 54 2.2.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm gạo đến khả năng sinh Beta Carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104 ............... 56 2.2.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát các phương pháp chiết màu phù hợp .............. 58 2.2.3.5. Thí nghiệm 5: Tối ưu hóa hàm lượng khoáng đến khả năng sinh beta Carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104 ............................................... 62 2.2.3.6. Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa các yếu tố pH, ẩm độ, mật độ giống cấy đến khả năng sinh beta carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104 ................ 64 2.2.3.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát sự thay đổi ẩm, pH và khả năng tạo beta carotene theo thời gian trên các điều kiện đã khảo sát và bước đầu ứng dụng sản xuất sản phẩm bột màu giàu beta carotene ................................................... 66 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................. 68 3.1.Thí nghiệm 1: Chọn hệ dung môi chiết tách thích hợp và xây dựng đường chuẩn beta carotene trên hệ dung môi tìm được ............................................... 68 3.1.1. Chọn hệ dung môi chiết tách thích hợp ................................................... 68 3.1.2. Xây dựng đường chuẩn Beta Carotene trên hệ dung môi: Acetonitrile : iso - propanol : ethyl acetate = 4 : 4 : 2 ............................................................. 74 3.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn thích hợp đến khả năng sinh beta carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104 ... 75 3.2.1. Khảo sát các thành phần tỷ lệ môi trường nuôi cấy thích hợp ................ 76 3.2.2. Khảo sát các tỷ lệ bã đậu nành bổ sung ................................................... 78 3.3.Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH và thời gian ngâm đến khả năng sinh Beta Carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104 ...................... 81 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát các phương pháp chiết màu phù hợp .................... 86 3.5. Thí nghiệm 5: Tối ưu hóa hàm lượng khoáng đến khả năng sinh beta Carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104 ............................................... GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO 90  TẠ ĐĂNG KHOA . MỤC LỤC - viii 3.5.1. Thí nghiệm sơ khởi .................................................................................. 90 3.5.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đạm (N) đến khả năng sinh beta carotene .............................................................................................................. 90 3.5.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng phospho (P) đến khả năng sinh beta carotene ....................................................................................................... 92 3.5.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng lưu huỳnh (S) đến khả năng sinh beta carotene ....................................................................................................... 93 3.5.2. Tối ưu hóa hàm lượng khoáng theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc 2 – Box Hunter ............................................................................... 94 3.5.2.1. Phương trình hồi qui ............................................................................. 96 3.5.2.2. Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui ............................. 97 3.5.2.3. Các điểm tối ưu của phương trình hồi qui ............................................ 97 3.5.2.4. Kết luận và nhận xét .............................................................................. 98 3.6. Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa các yếu tố pH, ẩm độ, mật độ giống cấy đến khả năng sinh beta carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104 ................. 99 3.6.1. Thí nghiệm sơ khởi .................................................................................. 99 3.6.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH canh trường đến khả năng sinh beta carotene .............................................................................................................. 99 3.6.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm canh trường đến khả năng sinh beta carotene .............................................................................................................. 100 3.6.1.3. Khảo sát ảnh hưởng mật độ giống cấy đến khả năng sinh beta carotene .............................................................................................................. 102 3.6.2.Tối ưu hóa pH, ẩm độ, mật độ giống cấy theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc 2 – Box Hunter ....................................................................... 103 3.6.2.1. Phương trình hồi qui ............................................................................. 105 3.6.2.2. Kiểm định sự tương thích của phương trình hồi qui ............................. 106 3.6.2.3. Các điểm tối ưu của phương trình hồi qui ............................................ 107 3.6.2.4. Kết luận và nhận xét .............................................................................. 107 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . MỤC LỤC - ix 3.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát sự thay đổi ẩm, pH và khả năng tạo beta carotene theo thời gian trên các điều kiện đã khảo sát ....................................... 