Tài liệu Nghiên cứu dịch tễ học bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (infectious bronchitis – ib) ở gà nuôi tại một số tỉnh miền bắc việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -------------------------------- NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỀM (INFECTIOUS BRONCHITIS - IB) Ở GÀ NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ______________________________________________________________ NGUYỄN THỊ LOAN NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM (INFECTIOUS BRONCHITIS - IB) Ở GÀ NUÔI TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Văn Phan TS. Lê Huỳnh Thanh Phương HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Nguyễn Thị Loan i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Văn Phan và TS. Lê Huỳnh Thanh Phương, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ Tập đoàn DABACO Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến những đồng nghiệp công tác tại Công ty TNHH MTV AVAC Việt Nam, Trung tâm Chẩn đoán Thú y DABACO đã hỗ trợ và cung cấp tài liệu cũng như các nguyên liệu cần thiết để tôi thực hiện nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan ii MỤC LỤC Lời cam đoan ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii Mu ̣c lu ̣c ............................................................................................................................ iii Danh mu ̣c các ký hiê ̣u và các chữ viế t tắ t........................................................................ vi Danh mu ̣c các bảng ........................................................................................................ viii Danh mu ̣c các hiǹ h .......................................................................................................... ix Trích yếu luận án ............................................................................................................. xi Thesis abstract................................................................................................................ xiii Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................. 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu............................................................................................... 2 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 2 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu............................................................................................... 2 1.4. Những đóng góp mới của đề tài ............................................................................2 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................. 2 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..................................................................................3 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ..................................................................................3 Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 4 2.1. Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà ............................................................... 4 2.1.1. Lịch sử bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trên thế giới.......................................4 2.1.2. Tình hình bệnh và những vấn đề nghiên cứu về bệnh Viêm phế quản truyền nhiễm ở Việt Nam .................................................................................................7 2.2. Đặc tính sinh học của IBV ....................................................................................9 2.2.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại ............................................................. 9 2.2.2. Sức đề kháng, phương thức truyền lây của IBV .................................................15 2.2.3. Đặc tính nuôi cấy của IBV ..................................................................................17 2.3. Đặc điểm phân tử của virus viêm phế quản truyền nhiễm ..................................19 2.3.1. Gen Glycoprotein S ............................................................................................. 20 2.3.2. Gen Glycoprotein S1........................................................................................... 21 2.3.3. Gen Glycoprotein S2........................................................................................... 22 iii 2.3.4. Nghiên cứu dịch tễ học IBV dựa trên genotype ..................................................22 2.4. Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm .....................................................................24 2.4.1. Dịch tễ học ..........................................................................................................24 2.4.2. Phương thức truyền lây .......................................................................................24 2.4.3. Cơ chế gây bệnh ..................................................................................................25 2.4.4. Triệu chứng lâm sàng .......................................................................................... 26 2.4.5. Bệnh tích .............................................................................................................27 2.5. Vacxin phòng bệnh ............................................................................................. 32 Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................................ 34 3.1. Địa điểm nghiên cứu ........................................................................................... 34 3.2. Thời gian nghiên cứu .......................................................................................... 34 3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 34 3.3.1. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán phát hiện IBV và nghiên cứu biến đổi bệnh lý IB trên gà .......................................................................................... 34 3.3.2. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ IB ở gà ta ̣i mô ̣t số tin̉ h miền Bắc Việt Nam .....................................................................................................................34 3.3.3. Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được.....................................................................................................................34 3.3.4. Phân tích trình tự gen và xây dựng cây phả hệ ......................................................35 3.4. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 35 3.4.1. Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 1 ....................................................................35 3.4.2. Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 2 ....................................................................36 3.4.3. Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 3 ....................................................................36 3.4.4. Vật liệu nghiên cứu cho nội dung 4 ....................................................................36 3.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................37 3.5.1. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 1 ............................................................ 37 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 2 ............................................................ 40 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 3 ............................................................ 44 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu cho nội dung 4 ............................................................ 46 iv Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 49 4.1. Ứng dụng kỹ thuật rt-pcr để chẩn đoán phát hiện IBV và nghiên cứu biến đổi bệnh lý IB ......................................................................................................49 4.1.1. Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán phát hiện IBV ............................. 49 4.1.2. Kết quả nghiên cứu một số biến đổi bệnh lý IB ở gà ..........................................55 4.2. Đặc điểm dịch tễ ib ở gà tại một số tỉnh miền bắc Việt Nam ............................ 67 4.2.1. Tình hình mắc IB ở gà tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam ............................... 67 4.2.2. Xác định một số yếu tố liên quan đến bệnh IB ...................................................73 4.3. Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được.....................................................................................................................82 4.3.1. Phân lập IBV trên trứng gà sạch có phôi ............................................................ 82 4.3.2. Xác định một số đặc tính sinh học của các chủng IBV phân lập được ...............86 4.4. Phân tích trình tự gen và xây dựng cây phả hệ ...................................................91 4.4.1. Phân tích trình tự gen S1 và xây dựng cây phả hệ ..............................................91 4.4.2. Phân tích trình tự gen S của các chủng IBV phân lập được từ thực địa .............99 4.4.3. Phân tích đặc điểm của các chủng IBV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam .........107 Phần 5. Kết luận và đề nghị ....................................................................................... 114 5.1. Kết luận .............................................................................................................114 5.2. Đề nghị ..............................................................................................................114 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án ........................................ 