108 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 115 4.1.Kết luận ......................................................................................................... 115 4.2. Kiến nghị ...................................................................................................... 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 118 PHỤ LỤC GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . DANH MỤC BẢNG -x- DANH MỤC BẢNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN Bảng 1.1 : Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula nuôi cấy trên môi trường thạch malt từ các nguồn phân lập khác nhau .............................................. 11 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng 2.1 : Phương pháp xác định các chỉ tiêu phân tích ....................................... 50 Bảng 2.2: Bảng các hệ dung môi chiết tách Beta Carotene .................................. 53 Bảng 2.3: Bảng phân phối nghiệm thức thí nghiệm 3 ( pH nước ngâm và thời gian ngâm) .............................................................................................................. 57 Bảng 2.4: Bảng các phương pháp chiết thí nghiệm 4 ........................................... 59 Bảng 2.5: Các quá trình cơ lý hóa cơ bản dùng trong thí nghiệm ......................... 60 Bảng 2.6: Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2; ba yếu tố N , P và S của Box – Hunter ............................................................................................ 63 Bảng 2.7: Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2; ba yếu tố pH, độ ẩm và mật độ cấy giống của Box – Hunter ....................................................... 65 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Bảng 3.1: Các hệ dung môi chiết tách Beta Carotene ............................................ 68 Bảng 3.2: Mối quan hệ giữa bước sóng hấp thu của các hệ dung môi A1 và A2 ở nồng độ 10, 20 ppm beta carotene chuẩn ............................................................... 69 Bảng 3.3: Mối quan hệ giữa bước sóng hấp thu của các hệ dung môi A3 và A4 ở nồng độ 10, 20 ppm beta carotene chuẩn ............................................................... 69 Bảng 3.4: So sánh mối quan hệ bước sóng hấp thu của các hệ dung môi ở mức nồng độ 10ppm chuẩn ............................................................................................ 70 Bảng 3.5: So sánh mối quan hệ bước sóng hấp thu của các hệ dung môi ở mức nồng độ 20 ppm beta carotene chuẩn ..................................................................... 71 Bảng 3.6: Bảng liên hệ giữa bước sóng và độ hấp thu của hệ dung môi A:P:E tỉ lệ 40:40:20 ở nồng độ 20 và 10 ppm beta carotene chuẩn ..................................... 72 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . DANH MỤC BẢNG - xi - Bảng 3.7: Giá trị OD 454 nm của chất chuẩn beta – carotene với các nồng độ tương ứng ............................................................................................................... 74 Bảng 3.8: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu của nguyên liệu ban đầu .................. 75 Bảng 3.9: Hàm lượng beta carotene thu nhận từ các môi trường nuôi cấy ........... 77 Bảng 3.10 : Bảng phân phối các tỷ lệ cơm tấm : bã đậu nành ................................ 79 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của các tỷ lệ bã đậu nành đến khả năng sinh beta carotene của nấm men Rhodotorula .CBS10104 ................................................... 79 Bảng 3.12 : Hàm lượng beta carotene trung bình qua phân tích ANOVA thu nhận từ thí nghiệm pH nước ngâm và thời gian ngâm ........................................... 82 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của pH ngâm đến hàm lượng beta carotene sinh ra trong quá trình nuôi bán rắn ............................................................................................ 83 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hàm lượng beta carotene sinh ra trong quá trình nuôi bán rắn ................................................................................... 84 Bảng 3.15: Bảng mã hóa nghiệm thức các phương pháp chiết .............................. 87 Bảng 3.16: Hàm lượng beta carotene trung bình qua phân tích ANOVA thu nhận từ các phương pháp chiết ....................................................................................... 88 Bảng 3.17: Ảnh hưởng các nồng độ khoáng nitơ đến hàm lượng beta carotene thu nhận ................................................................................................................ 90 Bảng 3.18: Ảnh hưởng các nồng độ khoáng phospho đến hàm lượng beta carotene thu nhận ................................................................................................... 92 Bảng 3.19: Ảnh hưởng các nồng độ khoáng lưu huỳnh đến hàm lượng beta carotene thu nhận ................................................................................................. 93 Bảng 3.20: Mức biến thiên của các yếu tố khoáng ................................................. 94 Bảng 3.21: Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2; ba yếu tố N , P và S của Box – Hunter ........................................................................................ 95 Bảng 3.22: Hàm lượng beta carotene /g CK theo số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng .................................................................................................................... 96 Bảng 3.23: Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng ........ 97 Bảng 3.24: Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng . 97 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . DANH MỤC BẢNG - xii - Bảng 3.25: Các phương sai và F theo các số liệu thực nghiệm tối ưu khoáng ...... 97 Bảng 3.26: Ảnh hưởng pH canh trường đến hàm lượng beta carotene thu nhận . 99 Bảng 3.27: Ảnh hưởng hàm ẩm canh trường đến hàm lượng beta carotene thu nhận ......................................................................................................................... 100 Bảng 3.28: Ảnh hưởng mật độ giống cấy đến hàm lượng beta carotene thu nhận . 102 Bảng 3.29: Mức biến thiên của các yếu tố khoáng ................................................. 103 Bảng 3.30: Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2; ba yếu tố pH, độ ẩm và mật độ cấy giống của Box – Hunter ....................................................... 104 Bảng 3.31: Hàm lượng beta carotene /g CK theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy giống ban đầu ....................................................................... 105 Bảng 3.32: Các hằng số bj theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy giống ban đầu ................................................................................................... 106 Bảng 3.33: Các hệ số hồi qui tj theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy giống ban đầu ....................................................................................... 106 Bảng 3.34. Các phương sai và F theo số liệu thực nghiệm tối ưu pH, độ ẩm và mật độ cấy giống ban đầu ....................................................................................... 106 Bảng 3.35: Sự thay đổi pH và độ ẩm theo thời gian trong quá trình nuôi bán rắn . 108 Bảng 3.36: Ảnh hưởng thời gian đến quá trình sinh tổng hợp beta carotene từ Rhodotorula sp.CBS10104 trên môi trường nuôi bán rắn ...................................... 110 Bảng 3.37: Kết quả phân tích chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm bột màu từ canh trường nuôi bán rắn nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 .................................... 112 Bảng 3.38: Bảng so sánh kết quả phân tích beta carotene theo ngày giữa phương pháp HPLC và phương pháp đo quang UV Vis ..................................................... 113 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . DANH MỤC HÌNH - xiii - DANH MỤC HÌNH CHƯƠNG I: TỔNG QUAN Hình 1.1: Tế bào nấm men sinh sản bằng phương pháp nẩy chồi ........................ 8 Hình 1.2: Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis.................................................. 9 Hình 1.3 : Các chủng nấm men sinh sắc tố Rhodotorula ..................................... 10 Hình 1.4.Khuẩn lạc Rh.mucilaginosa .................................................................. 12 Hình 1.5. Khuẩn lạc Rh.glutinis ........................................................................... 12 Hình 1.6: Khuẩn lạc Rh.rubra .............................................................................. 12 Hình 1.7: Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula .................. 15 Hình 1.8: Công thức cấu tạo của các carotenoid quan trọng ............................... 17 Hình 1.9 : Phân loại carotenoids .......................................................................... 19 Hình 1.10: Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị ... 21 Hình 1.11 : Con đường tổng hợp carotenoid ở thực vật và vi sinh vật ................ 22 Hình 1.12: Quá trình sinh tổng hợp IPP ............................................................... 23 Hình 1.13 : Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ IPP ....................................... 25 Hình 1.14 : Sơ đồ con đường sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men .................... 26 Hình 1.15: Công thức cấu tạo β-Carotene............................................................. 27 Hình 1.16: Cấu trúc không gian của beta-carotene............................................... 27 Hình 1.17 : Sự chuyển hóa của beta – carotene thành các chất khác.................... 29 Hình 1.18: Sinh tổng hợp β-Carotene do Badische Anilin- & Soda-Fabrik đề xuất ........................................................................................................................ 29 Hình 1.19: Sinh tổng hợp β-Carotene do F. Hoffman-La Roche & Co. Ltd đề xuất ....................................................................................................................... 30 Hình 1.20: Sinh tổng hợp vitamin A từ β-Carotene ............................................ 35 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 2.1: Gạo tấm thường và gạo tấm phụ phẩm ................................................ 45 Hình 2.2: Bã dừa sau khi vắt lấy nước ................................................................ 45 Hình 2.3: Bã đậu nành của công ty Vinamilk ....................................................... 46 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . DANH MỤC HÌNH - xiv - Hình 2.4: Khuẩn lạc chủng nấm men Rhodotorula sp.CBS10104 (MN12) trên môi trường thạch malt ................................................................................... 46 Hình 2.5: Cấy chuyền giữ giống trên môi trường thạch malt trong ống nghiệm................................................................................................................... 47 Hình 2.6: Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.CBS10104.............. 51 Hình 2.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ..................................................................... 55 Hình 2.8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ..................................................................... 58 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hình 3.1: Đồ thị liên hệ giữa bước sóng và độ hấp thu cực đại của các hệ dung môi khảo sát ở nồng độ 20 và 10 ppm beta carotene chuẩn ...................... 71 Hình 3.2: Đồ thị liên hệ giữa bước sóng và độ hấp thu của hệ dung môi A:P:E tỉ lệ 40:40:20 ở nồng độ 20 ppm Beta carotene chuẩn .............................. 73 Hình 3.3: Đồ thị liên hệ giữa bước sóng và độ hấp thu của hệ dung môi A:P:E tỉ lệ 40:40:20 ở nồng độ 10 ppm Beta carotene chuẩn .............................. 73 Hình 3.4 : Đồ thị đường tương quan tuyến tính giữa OD 454nm và hàm lượng beta carotene .............................................................................................. 74 Hình 3.5:Đồ thị hàm lượng beta carotene thu nhận từ các môi trường nuôi cấy ........................................................................................................................ 77 Hình 3.6: Đồ thị hàm lượng Beta - Carotene theo các tỷ lệ phối trộn bã đậu nành ...................................................................................................................... 80 Hình 3.7: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng Beta Carotene theo pH và thời gian ngâm ................................................................................................ 82 Hình 3.8: Đồ thị ảnh hưởng của pH nước ngâm đến hàm lượng beta carotene sinh ra trong quá trình nuôi bán rắn ..................................................................... 83 Hình 3.9: Đồ thị ảnh hưởng của thời gian ngâm đến hàm lượng beta carotene sinh ra trong quá trình nuôi bán rắn ..................................................................... 84 Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn hàm lượng beta carotene theo pH và thời gian ngâm ...................................................................................................................... 85 Hình 3.11: Đồ thị hàm lượng beta carotene theo các phương pháp chiết ............ 89 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA . DANH MỤC HÌNH - xv - Hình 3.12: Đồ thị mối liên hệ giữa hàm lượng beta carotene thu nhận với các nồng độ khoáng nitơ ............................................................................................. 91 Hình 3.13: Đồ thị mối liên hệ giữa hàm lượng beta carotene thu nhận với các nồng độ khoáng phospho ..................................................................................... 92 Hình 3.14: Đồ thị mối liên hệ giữa hàm lượng beta carotene thu nhận với các nồng độ khoáng lưu huỳnh ................................................................................... 93 Hình 3.15: Đồ thị mối liên hệ giữa hàm lượng beta carotene thu nhận với các mức độ pH canh trường ........................................................................................ 100 Hình 3.16: Đồ thị mối liên hệ giữa hàm lượng beta carotene thu nhận với hàm ẩm canh trường ............................................................................................. 101 Hình 3.17: Đồ thị mối liên hệ giữa hàm lượng beta carotene thu nhận với mật độ giống cấy ......................................................................................................... 102 Hình 3.18: Đồ thị sự thay đổi pH theo thời gian trong quá trình nuôi bán rắn .... 109 Hình 3.19:Đồ thị sự thay đổi độ ẩm theo thời gian trong quá trình nuôi bán rắn.......................................................................................................................... 109 Hình 3.20: Đồ thị quá trình sinh tổng beta carotene theo thời gian ..................... 110 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Hình 4.1: Qui trình nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.CBS10104......... 115 GVHD: PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO  TẠ ĐĂNG KHOA DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Ý nghĩa TCVN ......................................................................................... Tiêu chuẩn Việt Nam SSF ......................................................... Solid State Fermentation (Lên men bán rắn) HPLC .................... High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) Rh ..............................................................................................................Rhodotorula DM ................................................................................................................Dung môi KL............................................................................................................... Khối lượng TB................................................................................................................Trung bình HSDM ................................................................................................. Hệ số dung môi HLTB ........................................................................................ Hàm lượng trung bình TN............................................................................................................... Thí nghiệm CTK....................................................................................................Canh trường khô CTƯ.................................................................................................... Canh trường ướt TG.................................................................................................................. Thời gian