116 Tài liê ̣u tham khảo ........................................................................................................ 117 Phụ lục .......................................................................................................................... 133 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ aa Amino acid BPL Betapropiolactone BHK-21 Baby hamster kidney-21 CAM Chorioallantois membrane cDNA Complementary deoxyribonucleic acid CEK Chicken embryo kidney CEL Chicken embryo liver CI Confidence interval CK Chicken kidney CPE Cytopathic effect E Envelop E.coli Escheriachia coli EID50 Embryo infection dose 50% ELD50 Embryo lethal dose 50% ED50 Embryo (infection or lethal) dose 50% ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay DNA Deoxyribonucleic acid HI Haemagglutination inhibition HVR Hypervariable region IB Infectious bronchitis IBV Infectious bronchitis virus IFA Indirect immunofluorescent assay kb Kilo base kDa Kilo dalton M Membrane MAb Monoclonal antibodies mRNA Messenger ribonucleic acid N Nucleocapsid nt Nucleotide vi OIE World organisation for Animal health ORF Open reading frame ORT Ornithobacterium rhinotracheale PCR Polymerase chain reaction PBS Phosphate-buffered saline RFLP Restriction fragment length polymorphism RNA Ribonucleic acid RNP Ribonucleoprotein RR Relative risk hay Risk ratio RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction S Spike sM Small membrane SPF Specific pathogen free TAE Tris-acetate-ethylendiamin tetraacetic acid TOC Tracheal organ culture UTR Untranslated region VN Virus neutralization VNT Virus neutralization test vii DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1. Thành phần của phản ứng PCR........................................................................... 39 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ..................................................................... 39 3.3. Bảng 2x2 về quan hệ yếu tố khảo sát với IB theo đàn ........................................ 43 4.1. Kết quả chẩn đoán IB bằng phương pháp RT-PCR ............................................ 54 4.2. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng chủ yếu của gà mắc IB ..................... 57 4.3. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc IB............................... 61 4.4. Sản lượng trứng của gà đẻ mắc IB ...................................................................... 62 4.5. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể của gà mắc IB ................................ 64 4.6. Tỉ lệ gà mắc IB trên địa bàn nghiên cứu ............................................................. 68 4.7. Tỷ lệ gà mắc IB theo lứa tuổi gà trên địa bàn nghiên cứu .................................. 69 4.8. Tỷ lệ gà mắc IB theo mùa trên địa bàn nghiên cứu ............................................ 71 4.9. Yếu tố nguy cơ về phương thức chăn nuôi ......................................................... 73 4.10. Yếu tố nguy cơ về quy mô chăn nuôi ................................................................. 75 4.11. Yếu tố nguy cơ về tiêm phòng vacxin IB ........................................................... 76 4.12. Yếu tố nguy cơ về nguồn gốc giống ................................................................... 78 4.13. Yếu tố nguy cơ về vị trí trang trại ....................................................................... 79 4.14. Yếu tố nguy cơ về vệ sinh chuồng trại ................................................................ 80 4.15. Thông tin về các chủng IBV phân lập được ....................................................... 85 4.16. Kết quả kiểm tra sự thích nghi của các chủng IBV trên phôi gà ........................ 86 4.17. Kết quả tổng hợp số phôi chết và số phôi nhiễm IBV ở từng nồng độ gây nhiễm .... 89 4.18. Kết quả tính EID50/ml và ELD50/ml.................................................................... 90 4.19. Các chủng IBV tham chiếu được sử dụng so sánh với chủng VNUA-HN01 ..... 94 4.20. Mức độ tương đồng về nucleotide và amino acid của chủng VNUA-HN01 so sánh với các chủng tham chiếu ........................................................................... 95 4.21. So sánh mức độ tương đồng nucleotide và amino acid của gen S của các chủng IBV phân lập ở Việt Nam và các chủng IBV tham chiếu khác ........................ 101 viii DANH MỤC CÁC HÌ NH TT Tên hình Trang 2.1. Hình ảnh IBV trên kính hiển vi điện tử ................................................................ 10 2.2. Tổ chức hệ gen của IBV với các điểm nóng đột biến, mối quan hệ với sự sửa đổi trong glycoprotein spike và nucleoprotein của virus và tầm quan trọng liên quan đến các đặc tính sinh học và miễn dịch học của IBV ........................ 12 2.3. Tổ chức bộ gen điển hình của coronavirus gia cầm ............................................. 20 2.4. Gà bị nhiễm IBV .................................................................................................. 26 2.5. Bất thường về hình dạng và kích cỡ trứng gà bị nhiễm IBV (a) .......................... 27 2.6. Khí quản tiết dịch nhầy, tắc nghẽn và tăng trương lực (a); các vùng tập trung viêm phổi nhẹ (b) ................................................................................................. 28 2.7. Thận sưng và sung huyết do IBV ......................................................................... 29 2.8. Bệnh tích đại thể ở phủ tạng của gà nhiễm IBV. (a) tích tụ lòng đỏ trứng trong xoang bụng; (b) gan sưng, nhợt nhạt và dễ vỡ; (c) xuất huyết nhiều trên bề mặt dạ dày tuyến, (d) dạ dày cơ và (e) ruột non .............................................. 30 2.9. Sự giãn nở của toàn bộ ống dẫn trứng .................................................................. 30 2.10. Bằng chứng về chất tiết niêm mạc của tế bào biểu mô (a) và sự xâm nhập của tế bào lympho trong biểu mô (b) ................................................................... 31 3.1. Thu hoạch nước xoang niệu nang sau khi phân lập IBV trên phôi gà ................. 44 4.1. Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Tóm tắt bằng đồ hoạ ......................................................... 49 4.2. Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Các trình tự tạo ra bắt cặp có ý nghĩa ............................... 50 4.3. Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của các IBV trong GenBank - Sự bắt cặp ......................................................................... 50 4.4. Kết quả kiểm tra tính bắt cặp nucleotide của cặp mồi với trình tự gen của chủng virus vacxin IB 4-91 .................................................................................. 51 4.5. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của phản ứng RT-PCR trong chẩn đoán IB .......... 52 4.6. Kết quả kiểm tra độ nhạy của phản ứng RT- PCR để chẩn đoán IB .................... 53 4.7. Kết quả chẩn đoán IB trên gà bằng phương pháp RT- PCR ................................ 54 4.8. Các triệu chứng lâm sàng của gà mắc IB ............................................................. 56 ix 4.9. Bệnh lý đại thể của gà mắc IB (A, B, C, D G, H) và hình dạng trứng gà dị dạng, vỏ lụa, lòng trắng loãng do IB (E, F, I) ...................................................... 60 4.10. Hình ảnh bệnh lý vi thể của gà mắc IB ................................................................ 67 4.11. Kết quả diện di sản phẩm RT-PCR từ các mẫu sau phân lập đời P5. M:Maker .............................................................................................................................. 83 4.12. Kết quả gây nhiễm IBV trên phôi gà .................................................................... 84 4.13. Kết quả nhân gen S1 (1.7 kb) của chủng virus ck/VN/VNUA-HN01/2014 bằng phản ứng RT-PCR ....................................................................................... 92 4.14. Kết quả phân biệt plasmid DNA mang gen S1 (làn 2, 3, và 5) và không mang gen S1 (làn 1, 4, và 6) ........................................................................................... 93 4.15. So sánh trình tự amino acid giữa chủng IBV ck/VN/VNUA-HN01/2014 với các chủng tham chiếu ........................................................................................... 96 4.16. Cây phả hệ phân tích mối tương quan giữa gen S1 của chủng IBV ck/VN/VNUA-HN01/2014 với các chủng tham chiếu ........................................ 98 4.17. Sắp xếp trình tự của các chuỗi amino acid của gen S1 (16 chủng) và gen S2 (8 chủng) ............................................................................................................ 103 4.18. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên các trình tự nucleotide của gen S1 ........... 105 4.19. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên các trình tự nucleotide của gen S2 ........... 106 4.20. Cây phả hệ phân tích mối tương quan giữa các chủng phân lập của Việt Nam và các chủng tham chiếu khác dựa trên trình tự gen S hoàn chỉnh của IBV ............................................................................................................................ 108 x TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Thị Loan Tên Luận án: Nghiên cứu dịch tễ học bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis - IB) ở gà nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số: 9.64.01.08 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được các đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các chủng IBV để làm cơ sở đề xuất các biện pháp phòng chống IB (tiêm phòng vacxin) nhằm tạo điều kiện cho chăn nuôi phát triển bền vững. - Chẩn đoán, phân lâ ̣p và khảo sát được đă ̣c tính sinh ho ̣c của IBV gây bệnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2014–2017. Phương pháp nghiên cứu Nội dung nghiên cứu gồm: Các đặc điểm dịch tễ IB và một số đặc tính sinh học của IBV gây bệnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, 2014–2017. Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu dịch tễ học như dịch tễ học mô tả, hồi cứu, thống kê sinh học. Phương pháp mổ khám gà của Thomas Carlyle Jones, phương pháp lấy mẫu theo QCVN 01-83: 2011/BNNPTNT. Phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin và nhuộm Haematoxylin – Eosin theo quy trình của Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Phương pháp phân lập virus trên phôi gà sạch 10 ngày tuổi theo quy trình của OIE (2018). Phương pháp nghiên cứu các đặc tính sinh học của IBV: gây nhiễm IBV trên trứng gà sạch SPF và xác định hiệu giá EID50/ml và ELD50/ml bằng phương pháp của Spearman and Karber. Các phương pháp sinh học phân tử được sử dụng bao gồm: phương pháp RT-PCR và giải trình tự gen. Phân tích và so sánh trình tự gen sử dụng phần mềm DNASTAR Lasergene và BioEdit 6.0. Cây phả hệ được xây dựng dựa vào thuật toán Neighbor-joining algorithms của chương trình PHYLIP suite và phần mềm MEGA 7.0. Kết quả chính và kết luận xi - IBV lưu hành thường xuyên ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam (2014 - 2017) với tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết do IB lần lượt là 14,70% và 2,45%. Gà ở giai đoạn ≤ 17 tuần tuổi mắc nhiều nhất (17,57%), tỷ lệ chết cao nhất (7,52%) và tỷ lệ gà mắc IB cao nhất vào mùa đông là 20,50%, tỷ lệ chết 4,23%. - Các yếu tố có liên quan đến bệnh IB bao gồm: phương thức chăn nuôi, quy mô chăn nuôi, tiêm chủng, nguồn gốc giống, vị trí trại và vệ sinh chuồng trại. - Cặp mồi sử dụng trong PCR phát hiện IBV đảm bảo độ nhạy và chính xác cao. - Gà mắc IB có biểu hiện lâm sàng và các biến đổi bệnh tích đặc trưng như: hô hấp khó khăn, sưng đầu, viêm kết mạc, khí quản và phổi xuất huyết, viêm đường hô hấp và sinh sản, thận sưng và lắng đọng urate..., đặc biệt là hiện tượng tích dịch trong tử cung “gà đẻ giả”. - Đã phân lập thành công 10 chủng IBV. Các chủng IBV này thích ứng cao và ổn định trên phôi gà, hiệu giá của các chủng IBV dao động từ 104,3- 107,5EID50/ml; EID50/ml dao động từ 102,3- 105,5ELD50/ml. - Kết quả phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự gen S của 3 chủng virus VNUAHN01, VNUA-TN08 và VNUA-HP11 phân lập được trong nghiên cứu này thuộc về 3 kiểu gen khác nhau là Q1-like, QX-like và TC07-2-like. Khi so sánh về trình tự nt và aa của gen S cho thấy các chủng virus IB trong nghiên cứu này có mức độ tương đồng thấp khi so sánh với các chủng virus vacxin (H120, Ma5 và 4/91) đang lưu hành trên thị trường Việt Nam. xii THESIS ABSTRACT PhD candidate: Nguyen Thi Loan Thesis title: Research on epidemiologic characteristics of infectious bronchitis in chicken in some Northern provinces of Vietnam. Major: Veterinary Epidemiology Code: 9.64.01.08 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives - Identifying epidemiological characteristics as well as distribution of IBV strains as the basis for proposing measures to prevent IB (vaccination) to facilitate sustainable development of livestock. - Diagnose, isolate and survey biological characteristics of IBV that caused disease in chicken in some Northern provinces of Vietnam during the 2014–2017 period. Materials and Methods Research contents include: epidemiological characteristics of IB and some biological characteristics of IBV strains isolated in some Northern provinces of Vietnam during the period from 2014 to 2017. Methods used in the present study include: epidemiological methods such as descriptive epidemiology, retrospective study, and biological statistics. - Chicken nescropsy was performed according to Thomas Carlyle Jones’s method and sampling method was based on TCVN 01-83: 2011/BNNPTNT. - Method of making microscopic specimens impregnated with paraffin and Haematoxylin - Eosin staining was done according to the protocol developed by Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Vietnam National University of Agriculture. - Isolation method of IBV on 10-day-olds pathogen-free embryonated chicken eggs was done according to the protocol of OIE (2018). - Methods for studying of biological characteristics of IBV: IBV was inoculated into 10-day-olds pathogen-free embryonated chicken eggs, and EID50/ml and ELD50/ml of IBV were titrated according to the method of Spearman and Karber. xiii - Molecular methods used in the study including RT-PCR and gene sequencing. Genetic analysis and comparison were conducted using DNASTAR Lasergene and BioEdit 6.0 software. Phylogenetic tree were constructed basing on the Neighbor-joining algorithms of the PHYLIP suite and the MEGA 7.0 software. Main findings and conclusions - IBVs have been circulating regularly in some Northern provinces of Vietnam (2014 - 2017) with the morbidity and mortality rates of 14.70% and 2.45%, respectively. Chickens in the period of ≤17 weeks of age were the most susceptible age to the IB with morbidity and mortality rates of 17.57% and 7.52%, respectively. Winter was the most severe season with morbidity and mortality rates of 20.50 and 4.23%, respectively. - Factors related to IB including breeding mode, scale of breeding, vaccination, breeder origin, farm location and sanitation. - Primers were used in PCR method has been applied successfully for IBV detection, giving sensitive and accurate results. - The chicken disease caused by IBV has typical symptoms and lesions such as dyspnea, facial swelling, conjunctivitis, tracheal and pulmonary hemorrhage, inflammed respiratory and reproductive tracts, kidney swelling and deposits of urate…, especially the phenomenon of stagnant fluid in the uterus "false layer". - 10 IBV strains have been isolated successfully. IBVs have high adaptability and stability on chicken embryos. EID50 and ELD50/ml of isolated IB viruses ranged from 104.3107.5EID50/ml and from 102.3- 105.5ELD50/ml, respectively. - Genetic and phylogenetic analysis based on the S gene of IBV showed that 3 IBV strains of VNUA-HN01, VNUA-TN08 and VNUA-HP11 isolated in the present study belonged to three different genotypes Q1-like, QX-like and TC07-2-like. The results of nucleotide and amino acid comparison based on S gene showed that the present Vietnamese IBV strains had a low degree of similarity with vaccine strains (H120, Ma5 and 4/91) available in Vietnam. xiv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Thịt gia cầm là một nguồn protein ngày càng có vai trò quan trọng trong cuộc sống hàng ngày. Trên thế giới, sản lượng thịt gia cầm tăng 16% kể từ năm 1995. Ở các nước đang phát triển, mức tăng có thể đến 77% (Anon, 2006). Theo số liệu của Tổng cục Thống kê và giá thực tế, ngành chăn nuôi Việt Nam đang có sản lượng thịt gia cầm đứng thứ 2 khu vực ASEAN trong đó gà chiếm chủ yếu. Tuy ngành công nghiệp chăn nuôi gà đang ngày càng phát triển nhưng vẫn còn gặp không ít khó khăn nhất là vấn đề dịch bệnh trong đó phải kể đến bệnh viêm phế quản truyền nhiễm ở gà (IB - Infectious Bronchitis). IB là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, lây lan nhanh và gây thiệt hại kinh tế nặng nề, không những vậy do tính chất phức tạp của mầm bệnh, virus gây bệnh có nhiều serotype, dễ biến đổi nên bệnh rất khó kiểm soát. Những vụ dịch vẫn xảy ra thường là kết quả của sự lây nhiễm với các chủng khác về serotype so với các chủng vacxin (Wang et al., 1996). Vacxin sống đã được phát triển để chống lại một số serotype mới của IBV (Bande et al., 2015). Tuy nhiên, do ngày càng có nhiều biến chủng IBV mới xuất hiện khiến cho việc khống chế bệnh vẫn còn là một vấn đề nan giải. Vì vậy việc điều tra dịch tễ học IB, nghiên cứu và tìm ra những serotype IBV phổ biến lưu hành trong mỗi khu vực là rất quan trọng trong công tác kiểm soát bệnh. Tuy nhiên từ trước tới nay, câu hỏi về đặc điểm dịch tễ học IB, các serotype IBV lưu hành ra sao ở Việt Nam vẫn còn chưa có câu trả lời cụ thể và thỏa đáng. Để có thêm thông tin về các chủng IBV đang lưu hành, sự phân bố của IB ở Việt Nam, đặc biệt là ở các tỉnh phía Bắc nơi các đàn gà tập trung chủ yếu (chiếm tới 75% đàn gà cả nước), nghiên cứu các đă ̣c tính sinh ho ̣c cũng như sinh học phân tử của mầ m bê ̣nh, tìm ra các yếu tố nguy cơ liên quan đến dịch IB nhằm kiểm soát bệnh, nâng cao hiệu quả chăn nuôi, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài này. Đề tài nghiên cứu nhằm giải đáp một số câu hỏi về các vấn đề gồm: - Đặc điểm dịch tễ, sự phân bố IBV trên đàn gà tại mô ̣t số tỉnh miền Bắc Việt Nam; - Đặc điểm bệnh lý IB và các yếu tố nguy cơ liên quan; - Đặc tính sinh học và sinh học phân tử của những chủng IBV hiện đang lưu hành trên khu vực nghiên cứu. 1 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định được các đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các chủng IBV để làm cơ sở đề xuất các biện pháp phòng chống IB (tiêm phòng vacxin) nhằm tạo điều kiện cho chăn nuôi phát triển bền vững. - Chẩn đoán, phân lâ ̣p và khảo sát được đă ̣c tính sinh ho ̣c của IBV gây bệnh tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2014–2017. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu - Các đàn gà nuôi tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam; - Các chủng IBV phân lập được từ các đàn gà mắc IB. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ IB ở gà tại 5 tỉnh thành miền Bắc Việt Nam gồm: Bắc Ninh, Hà Nội, Hải Phòng, Hưng Yên, Thái Nguyên giai đoạn 2014– 2017. - Nghiên cứu một số yếu tố nguy cơ lây lan dịch trên địa bàn nghiên cứu trong thời gian từ 2014–2017. - Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý IB ở gà trên địa bàn nghiên cứu; đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng IBV lưu hành trên địa bàn nghiên cứu trong khoảng thời gian từ 2014–2015. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Khảo sát dịch bệnh IB tại 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam trên cơ sở xác định lâm sàng, giám định bệnh lý và phân tử, khẳng định IBV thường xuyên lưu hành và có tỷ lệ mắc và chết đáng quan tâm trong đàn gà nuôi hướng trứng. - Đã phân lập được 10 chủng IBV, xác định được đầy đủ các đặc tính sinh học, virus học của 3 chủng cường độc là VNUA-HN01, VNUA-TN08 và VNUAHP11. Xác định 3 chủng này thuộc 3 nhóm di truyền là Q1-like, QX-like và TC072-like, có quan hệ gần gũi nguồn gốc và dịch tễ học với Trung Quốc. - Khẳng định dịch bệnh IB vẫn xảy ra ở đàn có vacxin nếu không có kháng nguyên tương đồng giữa chủng vacxin và chủng cường độc lưu hành. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Luận án đã phân tích, đánh giá và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học mô tả của bệnh IB tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam: tỷ lệ lưu hành bệnh, đặc điểm lưu hành bệnh theo độ tuổi gà và theo mùa vụ. Xác định được một số yếu tố có liên quan đến sự lưu hành bệnh IB trên gà. - Xác định được 10 chủng IBV lưu hành trên địa bàn nghiên cứu; khi phân tích, đánh giá chuyên sâu về mặt di truyền cho thấy 3 chủng IBV phân lập được thuộc 3 kiểu di truyền khác nhau, các chủng này đều có mức tương đồng thấp với các chủng vacxin IB hiện đang lưu hành trên thị trường. - Luận án là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho những nghiên cứu khoa học tiếp theo về IB, IBV và là tư liệu tham khảo cho giảng dạy trong chuyên ngành thú y. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Khẳng định dịch bệnh IB vẫn xảy ra ở đàn có vacxin nếu không có kháng nguyên tương đồng giữa chủng vacxin và chủng cường độc lưu hành. - Phân lập thành công 10 chủng IBV và khảo sát đặc tính virus học qua nuôi cấy trên phôi gà 10 ngày tuổi, trong đó có chủng có thể phát triển thành chủng vacxin ứng dụng trong thực tế. - Kết quả của luận án là cơ sở khoa học cần thiết và sát với thực tế để người chăn nuôi, cũng như các nhà quản lý hiểu rõ hơn và đề ra các giải pháp phòng, chống IB hiệu quả hơn. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. BỆNH VIÊM PHẾ QUẢN TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ IB là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gà do virus thuộc nhóm Coronavirus gây ra, dễ lây lan qua tiếp xúc với những triệu chứng đặc trưng ở đường hô hấp như: ho, hắt hơi và có tiếng ran khí quản. Ngoài ra, bệnh có thể gây ảnh hưởng đến thận, gây viêm thận cấp hoặc mạn tính, gây chảy nước mũi ở gà con và gây ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng và chất lượng trứng ở đàn gà đẻ (Cavanagh and Gelb, 2008). Hậu quả kinh tế IB để lại đối với ngành công nghiệp gia cầm rất lớn: + Đối với gà nuôi hướng thịt: gà thịt gầy do chuyển đổi thức ăn kém và giảm tỷ lệ tăng trưởng (King and Cavanagh, 1991) gây thiệt hại kinh tế lớn. + Ảnh hưởng tới gà nuôi lấy trứng thương phẩm hoặc sản xuất con giống: bên cạnh việc gây nhiễm trùng đường hô hấp, IB có thể ảnh hưởng đến sản lượng trứng (Cavanagh et al., 1998). Broadffoot et al. (1956) đã tìm ra bằng chứng chứng minh sự phá hủy vĩnh viễn ở ống dẫn trứng của gà dưới 2 tuần tuổi bị nhiễm IBV, những gà này đến giai đoạn đẻ sẽ không đẻ được hoặc gây giảm sản lượng trứng. Ngoài việc giảm sản lượng trứng, chất lượng trứng cũng bị giảm mạnh ở những đàn gà nhiễm bệnh do đó ảnh hưởng đến tỷ lệ nở (Cavanagh and Naqi, 2003). Mặc dù áp dụng các vacxin IB sống và vô hoạt nhưng bệnh vẫn tiếp tục xảy ra. Để kiểm soát bệnh hiệu quả cần hiểu sâu rộng về đặc điểm gây bệnh, đặc tính sinh học cũng như sinh học phân tử của các chủng IBV đang lưu hành trong khu vực, các nhân tố ảnh hưởng đến sự lây lan bệnh… 2.1.1. Lịch sử bệnh viêm phế quản truyền nhiễm trên thế giới IB được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1930 ở Dakota, nước Mỹ. Báo cáo đầu tiên về triệu chứng lâm sàng IB là của Schalk and Hawn (1931). Đến năm 1936, Beach and Schalm (1936) đã phát hiện ra virus căn nguyên, xác định bệnh lý học của virus. Năm 1937, Beaudette and Hudson lần đầu tiên nuôi cấy virus trên phôi gà. Lúc đầu, IB được coi như một bệnh chủ yếu ở gà con. Tuy nhiên, sau này nó lại được biết đến như một bệnh phổ biến trên đàn gà hậu bị và gà đẻ. Một biểu hiện khác của bệnh IB bao gồm mất khả năng đẻ trứng của đàn gà và có các triệu chứng điển hình của bệnh hô hấp cũng đã được ghi nhận những năm 1940; virus gây tổn thương ở thận được ghi nhận vào những năm 1960. Đứng trước sự lưu hành và những ảnh hưởng 4